מאמר שיטה

יצירת והשתלות של גיליון נגזר שומן בתאי גזע (ASC) במודל של ריפוי פצע סוכרתי

DOI:

10.3791/54539

⸱

4 באוגוסט 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Diabetic Center, Tokyo Women's Medical University School of Medicine, 2The Institute of Advanced Biomedical Engineering and Science, Tokyo Women's Medical University, 3The Department of Anatomy and Developmental Biology, Tokyo Women's Medical University School of Medicine

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נגזר שומן בתאי גזע (השיקופיים) בקלות מבודדים, שנקטפו השומן של חולדות רגילה. גליונות ASC יכולים להיווצר באמצעות הנדסה תא גיליונות, יכול להיות מושתלים לתוך צוקר סוכרתית חולדות שומני מפגין מלא-עובי העור פגמים עם עצם חשופה והן מכוסות bilayer של עור מלאכותי.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עור מלאכותי השיג תוצאות טיפוליות ניכר בפרקטיקה הקלינית. עם זאת, עור מלאכותי טיפולים עבור פצעים בחולי סוכרת עם זרימת הדם המניע או עם פצעים גדולים עשוי להיות ממושך. טיפולים מבוססי תאים הופיעו גם טכניקה חדשה לטיפול של כיבים סוכרתיים, הנדסה תא גיליונות שיפרה את היעילות של השתלת תא. מספר דוחות הראו כי נגזר שומן בתאי גזע (השיקופיים), סוג של תא mesenchymal סטרומה (MSC), נספח הפוטנציאל הטיפולי בשל השפע היחסי שלהם רקמת שומן, שלהם נגישות עבור אוסף בהשוואה ל- MSCs של רקמות אחרות. לכן, השיקופיים להיראות מקור טוב של תאי גזע לשימוש טיפולית. במחקר זה, גליונות עולה מן השומן אדיפוז epididymal של חולדות לואיס רגילה נוצרו בהצלחה באמצעות בינוני תרבות רגיל המכיל חומצה אסקורבית ומנות טמפרטורה מגיב תרבות. הסדינים ASC היו מושתלים לתוך צוקר שומן סוכרתית (ZDF) חולדות, מודל עכברוש של סוכרת מסוג 2 והשמנת, כי התערוכה מופחתת ריפוי פצעים. פצע נוצר על פני הגולגולת האחורי ASC הסדינים היו מושתלים לתוך הפצע, עור מלאכותי bilayer שימש כדי לכסות את הסדינים. ZDF חולדות שקיבלו ASC גליונות כדאי היה פצע ריפוי מחולדות ZDF ללא השתלת גיליונות ASC. גישה זו הייתה מוגבלת מכיוון ASC גליונות רגישים לתנאי יובש, המחייב שמירה על סביבה לחה הפצע. לכן, עור מלאכותי שימש כדי לכסות את הגיליון ASC כדי למנוע התייבשות. השתלת allogenic של גיליונות ASC בשילוב עם עור מלאכותי עשוי גם להיות רלוונטי סורר כיבים או כוויות, כגון אלה נצפו עם מחלת עורקים היקפיים ומחלות קולגן, אחרים ו יכול להיות מנוהל על מנת חולים אשר אתה סובל מתת תזונה או נמצאים באמצעות סטרואידים. לכן, טיפול זה יכול להיות הצעד הראשון לקראת שיפור האפשרויות הטיפוליות עבור סוכרת פצע ריפוי.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אוכלוסיית חולי סוכרת היא הגוברת ברחבי העולם והגיע 400 מיליון בשנת 20151; אומדן 15-25% של חולי סוכרת נמצאים בסיכון של ההתקדמות של כיב סוכרתי התחתונה-הגפיים2. כיבים סוכרתיים התחתונה-הגפיים סורר, עשוי לדרוש הממושכת טיפולית עם הדרכה שיקומית לאחר התאוששות מלאה. תקופה ארוכה טיפול לעיתים קרובות גורמת לירידה משמעותית באיכות החיים המטופל. לפיכך, יש לפתח טיפולים חדשים להקטין או למנוע עוגמת נפש לטיפול פצעי סוכרת. כדי להעריך את ריפוי הפצע סוכרתית, אנחנו ממוטב כיב סוכרתי ריפוי פצע מודל בחולדות, אשר מחקה תנאים קליניים מעשיים, להעריך אם משתילים גליונות נגזר שומן בתאי גזע (ASC) באמצעות הנדסה תא גיליונות מואצת פצע ריפוי.

