In vivo מודל השפעת בדיקה של היפוקסיה על גרורות של גידולים

יואינג סרקומה (ES) היא גידול ממאיר אגרסיווי המשפיע על ילדים ובני נוער. ¹ הגידולים מתפתחים רקמות ועצמות רכות, בדרך כלל בגפיים. בעוד בנוכחות הגרורה הוא גורם מנבא שהלילי החזק ביותר יחיד לחולי ES, המנגנונים שבבסיס ההתפתחות שלהם עדיין אינם ברורים. היפוקסיה גידול ² הוא אחד הבודדים גורמים מעורבים התקדמות ES. בחולי ES, בנוכחות באזורים שאינם perfused בתוך רקמת הגידול קשורה לפרוגנוזה גרועה. ³ במבחנה, היפוקסיה מגביר הפולשנות של תאי גזע עובריים ומפעיל הביטוי של גנים פרו-גרורתי. ^4-6 עם זאת, על אף דבריו אלה של ראיות, אין הוכחה ישירה להתקדמות ES-induced היפוקסיה והתפשטות קיימת. יתר על כן, את המנגנונים שבאמצעותם היפוקסיה מחולל השפעות כאלה הן, לפי שעה, לא ידועים. לפיכך, יצרנו מודל in vivo כדי למלא את הפער בין הקיים בנתונים במבחנה obser קלינייםvations. מערכת מודל זה מאפשרת בדיקה ישירה של השפעות היפוקסיה על גידולים המתרחשים בסביבתם הטבעית, באמצעות תהודה מגנטית (MRI) כדי לעקוב אחר התקדמות גידול וגרור in vivo בשילוב עם ניתוחים פתולוגיים ומולקולריים vivo לשעבר (איור 1).

מאז אין מודל מהונדס הוקם של ES זמין כעת, מחקרי in vivo על תכונות גרורתי של גידולים אלה מסתמכים על זריקות של תאים אנושיים לעכברים בעלי דיכוי חיסוני. בעוד השימוש בבעלי חיים לקויים אימונולוגית שעלול להמעיט בהערכת ההשפעה של המערכת החיסונית על התקדמות המחלה, את היכולת להשתמש בתאים אנושיים מגבירה translatability של מחקרים כאלה. בין דגמי xenograft שונים, זריקות מערכתיות לתוך וריד זנב הם הקלים ביותר לביצוע, ובכל זאת היא להשמיט את השלבים הראשוניים של intravasation תאים הסרטני ולברוח מן האתר הראשי של צמיחה. ^7-12 מצד שני, orthoto pic xenografting, אשר כרוך זריקות של תאים סרטניים לתוך העצמות (עצם הירך, צלע) או שרירי, הוא יותר מאתגר מבחינה טכנית, אלא גם יותר ביולוגית רלוונטי סרטן אנושיים. עם זאת ^13-16, בעבר, את התחלואה הגבוהה הקשורים צמיחה מהירה של גידולים ראשוניים יש חייבתה לעתים קרובות המתת חסד של בעלי חיים לפני ההתפתחות גרורה. במחקר זה, אנחנו עובדים מודל הוקם בעבר של זריקות תא לתוך שריר הסובך ואחריו כריתה של הגידול הראשוני שהתקבל בשילוב עם ניטור אורך של התקדמות גרורתי ידי MRI. ^17,18 זריקות כאלה לתוך שריר סובך בסמיכות השוקה לאפשר את צמיחת גידול בשתי סביבות ES טבעיות - שרירים ועצמות - ולגרום גרורות מרוחקות למקומות בדרך כלל מושפעים בבני אדם. ¹⁸ ובכך, המודל הזה במדויק משחזר את התהליכים המתרחשים גרורתי בחולים ES במהלך התקדמות המחלה.

בנוסף ניטור אורך של שפעת היפוקסיה על חביון ES ואת התדירות של גרורות, מודל זה מאפשר גם לאיסוף רקמות לבין ההתפתחות של שורות תאים חדשות משני גידולים וגרורים עיקריים. חשוב לציין, הוקמה עבודה קודמת כי שורות תאים שמקורם גרורות להפגין פוטנציאל גרורתי משופר על השבה לבעלי חיים, המציין כי הפצת גידול קשורה שינויים של קבע פנוטיפ התאים הסרטני, ובכך אימות השימוש של שורות תאים אלה להתחקות אחר התהליכים גרורתי. ¹⁸ קולקטיבי, המודלים האלה ניתן להשתמש כעת עבור ניתוחים גנטיים ומולקולריים הנדרש לזיהוי מסלולים גרורתי הנגרמת היפוקסיה.

כפי היפוקסיה הוא גורם פרו-גרורתי שיפור הממאיר של t השונהumors, המודל שלנו יכול לשמש כפלטפורמה לחקור את התפקיד של היפוקסיה ב סוגי גידולים אחרים המתפתחים באופן טבעי בגפיים, כגון אוסטאוסרקומה ו ראדומיוסרקומה. יתר על כן ^21-23, גישה דומה ניתן להחיל על ממאירויות גדל במקומות אנטומיים אחרים עם מסלול מוגדר היטב של אספקת דם. בסופו של דבר, המודל יכול להיות משונה השירות שלה להאריך עוד יותר, בהתאם לצרכי מחקר בודדים.

כל ההליכים אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים אוניברסיטת ג'ורג'טאון ועדת שימוש.

