הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

In vivo מודל השפעת בדיקה של היפוקסיה על גרורות של גידולים

12.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54532

⸱

9 בדצמבר 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular & Cellular Biology, Georgetown University Medical Center, 2Department of Nursing, Georgetown University, School of Nursing and Health Studies, 3Department of Human Science, Georgetown University, School of Nursing and Health Studies, 4School of Medicine, Georgetown University Medical Center, 5Department of Pathology and Neuropathology, Medical University of Gdańsk, 6Department of Oncology, Georgetown University Medical Center, 7Department of Pathology, Georgetown University Medical Center

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

כתב יד זה מתאר פיתוח של מודל בבעלי חיים המאפשר בדיקה ישירה של השפעות היפוקסיה של הגידול על גרורות ופענוח מנגנוני פעולתה. למרות שהניסויים המתוארים כאן מתמקדים בסרקומה של יואינג, ניתן ליישם גישה דומה על סוגי גידולים אחרים.

תקציר

היפוקסיה הייתה מעורבת בגרורות של סרקומה יואינג (ES) על ידי תצפיות קליניות ונתוני מבחנה, אך חסרות ראיות ישירות להשפעה הפרו-גרורתית שלה והמנגנונים המדויקים של פעולתה אינם ברורים. כאן, אנו מדווחים על מודל בעלי חיים המאפשר בדיקה ישירה של ההשפעות של היפוקסיה של הגידול על התפשטות ES וחקירה של המסלולים הבסיסיים המעורבים. גישה זו משלבת שתי אסטרטגיות ניסיוניות מבוססות, השתלה אורתוטופית של תאי ES וקשירת עורק הירך (FAL), הגורמת לאיסכמיה בגפיים האחוריות. תאי ES אנושיים הוזרקו לשרירי הגסטרוקנמיוס של עכברי SCID/בז' והגידולים הראשוניים הורשו לגדול לגודל של 250 מ"מ3. בשלב זה הגידולים נכרתו (קבוצת ביקורת) או שבעלי החיים עברו FAL ליצירת היפוקסיה של הגידול, ולאחר מכן כריתת הגידול 3 ימים לאחר מכן. היעילות של FAL אושרה על ידי עלייה משמעותית בקישור של hypoxyprobe-1 ברקמת הגידול, נמק גידול חמור ועיכוב מוחלט של צמיחת הגידול הראשוני. חשוב לציין, למרות ההשפעות הישירות הללו של איסכמיה, נצפתה התפשטות מוגברת של תאי גידול מהגידולים ההיפוקסיים. אסטרטגיה ניסויית זו מאפשרת ניתוח השוואתי של התכונות הגרורתית של גידולים ראשוניים באותו גודל, אך רמות שונות משמעותית של היפוקסיה. זה גם מספק פלטפורמה חדשה להערכה נוספת של הבסיס המכניסטי לשינויים הנגרמים על ידי היפוקסיה המתרחשים במהלך התקדמות גידול גרורתי in vivo. בנוסף, בעוד שמודל זה הוקם באמצעות תאי ES, אנו צופים שניתן להשתמש באסטרטגיה ניסיונית זו כדי לבחון את השפעת ההיפוקסיה בסרקומות אחרות, כמו גם בגידולים המושתלים אורתוטופית באתרים עם נתיב אספקת דם מוגדר היטב.

מבוא

יואינג סרקומה (ES) היא גידול ממאיר אגרסיווי המשפיע על ילדים ובני נוער. 1 הגידולים מתפתחים רקמות ועצמות רכות, בדרך כלל בגפיים. בעוד בנוכחות הגרורה הוא גורם מנבא שהלילי החזק ביותר יחיד לחולי ES, המנגנונים שבבסיס ההתפתחות שלהם עדיין אינם ברורים. היפוקסיה גידול 2 הוא אחד הבודדים גורמים מעורבים התקדמות ES. בחולי ES, בנוכחות באזורים שאינם perfused בתוך רקמת הגידול קשורה לפרוגנוזה גרועה. 3 במבחנה, היפוקסיה מגביר הפולשנות של תאי גזע עובריים ומפעיל הביטוי של גנים פרו-גרורתי. 4-6 עם זאת, על אף דבריו אלה של ראיות, אין הוכחה ישירה להתקדמות ES-induced היפוקסיה והתפשטות קיימת. יתר על כן, את המנגנונים שבאמצעותם היפוקסיה מחולל השפעות כאלה הן, לפי שעה, לא ידועים. לפיכך, יצרנו מודל in vivo כדי למלא את הפער בין הקיים בנתונים במבחנה obser קלינייםvations. מערכת מודל זה מאפשרת בדיקה ישירה של השפעות היפוקסיה על גידולים המתרחשים בסביבתם הטבעית, באמצעות תהודה מגנטית (MRI) כדי לעקוב אחר התקדמות גידול וגרור in vivo בשילוב עם ניתוחים פתולוגיים ומולקולריים vivo לשעבר (איור 1).