Mesenchymal תאי סטרומה (MSCs) התערוכה של פוטנציאל מצוין עבור האצת ריפוי הפצע בשל יכולת התחדשות עצמית שלהם, אפקטים immunomodulatory שלהם, יכולתם להבדיל לתוך התא השונים שושלות3. השיקופיים הם סוג של MSC נגזר רקמת שומן, שהם מייצגים את מספר יתרונות על פני MSCs נגזר רקמות אחרות, כולל שלהם האנגיוגנזה פוטנציאליים, paracrine פעילות4,5. רקמת שומן יחסית שופע בגוף האדם, הנגישות שלה מאפשר איסוף באמצעות הליכים פולשנית. לכן, השיקופיים שימשו השפעול של ריפוי פצע יישומים6,7.

בדו"חות קודמים הראו כי הזרקה ישירה של תא בודד MSC המתלים לאזורים סביב הפצעים יכולים להאיץ את8,9ריפוי הפצע. עם זאת, למרות דיווחים על ההאצה של ריפוי פצעים כיב סוכרתי דגמים לאחר ההזרקה של תא בודד המתלים, הפעם הישרדות התאים המושתלים באתר הפצע אינו ברור.

במחקר זה, אנחנו מוחלים הנדסה תא גיליונות באמצעות תרבות טמפרטורה מגיב מנות. הכלים האלה יש את הטמפרטורה מגיב פולימר N- isopropylacrylamide covalently שמאוגד אל פני השטח שלהם,10. השכבה פולימר המושתל מאפשר תא מבוקרי טמפרטורה הדבקה על או ניתוק מפני השטח של המנה תרבות. פני השטח של המנה הופך הידרופובי ב 37 מעלות צלזיוס, ומאפשר תאים לדבוק ולאחר להתרבות, ואילו תאים לנתק באופן ספונטני מהמשטח לכשתהיה הידרופילית בטמפרטורה שמתחת 32 ° C. תאים בתרבית ניתן לקצור כמו סדין תא רציפים עם צמתי לתא ללא פגע, מטריצה חוץ-תאית (ECMs) פשוט על-ידי הפחתת הטמפרטורה; לפיכך, אנזימים הפרוטאוליטי נזק ECM, כמו טריפסין, אינם נדרשים11. לכן, הנדסה תא גיליונות יכול לשמר חיבורים לתא ולשפר את היעילות של השתלת תא.

בנוסף, השתלת תאים גיליונות מגדילה תא שיעורי ההישרדות בהשוואה תא הזרקת12. ב פרוטוקול זה, נבחרו צוקר סוכרתית שומניים (ZDF) חולדות כמודל סוג 2 סוכרת והשמנה עם ריפוי הפצע מושהית. חולדות ZDF להתפתח באופן ספונטני השמנת יתר בכ-4 שבועות. ואז הם לפתח סוכרת מסוג 2 עם השמנת יתר בין 8 ל 12 שבועות של גיל, באיזה שלב הם מציגים היפרגליקמיה המשויך אינסולין ההתנגדות, dyslipidemia וטריגליצרידים13. עיכוב ריפוי הפצע, זרימת דם מופחתת כלי דם היקפיים, סוכרת כלייתית גם הן נצפו14,15,16. יתר על כן, ZDF חולדות עשוי להיות מודל המתאים עבור לימוד ריפוי של כיבים עורית סורר, כגון כיבים סוכרתיים.

ההבדלים בין בני אדם ומכרסמים מנגנוני ריפוי פצע משויכות הבדלים אנטומיים של העור. ריפוי אצל חולדות רגילה הפצע מבוסס על הפצע התכווצות, ואילו ריפוי הפצע בבני אדם מבוסס על היווצרות epithelialization מחדש רקמות פרור. בדרך כלל, הפצע לסדים. בשימוש במודלים מכרסמים מסייעת כדי למזער את הפצע התכווצות, מאפשר היווצרות הדרגתית של רקמות פרור17, למרות הפצעים בחולדות nondiabetic סגורים כמעט לגמרי על-ידי התכווצות. עם זאת, סוכרת פצע התכווצות ZDF חולדות הוא לקוי, ומתרחשת בעיקר ריפוי הפצע באמצעות epithelialization מחדש ויצירת רקמות פרור; לפיכך, תהליך זה דומה יותר ריפוי14הפצע האנושי.