1. תא הכנה עבור זריקות Orthotopic

1. לתאי גזע עובריים אנושיים תרבות בתנאים סטנדרטיים. השתמש כ צלחת תרבית תאים אחת 15 ס"מ לא יעלה על 70% confluency להזרקה 5 עכברים.
   הערה: במחקר זה, תאי SK-ES1 היו בתרבית הבינונית 5A של מקוי עם 15% עוברי שור סרום (FBS) על צלחות מצופות קולגן ותאי TC71 היו בתרבית RPMI עם 10% FBS ו -1% 4- (2-hydroxyethyl ) -1-piperazineethanesulfonic חומצה (HEPES). שניהם התקשורת נוספו עם אנטיביוטיקה - פניצילין (100 יחידות / מ"ל), סטרפטומיצין (100 מיקרוגרם / מ"ל) ו fungizone (1 מיקרוגרם / מ"ל).
2. שוטפים את התאים ES עם בופר פוספט (PBS) ו trypsinize בנקודת המפגש 70% עם חומצה 0.25% טריפסין / ethylenediaminetetraacetic (EDTA) במשך 5 דקות.
3. הסרת תאי ES מהצלחת עם Medi תרבית תאיםa, ואז צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 200 XG בטמפרטורת החדר. Re- להשעות את בתאי גזע עובריים ב 10 מ"ל של קר PBS ולאחר מכן לספור את מספר התאים.
4. צנטריפוגה ES התאים למשך 5 דקות ב 200 XG בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן מחדש להשעות ב 2 x 10 ⁷ (SK-ES1) או 10 ⁷ (TC71) תאים לכל מ"ל בקור PBS. שמור את השעית התא הסופית על קרח בעת ביצוע זריקות.

2. הזרקת orthotopic של בתאי גזע עובריים לתוך הגסטרוקנמיוס שרירים

1. השתמש 4-6 בשבוע עכברים ישנים נקבת SCID / בז '.
2. כדי להזריק תאי גזע עובריים, בעדינות להחזיק את העכבר ולייצב רגל שמאל שלו בין האצבעות הרביעית והחמישית, חושף את הצד המדיאלי של hindlimb נמוך.
3. באמצעות מחט 28 G ½, להזריק 0.1 מ"ל של ההשעיה תא שהוכן קודם לכן שמכילה 2 x 10 ⁶ (SK-ES1) או 10 ⁶ (TC71) בתאי גזע עובריים לתוך שריר הסובך (איור 2 א).
   הערה: למרות ומקסימלית עבור inj שריריתections הוא בדרך כלל 0.05 מ"ל, עבור פרוצדורה מסוימת זה מהגידול הכמותי 0.1 מ"ל נחוץ בשל את מספר הסלולרי גבוה מוזרק. הליך זה אושרה על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים אוניברסיטת ג'ורג'טאון ועדת שימוש.
   1. הכנס את המחט לתוך שריר הסובך anteriorly בכ 30 - בזווית של 45 מעלות לכיוון הרכס / גַבשֶׁשֶׁת השוקה.
   2. מעט לשלוף את המחט פעם הוא בא במגע עם ציצה / גַבשֶׁשֶׁת השוקה. לאט לאט להזריק את הפתרון ההשעיה התא, משיכת המחט בהדרגה לשחרר לחץ.
4. לפקח על העכברים שהוזרקו מעל 24 השעות הבאות עבור סימני מצוקה.
   הערה: חוקרת עם פחות ניסיון בטיפול בבעלי חיים צריכה לשקול הרדמת עכברי זריקות תאים סרטניים. מוסדות מסוימים עשויים לדרוש הרדמה מטעמי בטיחות.

3. מעקב גדילת גידול ראשונית

1. לפקח על הצמיחה של גידולים ראשוניים דaily עד גודל הגידול מגיע בנפח הרצוי.
   הערה: במחקר הנוכחי, נפח עגל של 250 מ"מ ³ שימש כנקודת המוצא של הניסוי (איור 2 ב). בדרך כלל, זה לוקח בערך 1 - 2 שבועות עבור גידולים להגיע לגודל הזה.
   1. מדוד את גודל העגל יומי עם מחוגה דיגיטלית באמצעות אורכי המדיאלי-לרוחב קדמי, אחורי שלה.
   2. לקבוע את עוצמת הקול עגל על ידי הנוסחא (D XD ^2/6) x 3.14, כאשר D היא בקוטר הארוך d הוא קוטר הקצר מבין hindlimb התחתון נושאות הגידול.
      הערה: הגודל של עגל מבוגר עכבר רגיל הוא של כ 40 - 50 מ"מ ^3. נפח יגדל בשל צמיחת גידול בשלבים מאוחר העגל יורכב בעיקר של רקמת גידול.