מאז אין מודל מהונדס הוקם של ES זמין כעת, מחקרי in vivo על תכונות גרורתי של גידולים אלה מסתמכים על זריקות של תאים אנושיים לעכברים בעלי דיכוי חיסוני. בעוד השימוש בבעלי חיים לקויים אימונולוגית שעלול להמעיט בהערכת ההשפעה של המערכת החיסונית על התקדמות המחלה, את היכולת להשתמש בתאים אנושיים מגבירה translatability של מחקרים כאלה. בין דגמי xenograft שונים, זריקות מערכתיות לתוך וריד זנב הם הקלים ביותר לביצוע, ובכל זאת היא להשמיט את השלבים הראשוניים של intravasation תאים הסרטני ולברוח מן האתר הראשי של צמיחה. 7-12 מצד שני, orthoto pic xenografting, אשר כרוך זריקות של תאים סרטניים לתוך העצמות (עצם הירך, צלע) או שרירי, הוא יותר מאתגר מבחינה טכנית, אלא גם יותר ביולוגית רלוונטי סרטן אנושיים. עם זאת 13-16, בעבר, את התחלואה הגבוהה הקשורים צמיחה מהירה של גידולים ראשוניים יש חייבתה לעתים קרובות המתת חסד של בעלי חיים לפני ההתפתחות גרורה. במחקר זה, אנחנו עובדים מודל הוקם בעבר של זריקות תא לתוך שריר הסובך ואחריו כריתה של הגידול הראשוני שהתקבל בשילוב עם ניטור אורך של התקדמות גרורתי ידי MRI. 17,18 זריקות כאלה לתוך שריר סובך בסמיכות השוקה לאפשר את צמיחת גידול בשתי סביבות ES טבעיות - שרירים ועצמות - ולגרום גרורות מרוחקות למקומות בדרך כלל מושפעים בבני אדם. 18 ובכך, המודל הזה במדויק משחזר את התהליכים המתרחשים גרורתי בחולים ES במהלך התקדמות המחלה.

אוהל "> הלוקליזציה של גידולים ראשוניים של hindlimb הנמוך גם מקלה על השליטה המדויקת של אספקת הדם אל רקמת הגידול. קשירת עורק ירך (FAL) היא טכניקה מבוססת היטב מנוצלת במחקר אנגיוגנזה לחסום את זרימת דם לאזורים הדיסטלי של הרגל ולחקור כלי דם ברקמה בתגובה איסכמיה. 19,20 חשוב לציין כי הירידה הראשונית בזרימת דם ואחריו reperfusion פתיחה ורקמות כלי בטחונות נצפו כ 3 ימים לאחר FAL. 20 לפיכך, כאשר היא מבוצעת באיבר נושאות גידולים, מודל זה יוצר מחדש אירועים היפוקסיה / reperfusion הנמצא באופן טבעי גידולים שמתפתחים מהר ומאפשר הבריחה של תאים סרטניים עם גרורות עקב שיקום של זלוף אל hindlimb הנמוך באמצעות כלים בטחונות חדשות שנפתחו. 21 חשוב לציין, חייבת להתבצע בהליך זה כאשר גודל הגידול קטן מספיק כדי למנוע היפוקסיה מוגזם בגידולים מלאים (בדרך כלל בחלק כרך עגל נושאות גידוליםume של 150 - 250 מ"מ 3), הבטחת הבדלים משמעותיים ברמות של היפוקסיה גידול בין מלא קבוצות שטופלו FAL.

בנוסף ניטור אורך של שפעת היפוקסיה על חביון ES ואת התדירות של גרורות, מודל זה מאפשר גם לאיסוף רקמות לבין ההתפתחות של שורות תאים חדשות משני גידולים וגרורים עיקריים. חשוב לציין, הוקמה עבודה קודמת כי שורות תאים שמקורם גרורות להפגין פוטנציאל גרורתי משופר על השבה לבעלי חיים, המציין כי הפצת גידול קשורה שינויים של קבע פנוטיפ התאים הסרטני, ובכך אימות השימוש של שורות תאים אלה להתחקות אחר התהליכים גרורתי. 18 קולקטיבי, המודלים האלה ניתן להשתמש כעת עבור ניתוחים גנטיים ומולקולריים הנדרש לזיהוי מסלולים גרורתי הנגרמת היפוקסיה.

כפי היפוקסיה הוא גורם פרו-גרורתי שיפור הממאיר של t השונהumors, המודל שלנו יכול לשמש כפלטפורמה לחקור את התפקיד של היפוקסיה ב סוגי גידולים אחרים המתפתחים באופן טבעי בגפיים, כגון אוסטאוסרקומה ו ראדומיוסרקומה. יתר על כן 21-23, גישה דומה ניתן להחיל על ממאירויות גדל במקומות אנטומיים אחרים עם מסלול מוגדר היטב של אספקת דם. בסופו של דבר, המודל יכול להיות משונה השירות שלה להאריך עוד יותר, בהתאם לצרכי מחקר בודדים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים אוניברסיטת ג'ורג'טאון ועדת שימוש.