4. ירך עורק קשירה (FAL) גרימת היפוקסיה הגידול נושא Hindlimb

1. מכינים את כלי הניתוח הדרוש לפעולה זו: נוכved או הצביעו מלקחיים בסדר, הצביעו מלקחיים, מספרי כירורגיים בעל מחט. לעקר כלים אלה לפני הניתוח באמצעות חיטוי או מעקר חם חרוז. בנוסף, יש צמר גפן בסדר מוכן לניתוח הזה.
   הערה: מומלץ כי הכלים מחדש מעוקרים בקצות לפי הצורך במהלך ההליך.
2. להזריק סוכן כאבים (Carprofen 5 מ"ג / ק"ג) תת עורי (SQ). כדי לזהות ולאשר היפוקסיה, להזריק hypoxyprobe-1 (pimonidazole, 60 מ"ג / ק"ג).
   הערה: מנה זו משווה ל 1.5 מ"ג לכל העכבר מושגת על ידי הזרקת 0.1 מ"ל של 15 מ"ג / מ"ל ​​פתרון hypoxyprobe ב PBS intraperitoneally (IP). Hypoxyprobe אז לאחר המוות לגילוי ברקמות בעלי חיים על ידי אימונוהיסטוכימיה.
3. מניחים את העכבר בתא אינדוקציה הרדמה המכיל 3 - isoflurane 5% ב 100% חמצן בקצב זרימה של 1 ליטר / דקה.
4. השאירו את העכבר בתא אינדוקציה עד שהוא מגיב לגירויים חיצוניים. ואז להסיר את החיה מן iתא nduction. מניח את החיה במצב שכיבה על וילון סטרילי להציב על גבי כרית חימום על פני שטח ההפעלה. השתמש חרטומו לחבר אותו זרימה רציפה של 1 - 3% isoflurane ב 100% חמצן בקצב זרימה של 0.8 ליטר / דקה.
   1. החל הלא תרופתי סטרילי משחת עיניים לכל עין כדי למנוע התייבשות קרנית. כדי את השער באזור הניתוח יש למרוח קרם להסרת שיער, והשאיר אותו על העור במשך לא יותר מ -10 שניות. ואז לנגב את הקרם להסרת שיער באמצעות כרית הכנת אתנול.
5. רחב ולאבטח את hindlimb עם חתיכת הסרט כ 45 מעלות מן קו האמצע של העכבר. לאחר hindlimb מאובטח, ולנגב את העור חשוף עם 10% povidone / יוד ספוגית / פתרון, ואחריו אתנול, חוזר עוד פעמיים כל אחד. במשך שארית של ההליך הכירורגי, השתמש במיקרוסקופ סטריאו להשיג תצוגה מוגדלת של האזור hindlimb.
6. בעזרת מלקחיים מחודדים מספרי כירורגיות, עושה חתך של skב, כ ארוך 1 ס"מ, מאמצע הירך כלפי האזור מפשעתי. באמצעות צמר גפן בסדר לחלח מלוחים, בעדינות לסלק רקמת השומן התת עורית סביב שריר הירך.
7. בזהירות לחשוף את עורק הירך הבסיסי באמצעות דיסקציה קהה דרך רקמת שומן תת עורי. ייצב את פצע כירורגית שדה לחשוף את כלי הדם של שריר adductor האמצע עליון.
8. בעזרת מלקחיים בסדר, בעדינות פירס דרך נדן הירך קרומי לחשוף את צרור העצבים וכלי הדם. באמצעות סט נקי של מלקחיים בסדר, לנתח ולהפריד את עורק הירך מן הווריד עצב הירך במיקום הפרוקסימלי ליד המפשעה, דיסטלי רצועה מפשעתי. היזהר, כדי למנוע פירסינג קיר וריד הירך.
9. בעקבות לנתיחה, לעבור קווצת תפר משי 6-0 מתחת העורק דיסטלי הירך לסניף של עורק הירך גג לרוחב (LCFA). לחסום את עורק הירך באמצעות קשרים כפולים (איור 3). סגירת החתך באמצעות תפרים 6-0 פוליפרופילן. לאחר סגירת החתך, להזריק SQ 0.5 מ"ל של תמיסת מלח חם לטיפול מאזן הנוזלים. מניח את החיה על גבי כרית חמה עטופה בכלוב ההתאוששות ולפקח באופן רציף עד ער.
10. לפקח על בעלי החיים במהלך 6 שעות לאחר הניתוח ולהזריק סוכן הכאבים (Carprofen 5 מ"ג / קילו, SQ) כל יום במשך 3 ימים. סר תפרים 10 ימים לאחר ניתוח באמצעות מספריים סטרילית.

5. כריתת גידול ראשונית ידי רגל קטיעה

הערה: לקטוע את hindlimb התחתון נושאות הגידול כשגודל עגל מגיע 250 מ"מ ³ עבור קבוצת הביקורת או 3 ימים לאחר FAL עבור הקבוצה היפוקסי.

1. לגלח את השיער מן איבר נושאות הגידול מן השוקה דיסטלי לאזור האגן עם קוצץ שיער תוך החזקת החיה בעדינות. להזריק את סוכן כאבים (Carprofen 5 מ"ג / ק"ג, SQ) לפני ההליך.
2. מניחים את העכבר לתוך ch אינדוקציה הרדמהענבר המכיל 3 - 5% isoflurane ב 100% חמצן בקצב זרימה של 1 ליטר / דקה. השאירו את העכבר בתא אינדוקציה עד שהוא מגיב לגירויים חיצוניים. ואז להסיר את החיה מן תא אינדוקציה.
3. מניח את החיה במצב שכיבה לרוחב ממש על וילון סטרילי מונח על כרית חימום על פני שטח ההפעלה. השתמש חרטומו לחבר אותו זרימה רציפה של isoflurane 1 - 3% ב 100% חמצן בקצב זרימה של 0.8 ליטר / דקה. החל הלא תרופתי סטרילי משחת עיניים לכל עין כדי למנוע התייבשות קרנית
4. מכינים את האתר כירורגית באמצעות 10% povidone / יוד ספוגית / פתרון, ואחריו אתנול, חוזר 3 פעמים. למרוח גזה סטרילי (למשל, לעטוף כירורגית) על העכבר כדי לקבל שדה כירורגי סטרילי.
5. לעשות חתך בעור היקפי ירך באמצע, ואחריו לנתיחה בוטה הכחשה של העור proximally. לחשוף את pedicle העצב וכלי דם הירך המדיאלי בצד החציוני של הרגל, ולאחר מכן ולקשורליד הרצועה מפשעתי באמצעות 4-0 ומצופה (polyglactin 910) חומר תפר נספג.
6. בצע חיתוך רוחב אמצע הירך של קבוצות שרירים במספריים, ואחריו לנתיחה בוטה של ​​רקמות רכות למפרק coxofemoral. באמצעות חותך העצם, לבצע osteotomy אמצע הירך. באמצעות ספוגית כותנה קנס סטרילית או ספוג הג'לטין נספגים, לחץ בעדינות על האתר osteotomy לצמצום ומניעת דימום.
7. סגור את העור שמעליה באמצעות קליפים פצע כירורגית להזריק 0.5 מיליליטר של SQ מלח החם לטיפול מאזן נוזלים. מניח את החיה על גבי כרית חמה עטופה בכלוב ההתאוששות ולפקח באופן רציף עד ער.
8. לאחר הניתוח, לאסוף דגימות רקמה גידולים ראשוניים עבור RNA, DNA או בידוד חלבון, הצמד להקפיא בחנקן נוזלי חנות ב -80 C. עבור תרבית תאים ראשונית, לאסוף דגימות רקמה בשלב זה, כמפורט בסעיף 9 להלן. לתקן את רקמת האיבר שנותר 10% פורמלין ניטראלי שנאגר עבור היסטולוגיה immunochemisלנסות, כולל זיהוי hypoxyprobe-1.
9. צג החיות לתנועה, הכאב וצריכת מזון במהלך 6 השעות הראשונות לאחר הניתוח, ולאחר מכן בכל יום במשך 3 ימים. להזריק את סוכן כאבים (Carprofen 5 מ"ג / ק"ג, SQ) כל יום במשך 3 ימים. הסר את קליפים פצע 10 ימים לאחר קטיעה באמצעות מסיר קליפ פצע.

6. עכברי ניטור עבור הנוכחות של גרורות

1. הקפד על עכברים יומי ולהעריך אותם סימנים קליניים של גרורות לפחות פעמיים בשבוע.
   1. שים לב החיות לנוכחות macrometastases הצגה כמו המונים המתפתחים במקומות שונים, בדרך כלל בכתפיים, ברגליים נגדיות ולסתות. לשם כך, בזהירות למשש הראש, הצוואר ואזורים בבית השחי, ואת hindlimb הנגדי. בדוק גרורות איברים פנימיים באמצעות נפיחות בטנית יחד עם סריקת MRI.
   2. לבדוק את קיומו של גרורות סרטניות בריאות על ידי לחיצה על תהליך xyphoid (החלק התחתון של עצם החזה) עם אינסוףx אצבע. ²⁴
      הערה: לחץ זה מקטין את יכולת הנשימה סרעפתי. עכברים עם גרורות ריאות מתקדמות להראות סימני מצוקה נשימתית המתבטאת נשימה מאומצת.
   3. שים לב החיות עבור סימפטומים נוירולוגיים, כגון שיתוק ברגלו אטקסיה מצביע גרור למערכת העצבים המרכזית.
   4. צג העכברים לפחות פעם בשבוע לצורך ההרזיה, כאינדיקציה להתקדמות מחלה פוטנציאלית. גוף הרזיה תעלה על 15% מהמשקל מראש פרוצדורליים נחשבת קצה אנושי.

7. הדמיית תהודה מגנטית (MRI) עבור גרורות זיהוי

1. בצע MRI לגילוי גרור בנקודות זמן רצויות. ¹⁸
   הערה: במסגרת המחקר הנוכחי, ספקטרומטר אופקי 7-טסלה היה בשימוש. MRI בוצע ימים 15 ו -35-קטיעה פוסט עבור תאי SK-ES1 ובאותו יום 15 עבור TC71 תאים.
2. מניחים את העכבר לתוך chambe אינדוקציה הרדמהr המכיל 1 - 3% isoflurane בתערובת גז חמצן 30% ו -70% תחמוצת החנקן.
3. השאירו את העכבר בתא אינדוקציה עד שהוא מגיב לגירויים חיצוניים. ואז להסיר את החיה מן תא אינדוקציה.
4. מעביר את העכבר הרדים על בעל stereotaxic עם נשימה והטמפרטורה monitorization עם ממשל רציף של isoflurane 1.5% ו -30% תחמוצת חנקן. החל הלא תרופתי סטרילי משחת עיניים לכל עין כדי למנוע יובש קרני. תמונה החיה בין בהליך מ"מ 40 או 23 סליל העכבר נפח Bruker הדמיה הגוף או המוח כולו, בהתאמה.
5. השתמש רצף נדיר דו מימדי, T2-weighted: TR = 3,000 msec, TE = 24 msec, מטריקס = 256, FOV = 4.35 x 3.0 ס"מ, עובי פרוסה = 0.5 מ"מ, גורם נדיר = 4 וממוצעים = 4. ¹⁸
6. מניח את החיה בכלוב התאוששות חמה ולפקח באופן רציף עד ער.
   הערה: העכברים יתאוששו במהירות מאז מטוס של הרדמה רדוד משמש. לפקח על בעלי החיים במהלך הדמיה 6 השעות לאחר הראשונות לוודא כי אין תופעות לוואי של ההרדמה.