1. תא הכנה עבור זריקות Orthotopic

  1. לתאי גזע עובריים אנושיים תרבות בתנאים סטנדרטיים. השתמש כ צלחת תרבית תאים אחת 15 ס"מ לא יעלה על 70% confluency להזרקה 5 עכברים.
    הערה: במחקר זה, תאי SK-ES1 היו בתרבית הבינונית 5A של מקוי עם 15% עוברי שור סרום (FBS) על צלחות מצופות קולגן ותאי TC71 היו בתרבית RPMI עם 10% FBS ו -1% 4- (2-hydroxyethyl ) -1-piperazineethanesulfonic חומצה (HEPES). שניהם התקשורת נוספו עם אנטיביוטיקה - פניצילין (100 יחידות / מ"ל), סטרפטומיצין (100 מיקרוגרם / מ"ל) ו fungizone (1 מיקרוגרם / מ"ל).
  2. שוטפים את התאים ES עם בופר פוספט (PBS) ו trypsinize בנקודת המפגש 70% עם חומצה 0.25% טריפסין / ethylenediaminetetraacetic (EDTA) במשך 5 דקות.
  3. הסרת תאי ES מהצלחת עם Medi תרבית תאיםa, ואז צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 200 XG בטמפרטורת החדר. Re- להשעות את בתאי גזע עובריים ב 10 מ"ל של קר PBS ולאחר מכן לספור את מספר התאים.
  4. צנטריפוגה ES התאים למשך 5 דקות ב 200 XG בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן מחדש להשעות ב 2 x 10 7 (SK-ES1) או 10 7 (TC71) תאים לכל מ"ל בקור PBS. שמור את השעית התא הסופית על קרח בעת ביצוע זריקות.

2. הזרקת orthotopic של בתאי גזע עובריים לתוך הגסטרוקנמיוס שרירים

  1. השתמש 4-6 בשבוע עכברים ישנים נקבת SCID / בז '.
  2. כדי להזריק תאי גזע עובריים, בעדינות להחזיק את העכבר ולייצב רגל שמאל שלו בין האצבעות הרביעית והחמישית, חושף את הצד המדיאלי של hindlimb נמוך.
  3. באמצעות מחט 28 G ½, להזריק 0.1 מ"ל של ההשעיה תא שהוכן קודם לכן שמכילה 2 x 10 6 (SK-ES1) או 10 6 (TC71) בתאי גזע עובריים לתוך שריר הסובך (איור 2 א).
    הערה: למרות ומקסימלית עבור inj שריריתections הוא בדרך כלל 0.05 מ"ל, עבור פרוצדורה מסוימת זה מהגידול הכמותי 0.1 מ"ל נחוץ בשל את מספר הסלולרי גבוה מוזרק. הליך זה אושרה על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים אוניברסיטת ג'ורג'טאון ועדת שימוש.
    1. הכנס את המחט לתוך שריר הסובך anteriorly בכ 30 - בזווית של 45 מעלות לכיוון הרכס / גַבשֶׁשֶׁת השוקה.
    2. מעט לשלוף את המחט פעם הוא בא במגע עם ציצה / גַבשֶׁשֶׁת השוקה. לאט לאט להזריק את הפתרון ההשעיה התא, משיכת המחט בהדרגה לשחרר לחץ.
  4. לפקח על העכברים שהוזרקו מעל 24 השעות הבאות עבור סימני מצוקה.
    הערה: חוקרת עם פחות ניסיון בטיפול בבעלי חיים צריכה לשקול הרדמת עכברי זריקות תאים סרטניים. מוסדות מסוימים עשויים לדרוש הרדמה מטעמי בטיחות.

3. מעקב גדילת גידול ראשונית

  1. לפקח על הצמיחה של גידולים ראשוניים דaily עד גודל הגידול מגיע בנפח הרצוי.
    הערה: במחקר הנוכחי, נפח עגל של 250 מ"מ 3 שימש כנקודת המוצא של הניסוי (איור 2 ב). בדרך כלל, זה לוקח בערך 1 - 2 שבועות עבור גידולים להגיע לגודל הזה.
    1. מדוד את גודל העגל יומי עם מחוגה דיגיטלית באמצעות אורכי המדיאלי-לרוחב קדמי, אחורי שלה.
    2. לקבוע את עוצמת הקול עגל על ידי הנוסחא (D XD 2/6) x 3.14, כאשר D היא בקוטר הארוך d הוא קוטר הקצר מבין hindlimb התחתון נושאות הגידול.
      הערה: הגודל של עגל מבוגר עכבר רגיל הוא של כ 40 - 50 מ"מ 3. נפח יגדל בשל צמיחת גידול בשלבים מאוחר העגל יורכב בעיקר של רקמת גידול.

4. ירך עורק קשירה (FAL) גרימת היפוקסיה הגידול נושא Hindlimb

  1. מכינים את כלי הניתוח הדרוש לפעולה זו: נוכved או הצביעו מלקחיים בסדר, הצביעו מלקחיים, מספרי כירורגיים בעל מחט. לעקר כלים אלה לפני הניתוח באמצעות חיטוי או מעקר חם חרוז. בנוסף, יש צמר גפן בסדר מוכן לניתוח הזה.
    הערה: מומלץ כי הכלים מחדש מעוקרים בקצות לפי הצורך במהלך ההליך.
  2. להזריק סוכן כאבים (Carprofen 5 מ"ג / ק"ג) תת עורי (SQ). כדי לזהות ולאשר היפוקסיה, להזריק hypoxyprobe-1 (pimonidazole, 60 מ"ג / ק"ג).
    הערה: מנה זו משווה ל 1.5 מ"ג לכל העכבר מושגת על ידי הזרקת 0.1 מ"ל של 15 מ"ג / מ"ל ​​פתרון hypoxyprobe ב PBS intraperitoneally (IP). Hypoxyprobe אז לאחר המוות לגילוי ברקמות בעלי חיים על ידי אימונוהיסטוכימיה.
  3. מניחים את העכבר בתא אינדוקציה הרדמה המכיל 3 - isoflurane 5% ב 100% חמצן בקצב זרימה של 1 ליטר / דקה.
  4. השאירו את העכבר בתא אינדוקציה עד שהוא מגיב לגירויים חיצוניים. ואז להסיר את החיה מן iתא nduction. מניח את החיה במצב שכיבה על וילון סטרילי להציב על גבי כרית חימום על פני שטח ההפעלה. השתמש חרטומו לחבר אותו זרימה רציפה של 1 - 3% isoflurane ב 100% חמצן בקצב זרימה של 0.8 ליטר / דקה.
    1. החל הלא תרופתי סטרילי משחת עיניים לכל עין כדי למנוע התייבשות קרנית. כדי את השער באזור הניתוח יש למרוח קרם להסרת שיער, והשאיר אותו על העור במשך לא יותר מ -10 שניות. ואז לנגב את הקרם להסרת שיער באמצעות כרית הכנת אתנול.
  5. רחב ולאבטח את hindlimb עם חתיכת הסרט כ 45 מעלות מן קו האמצע של העכבר. לאחר hindlimb מאובטח, ולנגב את העור חשוף עם 10% povidone / יוד ספוגית / פתרון, ואחריו אתנול, חוזר עוד פעמיים כל אחד. במשך שארית של ההליך הכירורגי, השתמש במיקרוסקופ סטריאו להשיג תצוגה מוגדלת של האזור hindlimb.
  6. בעזרת מלקחיים מחודדים מספרי כירורגיות, עושה חתך של skב, כ ארוך 1 ס"מ, מאמצע הירך כלפי האזור מפשעתי. באמצעות צמר גפן בסדר לחלח מלוחים, בעדינות לסלק רקמת השומן התת עורית סביב שריר הירך.
  7. בזהירות לחשוף את עורק הירך הבסיסי באמצעות דיסקציה קהה דרך רקמת שומן תת עורי. ייצב את פצע כירורגית שדה לחשוף את כלי הדם של שריר adductor האמצע עליון.
  8. בעזרת מלקחיים בסדר, בעדינות פירס דרך נדן הירך קרומי לחשוף את צרור העצבים וכלי הדם. באמצעות סט נקי של מלקחיים בסדר, לנתח ולהפריד את עורק הירך מן הווריד עצב הירך במיקום הפרוקסימלי ליד המפשעה, דיסטלי רצועה מפשעתי. היזהר, כדי למנוע פירסינג קיר וריד הירך.
  9. בעקבות לנתיחה, לעבור קווצת תפר משי 6-0 מתחת העורק דיסטלי הירך לסניף של עורק הירך גג לרוחב (LCFA). לחסום את עורק הירך באמצעות קשרים כפולים (איור 3).
  10. סגירת החתך באמצעות תפרים 6-0 פוליפרופילן. לאחר סגירת החתך, להזריק SQ 0.5 מ"ל של תמיסת מלח חם לטיפול מאזן הנוזלים. מניח את החיה על גבי כרית חמה עטופה בכלוב ההתאוששות ולפקח באופן רציף עד ער.
  11. לפקח על בעלי החיים במהלך 6 שעות לאחר הניתוח ולהזריק סוכן הכאבים (Carprofen 5 מ"ג / קילו, SQ) כל יום במשך 3 ימים. סר תפרים 10 ימים לאחר ניתוח באמצעות מספריים סטרילית.

5. כריתת גידול ראשונית ידי רגל קטיעה

הערה: לקטוע את hindlimb התחתון נושאות הגידול כשגודל עגל מגיע 250 מ"מ 3 עבור קבוצת הביקורת או 3 ימים לאחר FAL עבור הקבוצה היפוקסי.