8. המתת חסד Necropsy

1. להרדים את העכברים פעם החיות הנוכחיות עם גרורות לזיהוי באמצעות MRI ו / או תסמינים קליניים של התקדמות מחלה.
   הערה: במסגרת המחקר הנוכחי, העכברים הוקרבו על ימים 50 ו -25 שלאחר קטיעה חיות נושאות SK-ES1 ו xenografts TC71, בהתאמה. במקרים מסוימים, המתת חסד קודם לכן היה הכרחי בשל נטל גרורות גבוהה.
2. להרדים את העכברים על ידי חשיפת CO ₂ ב 1.5 L / min (CO ₂ ב 10 - 30% של דקות המתת חסד קאמרי כרך /). כדי להבטיח מוות חי, לבצע נקע בצוואר רחם לאחר חשיפת ₂ CO.
3. תרסיס העכבר כולו עם אתנול 70% ולמקם אותו לתוך מכסה המנוע זרימה למינרית. אסוף את הדם על ידי לנקב לב באמצעות מחט 25 G ½ עם מזרק 1 מ"ל ולהעביר איסוף דם tuלהיות המכיל 2 מ"ג של EDTA.
4. אסוף את הרקמות הבאות: טחול, בלוטת יותרת כליה, שחלות, כליות, כבד, ריאות, מוח, רגל ימין, מח העצם humeri ושדרתי, כמו גם גרור מקרוסקופיות נוכחית במקומות אחרים. ^25,26
5. תקן חצי של כל רקמות 10% פורמלין נייטרלי שנאגרו עבור היסטולוגיה immunochemistry, כולל זיהוי hypoxyprobe-1. הצמד להקפיא את החצי השני בחנקן נוזלי, ולאחר מכן לאחסן ב -80 צלזיוס למשך RNA, DNA או בידוד חלבון. ^25,26 עבור תרבית תאים ראשוניים, לאסוף דגימות רקמה כמפורט בסעיף 9 להלן.

9. תרבית תאים ראשונית

1. כדי לבצע תרבית תאים ראשונית, לנתח רקמות מן האיבר הכרות (סעיף 5 לעיל) או במהלך necropsy (סעיף 8 לעיל) בתנאים סטריליים במנדף זרימה למינרית.
2. כן מתאים תקשורת תרבית תאים עבור הקו הסלולרי משמש זריקות orthotopic, השלם עם פניצילין (200 יחידות / מיליליטר),סטרפטומיצין (200 מיקרוגרם / מ"ל), fungizone (1 מיקרוגרם / מ"ל), ו אנטיביוטי מניעתי 0.2% mycoplasma. מניחים 2.5 מ"ל של המדיום התרבות העיקרי לתוך צלחת תרבית תאים 6 ס"מ.
3. בחר באזורי רקמת גידול קיימא מגידולים או גרורות ראשיים ולאחר מכן לבודד שני לשלושה מיגזרי ב 2-3 מ"מ כל באמצעות מספריים סטרילית.
   הערה: רקמת גידול בת קיימא נמצאת בדרך כלל על הקצוות של הגידול והוא יכול להיות מופלים מן נימק לפי צבע ורדרד או אדמדם, שופע משמעותית ומראה רטוב הכולל. לעומת זאת, רקמות נימקים נתפסו בדרך כלל במרכז של הגידול ומציגה כגוש צבע לבנבן / שמנת עם מראה חסר חיים, גביני. ²⁷
4. מעביר את הפלחים המבודדים לצלחת תרבית תאי 6 סנטימטר המכילה בינוני התרבות העיקרי שמתואר בשלב 9.2.
5. תרבות תאים בתנאים סטנדרטיים, כמתואר בסעיף 1 (הערה) ו -9.2. ^18,28 בדוק את תרבות תולדת הסלולר הנובעים פיסות הרקמה, WHich יש לשים לב תוך מספר ימים. לאחר התאים מגיעים למפגש, trypsinize ולהרבות אותם בהתאם לטכניקות תרבית תאים סטנדרטיים.
   הערה: תרבית התא הראשונית ניתן לאחר מכן נעשתה שימוש כדי להעריך צמיחה ומאפיינים גרורתי של התאים שמקורם מלאים גידולי חוסר חמצן, כמו גם התכונות המולקולריות שלהם, כפי שתואר לעיל. ¹⁸

בעקבות הזרקה של בתאי גזע עובריים לתוך שריר הסובך, הגידולים העיקריים הם מותר לגדול לגודל עגל של 250 מ"מ 3 (איור 1, 2). את הזמן הדרוש עבור גידולים להגיע בכרך זה בדרך כלל נע בין 10 - 15 ימים עבור TC71 20-25 ימים xenografts SK-ES1, בהתאמה. גידולים בווליום עגל של התערוכה 250 מ"מ 3 רמה נמוכה יחסית של היפוקסיה אנדוגני (כ 3% של רקמת הגידול), מבוסס על hypoxybrobe-1 (pimonidazole) מכתים (איור 4 א, ג). חשוב לציין, בגידולים בקרה אלה, המכתים החיובי עבור hypoxyprobe-1 נצפה אך ורק בתחומי היפוקסיה פיסיולוגי, כלומר, תאים סרטניים, כי הם רחוקים מן הכולים הדם ולהתחיל לעבור מוות של תאים (איור 4 א). מכתמים מפגינים דפוס "אוויר-מברשת" אופייני, בעוד חלק הארי של רקמת גידול בריאה נותר שלילי עבור hypoxyprobe-1. <sup> 6 לעומת זאת, FAL בצע בשלב זה יוצר היפוקסיה עמוקה, כפי שמעיד המכתים החיובי עבור hypoxyprobe-1 שנצפה הרוב המכריע של התאים הסרטניים על 4 שעות שלאחר FAL (האיור 4B). יש לציין, כי hypoxyprobe-1-חיוב התאים סרטניים הם נצפו גם בסמיכות כלי דם ואת הדפוס האופייני של היפוקסיה פיסיולוגי הולך לאיבוד. בגידולי FAL שטופל אלה, 73% של רקמות מורכבות של תאים סרטניים היפוקסי (איור 4C). רקמת הגידול גם מפגין סימנים ראשונים של נזק היפוקסיה המושרה, כולל התכווצות התא מבנה רופף (איור 4B).

האפקטיבי של FAL נתמך עוד יותר על ידי העיכוב המלא של גידול ראשוני. בתקופה של 3 ימים בין FAL וקטיעות, בגודל של גידולים ראשוניים לא להגדיל (איור 5 א). לעומת זאת, גידולים ראשוניים מעכברים נתונים דמה surgery המשיך לגדול בקצב מהיר והגיע בהיקף של כ 650 מ"מ 3, ובכך מחק את קצב הצמיחה של גידולים בעכברים שליטים לא נתונים ניתוח (איור 5 א). 18 בקנה אחד עם נתונים אלה, ניתוח histopathological חשף שטחים נרחבים של נמק ב גידולים ראשוניים שטופלו FAL שנקטפו 3 ימים לאחר הניתוח (איור 5). אף על פי כן, היו קבוצות של תאים סרטניים קיימא נוכחית בתוך רקמת הגידול, בדרך כלל ממוקמות בקצוות של הגידול, קרוב כלי הדם (איור 5). כדי לחקור את מצב החמצון של תאים אלה השתמשנו hypoxyprobes, אשר מופעלים בתאים היפוקסי חיים, ובהמשך מוסיף את היכולת לרתק קוולנטית חלבונים בתוך תאים אלה. 29 ככזה, בדיקות אלה לשמש כסמן הקבע של תאים אשר חוו היפוקסיה בכל נקודת זמן. לכן, כדי לזהות שינויים ברמות החמצן של התאים הסרטניים בכל המשך הזמן של experimאף אוזן גרון, השתמשנו בשני hypoxyprobes שונה שיכול להתגלות באופן עצמאי על ידי אימונוהיסטוכימיה. הבדיקות נוהלו בשתי נקודות זמן - מיד לפני FAL (hypoxyprobe-1) ולפני קטיעה (hypoxyprobe-2, CCI-103F) - ולוקליזציה שלהם זוהה בגידולים שנקטפו 3 ימים לאחר FAL (איור 1). Hypoxyprobe-1, אשר היה קיים במערכת בעת FAL, סמן רוב תאי הגידול, כמו הרקמה הפך היפוקסי קשה (איור 5 ג). תיוג זה ניכר גם בתחומים של נמק / אפופטוזיס, מאז תאים אלה היו עדיין בחיים בזמן של FAL ולכן מסוגל מחייב לצמיתות hypoxyprobe-1, כפי שמוצג באיור 4B. לעומת זאת, hypoxyprobe-2 מנוהל 2 ימים שלאחר FAL מוכתם רק תאים קיימא, כמו התאים באזורים נמקי כבר היו מתים ולא מסוגל להפעיל את החללית בזמן הממשל שלה (איור 5D). מעניין, אנחנו גם obseסמוך rved רקמת הגידול מעשית בכלי הדם שבתחילה הוצע היפוקסי (hypoxyprobe-1-חיובי), אבל מחומצן כראוי בנקודת זמן מה לאחר מכן (hypoxyprobe-2-שלילי) (איור 5 ג, ד). ממצא זה עולה בקנה אחד עם דיווחים קודמים המצביעים על כך reperfusion רקמות כולים תלויים בטחונות משחזר את זרימת דם בתוך hindlimb 3 ימים לאחר FAL. 20 תאים סרטניים קיימא שנותרו רקמת הגידול 3 ימים לאחר FAL היו מאוד פולשני, כפי שמעידים intravasation מסיבי שלהם בקצוות vascularized של הגידול (איור 5E). חלק מן התאים בתוך לומן הכלי נמצא חיוביות hypoxyprobe-1, המעיד על כך שהם הפכו היפוקסי על FAL, עדיין נשאר קיימא. ביחד, נתונים אלה מראים כי reperfusion הרקמות הבאים היפוקסיה חמורות עשויים להקל על בריחתו של תאים מן הגידולים הראשוניים.

בהתבסס על ניסוי הטייס, גרורות נפוצות היולזיהוי באמצעות MRI כ -35 ימים לאחר קטיעה עבור xenografts SK-ES1, בעוד תאי TC71 גרורים בדרך כלל תוך 15 ימים. כתוצאה מכך, עבור ניתוח השוואתי של חביון גרור ותדיר, MRI בוצע ביום 15 ו -35-קטיעה פוסט על חיות מחמד נושאות גידולי SK-ES1, תוך הדמיה אחד בכל היום 15 הייתה מספיק עבור עכברים עם גידולי TC71. המתת חסד בוצעה ביום 50 ויום 25 עבור החיות עם SK-ES1 ו xenografts TC71, בהתאמה. כפי שדווח בעבר, הסוגים הנפוצים ביותר של גרורות כלולי המוני רקמות רכות באזור כתף, כמו גם גרור בעצמות לרגליים נגדיות, אזור לסתי ועמוד שדרה עבור תאי SK-ES1, ריאות וגידולי אגן עבור TC71. 18 בנוסף, גרורות תכופות לאיברים פנימיים, לרבות בלוטת יותרת כליה, ריאות וכבדות, כמו גם חדירת מח עצם, נצפו בעכברי נושאים xenografts FAL שטופל SK-ES1 (איור 6). באופן כללי, היפוקסיה גדל באופן משמעותיאת (SK-ES1) או אתר ספציפי (TC71) התדירות והריבוי גרור הכולל שורות התאים שניהם. עם זאת, xenografts TC71 גם פיתח ההמונים חוזרים תכופים באתר של קטיעה (25% לבקרה 40% עבור גידולים שטופלו FAL), כפי שתואר לעיל עבור גידולים ראשוניים TC71 גדול. 18