  1. לגלח את השיער מן איבר נושאות הגידול מן השוקה דיסטלי לאזור האגן עם קוצץ שיער תוך החזקת החיה בעדינות. להזריק את סוכן כאבים (Carprofen 5 מ"ג / ק"ג, SQ) לפני ההליך.
  2. מניחים את העכבר לתוך ch אינדוקציה הרדמהענבר המכיל 3 - 5% isoflurane ב 100% חמצן בקצב זרימה של 1 ליטר / דקה. השאירו את העכבר בתא אינדוקציה עד שהוא מגיב לגירויים חיצוניים. ואז להסיר את החיה מן תא אינדוקציה.
  3. מניח את החיה במצב שכיבה לרוחב ממש על וילון סטרילי מונח על כרית חימום על פני שטח ההפעלה. השתמש חרטומו לחבר אותו זרימה רציפה של isoflurane 1 - 3% ב 100% חמצן בקצב זרימה של 0.8 ליטר / דקה. החל הלא תרופתי סטרילי משחת עיניים לכל עין כדי למנוע התייבשות קרנית
  4. מכינים את האתר כירורגית באמצעות 10% povidone / יוד ספוגית / פתרון, ואחריו אתנול, חוזר 3 פעמים. למרוח גזה סטרילי (למשל, לעטוף כירורגית) על העכבר כדי לקבל שדה כירורגי סטרילי.
  5. לעשות חתך בעור היקפי ירך באמצע, ואחריו לנתיחה בוטה הכחשה של העור proximally. לחשוף את pedicle העצב וכלי דם הירך המדיאלי בצד החציוני של הרגל, ולאחר מכן ולקשורליד הרצועה מפשעתי באמצעות 4-0 ומצופה (polyglactin 910) חומר תפר נספג.
  6. בצע חיתוך רוחב אמצע הירך של קבוצות שרירים במספריים, ואחריו לנתיחה בוטה של ​​רקמות רכות למפרק coxofemoral. באמצעות חותך העצם, לבצע osteotomy אמצע הירך. באמצעות ספוגית כותנה קנס סטרילית או ספוג הג'לטין נספגים, לחץ בעדינות על האתר osteotomy לצמצום ומניעת דימום.
  7. סגור את העור שמעליה באמצעות קליפים פצע כירורגית להזריק 0.5 מיליליטר של SQ מלח החם לטיפול מאזן נוזלים. מניח את החיה על גבי כרית חמה עטופה בכלוב ההתאוששות ולפקח באופן רציף עד ער.
  8. לאחר הניתוח, לאסוף דגימות רקמה גידולים ראשוניים עבור RNA, DNA או בידוד חלבון, הצמד להקפיא בחנקן נוזלי חנות ב -80 C. עבור תרבית תאים ראשונית, לאסוף דגימות רקמה בשלב זה, כמפורט בסעיף 9 להלן. לתקן את רקמת האיבר שנותר 10% פורמלין ניטראלי שנאגר עבור היסטולוגיה immunochemisלנסות, כולל זיהוי hypoxyprobe-1.
  9. צג החיות לתנועה, הכאב וצריכת מזון במהלך 6 השעות הראשונות לאחר הניתוח, ולאחר מכן בכל יום במשך 3 ימים. להזריק את סוכן כאבים (Carprofen 5 מ"ג / ק"ג, SQ) כל יום במשך 3 ימים. הסר את קליפים פצע 10 ימים לאחר קטיעה באמצעות מסיר קליפ פצע.

6. עכברי ניטור עבור הנוכחות של גרורות

  1. הקפד על עכברים יומי ולהעריך אותם סימנים קליניים של גרורות לפחות פעמיים בשבוע.
    1. שים לב החיות לנוכחות macrometastases הצגה כמו המונים המתפתחים במקומות שונים, בדרך כלל בכתפיים, ברגליים נגדיות ולסתות. לשם כך, בזהירות למשש הראש, הצוואר ואזורים בבית השחי, ואת hindlimb הנגדי. בדוק גרורות איברים פנימיים באמצעות נפיחות בטנית יחד עם סריקת MRI.
    2. לבדוק את קיומו של גרורות סרטניות בריאות על ידי לחיצה על תהליך xyphoid (החלק התחתון של עצם החזה) עם אינסוףx אצבע. 24
      הערה: לחץ זה מקטין את יכולת הנשימה סרעפתי. עכברים עם גרורות ריאות מתקדמות להראות סימני מצוקה נשימתית המתבטאת נשימה מאומצת.
    3. שים לב החיות עבור סימפטומים נוירולוגיים, כגון שיתוק ברגלו אטקסיה מצביע גרור למערכת העצבים המרכזית.
    4. צג העכברים לפחות פעם בשבוע לצורך ההרזיה, כאינדיקציה להתקדמות מחלה פוטנציאלית. גוף הרזיה תעלה על 15% מהמשקל מראש פרוצדורליים נחשבת קצה אנושי.

7. הדמיית תהודה מגנטית (MRI) עבור גרורות זיהוי

  1. בצע MRI לגילוי גרור בנקודות זמן רצויות. 18
    הערה: במסגרת המחקר הנוכחי, ספקטרומטר אופקי 7-טסלה היה בשימוש. MRI בוצע ימים 15 ו -35-קטיעה פוסט עבור תאי SK-ES1 ובאותו יום 15 עבור TC71 תאים.
  2. מניחים את העכבר לתוך chambe אינדוקציה הרדמהr המכיל 1 - 3% isoflurane בתערובת גז חמצן 30% ו -70% תחמוצת החנקן.
  3. השאירו את העכבר בתא אינדוקציה עד שהוא מגיב לגירויים חיצוניים. ואז להסיר את החיה מן תא אינדוקציה.
  4. מעביר את העכבר הרדים על בעל stereotaxic עם נשימה והטמפרטורה monitorization עם ממשל רציף של isoflurane 1.5% ו -30% תחמוצת חנקן. החל הלא תרופתי סטרילי משחת עיניים לכל עין כדי למנוע יובש קרני. תמונה החיה בין בהליך מ"מ 40 או 23 סליל העכבר נפח Bruker הדמיה הגוף או המוח כולו, בהתאמה.
  5. השתמש רצף נדיר דו מימדי, T2-weighted: TR = 3,000 msec, TE = 24 msec, מטריקס = 256, FOV = 4.35 x 3.0 ס"מ, עובי פרוסה = 0.5 מ"מ, גורם נדיר = 4 וממוצעים = 4. 18
  6. מניח את החיה בכלוב התאוששות חמה ולפקח באופן רציף עד ער.
    הערה: העכברים יתאוששו במהירות מאז מטוס של הרדמה רדוד משמש.
  7. לפקח על בעלי החיים במהלך הדמיה 6 השעות לאחר הראשונות לוודא כי אין תופעות לוואי של ההרדמה.