הרקמות מן מלא גידולים ראשוניים FAL שטופל וגרורות יכולות גם להיות מקור של חומר עבור ניתוחים מולקולריים מקיפים שנועדו לזיהוי המסלולים מופעל היפוקסיה מעורב בהפצת ES. לדוגמא, צפינו הבדלים משמעותיים פרופילי metabolomic שליטת גידולים ראשוניים היפוקסי (מידע לא מוצג). היינו גם יכולים לבודד שורות תאים מרובים בהצלחה מכל הרקמות לעיל. במקרים רבים, התאים שמקורם בגידולים שטופלו FAL מתגלים שינויים מורגשים במורפולוגיה, לעומת התאים המקוריים לבין אלה נגזרות משליטתה tuMors (איור 7 א). טוהר בתרביות תאים אלה אושרה על ידי immunostaining חיובית עבור הסמן סרקומה ע"ש יואינג, CD99 (איור 7). יתר על כן, 100% של תאי שורות תאים הוקמו היו איתות חיוב קרינת כלאה באתרו (FISH) עם בדיקות centromeric אדם, לעתים קרובות עם הצגת מספרי כרומוזום מוגבר (איור 8 א). מקורו האדם של תאים אלה אושרה עוד יותר על ידי ניתוח של הכרומוזומים metaphase (איור 8B) אשר הציג rearrangements ציטוגנטית שתואר לעיל עבור תאים SK-ES1 בשני הקו הסלולרי המקורי בתאים שמקורם בגידולים שטופלו FAL (איור 8B). 30

איור 1. מתווה דגם היפוקסיה ES. בתאי גזע עובריים (1 - 2 x 10 6) הוזרקו gastrocnשרירי emius של SCID / עכברים בזים '. לאחר גידולים ראשוניים וכתוצאה מכך הגיע נפח עגל של 250 מ"מ 3, העכברים חולקו לשתי קבוצות הניסוי. עכברים מקבוצת הביקורת הוזרקו hypoxyprobe-1 (HP-1), ואת הגידולים הראשוניים הוסתרו על ידי קטיעת גפה. עכברים מקבוצת היפוקסי הוזרקו hypoxyprobe-1 ולאחר מכן נתון קשירת עורק הירך (FAL). יומיים לאחר מכן העכברים הוזרקו hypoxyprobe-2 (HP-2), ולאחר מכן הגפיים נושאות הגידול נקטעו שלושה ימים שלאחר FAL. בעלי חיים משני הקבוצות נוטרו באמצעות תהודה מגנטית תקופתית (MRI). לאחר גרורות התבררו מבוססות על הדמיה וסימנים קליניים, העכברים היו מורדמים ואת הנוכחות של גרורות אושרה על ידי necropsy וניתוחי histopathological. השעה של גידול, הדמית המתת חסד מבוססת על שער תא SK-ES1 של צמיחה גרורה. שימו לב כי בזמן hypoxyprobe-2 היה צורך להקים את שיטת VisuAlize שינויים ברמות היפוקסיה בתקופה שבין FAL וקטיעות גפיים, השימוש בו אינו חיוני עבור ניסויים בפועל. לכן, הצעד הזה אינו כלול בפרוטוקול. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2. צמיחת גידול ראשונית. תמונת תהודה א מגנטית (MRI) של hindlimb ללא פגע. החץ האדום מציין את האתר ואת הכיוון של הזריקה orthotopic תאים סרטניים. ב גידול ראשוני בווליום עגל של כ 250 מ"מ 3 גוברת שריר הסובך (מתאר אדום). ראשי חץ אדומים עולים אתרים של הרס עצם. T - שוקה. אנא גללקק כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3. האתר של קשירת עורק הירך. Arteriogram רנטגן לאחר המוות נציג עכבר 129S1 / SvJ perfused עם סולפט בריום מיד לאחר קשירת מוצג כדי להדגיש את נוכחותו של כלי בטחונות קיימים. שים לב כי בזמן מופיע בתמונה שתי קשירה (XS), דיסטלי אחד עורק ירך הגג לרוחב (LCFA) (X האדום) ועוד הפרוקסימלי אל עורק העי (X הלבן), מודל היפוקסיה גידול משתמש רק קשירת הפרוקסימלי, ליד הרצועה מפשעתי ו דיסטלי LCFA (X האדום). האזור של פיתוח כלי בטחונות מוצג כפי שתואר (כלי קלוש), והם מזוהים על ידי הצורה והמפותלת, פקק-הבורג שלהם. אנא לחץ הואמחדש כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