8. המתת חסד Necropsy

  1. להרדים את העכברים פעם החיות הנוכחיות עם גרורות לזיהוי באמצעות MRI ו / או תסמינים קליניים של התקדמות מחלה.
    הערה: במסגרת המחקר הנוכחי, העכברים הוקרבו על ימים 50 ו -25 שלאחר קטיעה חיות נושאות SK-ES1 ו xenografts TC71, בהתאמה. במקרים מסוימים, המתת חסד קודם לכן היה הכרחי בשל נטל גרורות גבוהה.
  2. להרדים את העכברים על ידי חשיפת CO 2 ב 1.5 L / min (CO 2 ב 10 - 30% של דקות המתת חסד קאמרי כרך /). כדי להבטיח מוות חי, לבצע נקע בצוואר רחם לאחר חשיפת 2 CO.
  3. תרסיס העכבר כולו עם אתנול 70% ולמקם אותו לתוך מכסה המנוע זרימה למינרית. אסוף את הדם על ידי לנקב לב באמצעות מחט 25 G ½ עם מזרק 1 מ"ל ולהעביר איסוף דם tuלהיות המכיל 2 מ"ג של EDTA.
  4. אסוף את הרקמות הבאות: טחול, בלוטת יותרת כליה, שחלות, כליות, כבד, ריאות, מוח, רגל ימין, מח העצם humeri ושדרתי, כמו גם גרור מקרוסקופיות נוכחית במקומות אחרים. 25,26
  5. תקן חצי של כל רקמות 10% פורמלין נייטרלי שנאגרו עבור היסטולוגיה immunochemistry, כולל זיהוי hypoxyprobe-1. הצמד להקפיא את החצי השני בחנקן נוזלי, ולאחר מכן לאחסן ב -80 צלזיוס למשך RNA, DNA או בידוד חלבון. 25,26 עבור תרבית תאים ראשוניים, לאסוף דגימות רקמה כמפורט בסעיף 9 להלן.

9. תרבית תאים ראשונית

  1. כדי לבצע תרבית תאים ראשונית, לנתח רקמות מן האיבר הכרות (סעיף 5 לעיל) או במהלך necropsy (סעיף 8 לעיל) בתנאים סטריליים במנדף זרימה למינרית.
  2. כן מתאים תקשורת תרבית תאים עבור הקו הסלולרי משמש זריקות orthotopic, השלם עם פניצילין (200 יחידות / מיליליטר),סטרפטומיצין (200 מיקרוגרם / מ"ל), fungizone (1 מיקרוגרם / מ"ל), ו אנטיביוטי מניעתי 0.2% mycoplasma. מניחים 2.5 מ"ל של המדיום התרבות העיקרי לתוך צלחת תרבית תאים 6 ס"מ.
  3. בחר באזורי רקמת גידול קיימא מגידולים או גרורות ראשיים ולאחר מכן לבודד שני לשלושה מיגזרי ב 2-3 מ"מ כל באמצעות מספריים סטרילית.
    הערה: רקמת גידול בת קיימא נמצאת בדרך כלל על הקצוות של הגידול והוא יכול להיות מופלים מן נימק לפי צבע ורדרד או אדמדם, שופע משמעותית ומראה רטוב הכולל. לעומת זאת, רקמות נימקים נתפסו בדרך כלל במרכז של הגידול ומציגה כגוש צבע לבנבן / שמנת עם מראה חסר חיים, גביני. 27
  4. מעביר את הפלחים המבודדים לצלחת תרבית תאי 6 סנטימטר המכילה בינוני התרבות העיקרי שמתואר בשלב 9.2.
  5. תרבות תאים בתנאים סטנדרטיים, כמתואר בסעיף 1 (הערה) ו -9.2. 18,28 בדוק את תרבות תולדת הסלולר הנובעים פיסות הרקמה, WHich יש לשים לב תוך מספר ימים. לאחר התאים מגיעים למפגש, trypsinize ולהרבות אותם בהתאם לטכניקות תרבית תאים סטנדרטיים.
    הערה: תרבית התא הראשונית ניתן לאחר מכן נעשתה שימוש כדי להעריך צמיחה ומאפיינים גרורתי של התאים שמקורם מלאים גידולי חוסר חמצן, כמו גם התכונות המולקולריות שלהם, כפי שתואר לעיל. 18

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בעקבות הזרקה של בתאי גזע עובריים לתוך שריר הסובך, הגידולים העיקריים הם מותר לגדול לגודל עגל של 250 מ"מ 3 (איור 1, 2). את הזמן הדרוש עבור גידולים להגיע בכרך זה בדרך כלל נע בין 10 - 15 ימים עבור TC71 20-25 ימים xenografts SK-ES1, בהתאמה. גידולים בווליום עגל של התערוכה 250 מ"מ 3 רמה נמוכה יחסית של היפוקסיה אנדוגני (כ 3% של רקמת הגידול), מבוסס על hypoxybrobe-1 (pimonidazole) מכתים (איור 4 א, ג).<...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

המודל שלנו כולל השוואה של גרורות בשתי קבוצות ניסוי - קבוצת ביקורת, שבהם גידולים מותרים להתפתח hindlimb ואחריו קטיעה בהגיעם נפח עגל של 250 מ"מ 3, וקבוצה חשופה-היפוקסיה, שבו tumor- hindlimb נושאות נתונה FAL באותו נפח, ואחריו קטיעה 3 ימים לאחר מכן. למרות בניסויים אלה הגידולים שטופלו FAL קטועים עם עיכוב קל, לעומת הגידולים השליטים, גודלם אינו מעלה במהלך 3 הימים בין הקשירה וקטיעות. לכן, גישה זו מאפשרת השוואה של פוטנציאל גרורתי בין גידולים בגדלים דומים אך עם רמות שונות דר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH): UL1TR000101 (בעבר UL1RR031975) באמצעות תוכנית פרסי המדע הקליני והתרגומי, 1RO1CA123211, 1R03CA178809, R01CA197964 ו-1R21CA198698 ל-JK. MRI בוצע במעבדת המחקר להדמיה פרה-קלינית (PIRL) של מרכז הסרטן המקיף של ג'ורג'טאון-לומברדי ועיבוד רקמות במשאב המשותף להיסטופתולוגיה ורקמות של מרכז הסרטן המקיף של ג'ורג'טאון-לומברדי, שניהם נתמכים על ידי מענק NIH/NCI P30-CA051008. המחברים מודים לדן צ'אלותורן ולג'יימס א. פאבר, המחלקה לביולוגיה ופיזיולוגיה של התא, אוניברסיטת צפון קרוליינה בצ'אפל היל, על עזרתם באנגיוגרפיה של קרני רנטגן לאחר המוות, ועל מתן תובנות ומומחיות בנושא קולטרוגנזה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
SK-ES1 תאי סרקומה אנושיים יואינג (ES)ATCC
TC71 תאימסופק באדיבות מ-5A (שונה) של ד"ר טורצקי
מקוי MediumGibco על ידי Life Technologies12330-031
RPMI-1640ATCC30-2001
PBSCorning Cellgro21-040-CV
FBSסיגמא-אולדריץ'F2442-500 מ"ל
0.25% טריפסין-EDTA (1x)ג'יבקו מבית Life Technologies25200-056
פניצילין-סטרפטומיציןג'יבקו מבית Life Technologies15140-122
Fungizone® AntimycoticGibco של Life Technologies15290-018
MycoZap™ לונזה מונעתVZA-2032
קולגן סוג I זנב עכברוש גבוהBD Biosciences354249
עכברי SCID/בזהרלן או צ'ארלס ריבר250 (נהר צ'ארלס) או 18602F (הרלן)
מ"ל מזרקי אינסולין עם חיבור קבוע 28  G ½ מחטBD329424
מי מלח (0.9% הזרקת נתרן כלורי, USP)Hospira, INCNDC 0409-7984-37
קליפרים דיגיטלייםWorld Precision Instruments, Inc501601
כלים כירורגייםכלים מדעיים עדינים רימדיל
(קרפרופן) להזרקה Zoetis
Hypoxyprobe-1 (מוצק פימונידזול הידרוכלוריד)HPI, IncHP-100 מ"ג
hypoxyprobe-2 (CCI-103F-250 מ"ג)HPI, IncCCI-103F-250 מ"ג
ספוגית פובידון-יודPDIS41350
כרית הכנה לאלכוהול סטריליFisher HealthCare22-363-750
LubriFresh P.M. (חומר סיכה לעיניים משחה) Major PharaceuticalsNDC 0904-5168-38
רפידות תחתונות סופגות VWR עם מחסום לחות עמיד למיםVWR56617-014 
Oster Golden A5 קוצץ וטרינרי במהירות אחת עם גודל 50 להבאוסטר078005-050-002 (קוצץ), 078919-006-005 (להב)
קרם נאיר עם שמן תינוקותכנסייה & דווייט ושות', בע"מ
Silk 6-0Surgical Specialties Corp752B
תפר פרולן (פוליפרופילן) 6-0Ethicon8680G
תפר ויקריל (פוליגלקטין 910) 4-0 EthiconJ386H
Fisherbrand אפליקטורים (כותנה מטוהרת)Fisher Scientific23-400-115
GelFoam ספוגים דנטליים נספגים - גודל 4פייזר פרמצבטיקה9039605
אוטוקליפ קליפ פצע ApplierBD427630
מיקרוסקופ סטריאואולימפוסSZ61
מסיר אוטוקליפBD
קליפBD427631
MRI 7 טסלהBruker Corporation
Paravision 5.0 תוכנהBruker Corporation
CO2 מערכת המתת חסדVetEquip
25 G 5/8 מחט (לניקוב לב)BD305122
מזרק 0.1 מ"ל (עבור ניקוב לב)TerumoSS-01T
K3-EDTA מיקרו שפופרת 1.3 מ"לSarstedt41.1395.105
10% ניטרלי בחמאה פורמליןפישר סיינטיפיקSF100-4
ES אנושיים ' 1 427637