גידול איור 4. היפוקסיה המושרה על ידי קשירת עורק הירך (FAL). א גידול שליטה בווליום עגל של 250 מ"מ 3 יוכתמו hematoxylin & eosin (H & E) immunostained עבור hypoxyprobe-1 (חום). immunostaining Hypoxyprobe-1 הוא ציין אך ורק בתחומי היפוקסיה גידול פיסיולוגי, שבו התאים הסרטניים הרחוקים כלי דם ללא חמצן ולהתחיל לעבור מוות של תאים. ב FAL שטופל גידול ראשוני בגודל דומה שנקטף 4 שעות שלאחר קשירת מוכתם H & E immunostained עבור hypoxyprobe-1. רוב תאי הגידול הם חיוביים מאוד עבור hypoxyprobe-1, כולל אלה בסמיכות בכלי הדם. V - כלי דם. ג האזור של מכתים חיובי עבור hypoxyprobe-1 היה quantifמטען בגידולים מלאי FAL שטופל באמצעות תוכנת ImageJ. ברי שגיאה מייצגים SEM. *** - P <0.001 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

אפקט איור 5. של קשירת עורק הירך (FAL) על צמיחה הגידול הראשוני. א צמיחת גידול ראשוני במהלך התקופה של 3 ימים בין ניתוח הקטיעה ב FAL- (n = 4) ו דמה שטופל ניתוח (n = 4) חיות, לעומת גידולים מלאים תקינים (n = 6). ברי שגיאה מייצגים SD. *** - P <0.001, לעומת שני גידולים מלאי דמה שטופל בניתוח. ב Hematoxylin ו eosin (H & E) מכתים של גידול FAL שטופלו שנקטפו 3 ימים לאחר קשירת מגלה נמק נרחב בתוך הגידול. המתווה האדומה עולה על שטח של ce גידול הקיימאLLS בסמיכות לאזור vascularized מאוד perfused 3 ימים לאחר FAL. ג FAL שטופל רקמת גידול שנקטפה 3 ימים לאחר הניתוח immunostained עבור hypoxyprobe-1. Hypoxyprobe-1 הוזרק לפני FAL. לכן, immunostaining החיובי מצביע על קיומו של היפוקסיה רקמות נרחבת מייד לאחר הניתוח. ד Hypoxyprobe-2 הוזרק 2 ימים שלאחר FAL, ואת 24h שנאספו רקמות לאחר מכן, קטיעה. מכתים hypoxyprobe-2 חיובי מזהה היפוקסיה רקמות בעת קטיעה. החץ האדום מצביע על הרקמה היא חוסר חמצן בשתי נקודות הזמן בעוד החץ הצהוב מצביע לאזור סמוך כלי הדם כי היה חוסר חמצן מיד לאחר FAL (hypoxyprobe-1-חיובי), אבל שלילי עבור hypoxyprobe-2 בזמן כריתה, אשר הוא מעיד על reperfusion רקמות. חוסר מכתים hypoxyprobe-2 באזורים נמקי עולה כי התאים באזור זה לא היו קיימא בזמן הממשל שלה ולכןמסוגלים להיקשר החללית פעילה. המכתים המוצג לוחות BD בוצע על סעיפי רקמות סדרתי. א intravasation ב FAL שטופלו גידול 3 ימים לאחר FAL. Immunostaining מזהה תאי קיימא חיוביים עבור hypoxyprobe-1 בתוך לומן הכלי (חץ אדום). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

דוגמאות איור 6. של גרורות בעכברי נושאים שטופלו FAL גידולי SK-ES1. הגרורות אותרו באמצעות תהודה מגנטית (MRI) ואושרו על ידי necropsy וניתוחים histopathological (מכתים hematoxylin & eosin, H & E). M - גרורות. אנא לחץ כאן כדי להציג vers גדול יון של נתון זה.

איור 7. מאפיינים בתאים שמקורם בגידולים ראשוניים שטופל FAL. בתרביות תאי א Viable הוקמו מרקמות שנקטפו מן מלא גידולים ראשוניים היפוקסי והמורפולוגיה שלהם הושוותה שורות התאים המקוריות המשמשות זריקות orthotopic ראשוניות. התאים שמקורם בגידולים ראשוניים שטופל FAL להפגין שינויים דרמטיים בגדלי המורפולוגיה שלהם. נציג תמונות של תאי SK-ES1 המקוריים וראשוניים נגזר גידול מוצגות. נציג תמונות B. של בתאים שמקורם בגידולים שטופלו FAL immunostained עבור סמן ES, CD99, ו counterstained עם צבע-DNA מחייבת, DAPI. כל התאים הם CD99 חיובי, כולל תאי היפרטרופית המכיל גרעינים מוגדלים (חץ לבן). oad / 54,532 / 54532fig7large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 8. כרומוזומלית ניתוח של בתאים שמקורם בגידולים שטופלו FAL. א קרינת הכלאה באתרו (FISH) ניתוח בתאי שלבים מראים שני גרעינים עם אותות עבור חללית centromeric 4 האנושי. הגרעין הגדול עם ארבעה אותות מצביע על תא tetraploid (4n) (חץ לבן). ניתוח FISH .ב metaphases נציג של הקו הסלולרי המקורי SK-ES1 ושל התא נגזר גידול ראשוני שטופל FAL. החיצים האדומים מציינים inv (1) (p13.1q21), מאפיין התארגנות ציטוגנטית הלא אקראית של תאי SK-ES1. אותות אדומים: centromeric אדם 4 בדיקה; אותות ירוקים בתאי SK-ES1 המקוריים: בדיקת NPY5R על 4q32.2 כרומוזום.e.com/files/ftp_upload/54532/54532fig8large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

למחברים אין מה לחשוף.