מקורות

  1. Lessnick, S. L., Ladanyi, M. Molecular pathogenesis of Ewing sarcoma: new therapeutic and transcriptional targets. Annu Rev Pathol. 7, 145-159 (2012).
  2. Ladenstein, R. Primary disseminated multifocal Ewing sarcoma: results of the Euro-EWING 99 trial. J Clin Oncol. 28, 3284-3291 (2010).
  3. Dunst, J., Ahrens, S., Paulussen, M., Burdach, S., Jurgens, H. Prognostic impact of tumor perfusion in MR-imaging studies in Ewing tumors. Strahlenther Onkol. 177, 153-159 (2001).
  4. Aryee, D. N. Hypoxia modulates EWS-FLI1 transcriptional signature and enhances the malignant properties of Ewing's sarcoma cells in vitro. Cancer Research. 70, 4015-4023 (2010).
  5. Knowles, H. J., Schaefer, K. L., Dirksen, U., Athanasou, N. A. Hypoxia and hypoglycaemia in Ewing's sarcoma and osteosarcoma: regulation and phenotypic effects of Hypoxia-Inducible Factor. BMC cancer. 10, 372(2010).
  6. Tilan, J. U. Hypoxia shifts activity of neuropeptide Y in Ewing sarcoma from growth-inhibitory to growth-promoting effects. Oncotarget. 4, 2487-2501 (2013).
  7. Franzius, C. Successful high-resolution animal positron emission tomography of human Ewing tumours and their metastases in a murine xenograft model. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 33, 1432-1441 (2006).
  8. Hauer, K. DKK2 mediates osteolysis, invasiveness, and metastatic spread in Ewing sarcoma. Cancer Research. 73, 967-977 (2012).
  9. Manara, M. C. Preclinical in vivo study of new insulin-like growth factor-I receptor--specific inhibitor in Ewing's sarcoma. Clin Cancer Res. 13, 1322-1330 (2007).
  10. Scotlandi, K. Murine model for skeletal metastases of Ewing's sarcoma. J Orthop Res. 18, 959-966 (2000).
  11. Vormoor, J. Establishment of an in vivo model for pediatric Ewing tumors by transplantation into NOD/scid mice. Pediatr Res. 49, 332-341 (2001).
  12. Picarda, G. Preclinical evidence that use of TRAIL in Ewing's sarcoma and osteosarcoma therapy inhibits tumor growth, prevents osteolysis, and increases animal survival. Clin Cancer Res. 16, 2363-2374 (2010).
  13. Vormoor, B. Development of a preclinical orthotopic xenograft model of ewing sarcoma and other human malignant bone disease using advanced in vivo imaging. PLoS One. 9, e85128(2014).
  14. Wang, Y. Platelet-derived growth factor receptor beta inhibition increases tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) sensitivity: imatinib and TRAIL dual therapy. Cancer. 116, 3892-3902 (2010).
  15. Wang, Y. X. Inhibiting platelet-derived growth factor beta reduces Ewing's sarcoma growth and metastasis in a novel orthotopic human xenograft model. In Vivo. 23, 903-909 (2009).
  16. Odri, G. A. Zoledronic acid as a new adjuvant therapeutic strategy for Ewing's sarcoma patients. Cancer Research. 70, 7610-7619 (2010).
  17. Merchant, M. S. Interferon gamma enhances the effectiveness of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor agonists in a xenograft model of Ewing's sarcoma. Cancer Research. 64, 8349-8356 (2004).
  18. Hong, S. H. High neuropeptide Y release associates with Ewing sarcoma bone dissemination - in vivo model of site-specific metastases. Oncotarget. 6, 7151-7165 (2015).
  19. Lee, E. W. Neuropeptide Y induces ischemic angiogenesis and restores function of ischemic skeletal muscles. J Clin Invest. 111, 1853-1862 (2003).
  20. Tilan, J. U. Platelet neuropeptide Y is critical for ischemic revascularization in mice. FASEB J. , (2013).
  21. Toffoli, S., Michiels, C. Intermittent hypoxia is a key regulator of cancer cell and endothelial cell interplay in tumours. The FEBS journal. 275, 2991-3002 (2008).
  22. Das, B. Hypoxia enhances tumor stemness by increasing the invasive and tumorigenic side population fraction. Stem cells (Dayton, Ohio). 26, 1818-1830 (2008).
  23. Arndt, C. A., Rose, P. S., Folpe, A. L., Laack, N. N. Common musculoskeletal tumors of childhood and adolescence. Mayo Clin Proc. 87, 475-487 (2012).
  24. Mendoza, A. A novel noninvasive method for evaluating experimental lung metastasis in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 52, 584-589 (2013).
  25. Feldman, D. B., Seely, J. C. Necropsy Guide: Rodents and the Rabbit. , CRC Press. (1988).
  26. Parkinson, C. M. Diagnostic necropsy and selected tissue and sample collection in rats and mice. J Vis Exp. , (2011).
  27. Raymond, A. K., Lazar, A. J. Bone Sarcoma. PP, L. in, S, P. atel , Springer. (2013).
  28. Dietel, M., Arps, H., Gerding, D., Trapp, M., Niendorf, A. Establishment of primary cell cultures: experiences with 155 cell strains. Klin Wochenschr. 65, 507-512 (1987).
  29. Varghese, A. J., Gulyas, S., Mohindra, J. K. Hypoxia-dependent reduction of 1-(2-nitro-1-imidazolyl)-3-methoxy-2-propanol by Chinese hamster ovary cells and KHT tumor cells in vitro and in vivo. Cancer Research. 36, 3761-3765 (1976).
  30. ATCC. , http://www.atcc.org/products/all/HTB-86.aspx#characteristics (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

היפוקסיה גידוליתקשירת העורק הפמוריאליהשתלה קסנוגרפטית אורתוטופיתתאי סרקומה של יאווינגצביעת Hypoxyprobe-1ניתוח גרורותצמיחת גידול ראשוניאיסכמיה של הגפה האחוריתעכברי SCID Beige
In vivo מודל השפעת בדיקה של היפוקסיה על גרורות של גידולים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.