פצעי סוכרת עם עצם חשופה לאחר הטריה לעיתים קרובות נתקל קלינית. מחקרים קודמים בחנו בקוטר 12 מ מ מלא-עובי העור פצעים על גבם של athymic עכברים עירום18,19 ופצעים עור מלא-עובי 10 מ מ קוטר על גבם של עכברים רגילה20. לפתח מודל קליני פצעי סוכרת חמורה, פגמים מלא-עובי העור (15 x 10 מ מ2) גדול יותר עם חשוף העצם ואת בלי קרום העצם נוצרו, כפי שתואר לעיל21, בחולדות עם סוכרת מסוג 2 והשמנת.

עכברוש גליונות עולה (rASC) מתוך השיקופיים של חולדות לואיס רגילה נוצרו לעבור השתלת allogenic של גיליונות ASC. באימון קליניים, השתלת עצמיים לא ילך, כי חולי סוכרת עם כיבים לעתים קרובות להפגין סיבוכים סוכרת חמורה, כגון רמות הגלוקוז בדם גבוהה לא מבוקרת ומדדי מסת גוף גבוה, סיבוכים כי ריפוי פצע הפרעות אלה המגבירים את הקושי בהשגת רקמת שומן מחולים אלה. יתר על כן, השיקופיים של בעלי חיים עם סוכרת בנספח לשנות מאפיינים, ליקויי תפקוד22. לכן, פרוטוקול המובאת כאן מתאר את השתלת allogenic של rASC גיליונות של חולדות רגילה לבין היישום של עור מלאכותי חולדות סוכרתית.

העור המלאכותי bilayer בשימוש פרוטוקול זה מונע התכווצות ספונטנית של הפצעים, מקדם את סינתזת של מטריצה רקמת חיבור חדשה, דומה הדרמיס נכון23. ב פרוטוקול זה, עור מלאכותי המוטלות על גיליון rASC, קבוע עם חוטי ניילון למניעת פצע התכווצות או התרחבות הנובע עור רופף עכברוש. בנוסף, העור המלאכותי מספקת מסגרת תלת-ממדי עבור הגליונות ASC שומרת על סביבה לחה ASC גליונות ופצעים המושתלים, מגן על הפצעים על זיהום, כוחות חיצוניים. לבסוף, ללא דבק ההלבשה מושם על הפצע כדי להגן עליו מפני השפעה חיצוניים, לשמור על סביבה לחה הפצע לספוג תפליט.

גיליון rASC רזה, גמיש ובעל deformable, יכול להיות דבקה העברת אתרים לנמען, כגון בגודל הלב הפועם24. הנדסה תא גיליונות שימש את שיקומה של רקמות שונות, ניתן להפיק אפקטים המרפא25,26. גליונות עולה כי התערוכה הפוטנציאל הטיפולי קליני שואלי ריפוי של סוגים רבים של פצעים. יתר על כן, השתלת allogeneic של גיליונות ASC, בשילוב עם השימוש של עור מלאכותי, עשוי להיות רלוונטי לטיפול בכיבים סורר או כוויות, כגון אלה הנהוגות מחלת עורקים היקפית או מחלות קולגן, או שהם עשויים להינתן לחולים אשר אתה סובל מתת תזונה או שימוש בסטרואידים. גישה זו מגדילה את היעילות של משתילים השיקופיים. המודל ריפוי פצע עכברוש ZDF מייצרת מצב פצע חמור דומה את תהליך ריפוי הפצע האנושי, מחקה תנאים קליניים בחיה ניסיוני בגודל קטן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הפרוטוקולים הניסויים המוצגים להלן אושרו על ידי הוועדה לרווחת בעלי חיים של בית הספר לרפואה של האוניברסיטה לרפואה של טוקיו ועמדו בכל הדרישות של ההנחיות לניהול תקין של ניסויים בבעלי חיים.

1. הכנת בעלי חיים, כלי נגינה, אמצעי תרבות וכלים

  1. הכן מדיום תרבית שלם באמצעות מדיום אלפא חיוני מינימלי המכיל 20% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין. אחסן את זה במשך מספר חודשים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
  2. השתמש בחולדות ZDF זכרים בוגרים כמודל השמנת יתר סוכרתית מסוג 2. השתמש בכרית השומן של חולדות לואיס זכרות כדי לבודד רקמת שומן כדי להכין את יריעות התאים.

2. בידוד ותרבות של rASCs

  1. השג רקמת שומן מחולדות לואיס (בנות 8 - 33 שבועות, זכר) בהרדמה כללית באמצעות איזופלורן.
    1. הכן מאוורר מכני למכרסמים ו -4% איזופלורן. הכינו כמה קצות כותנה סטריליים, גזה נקייה, אזמל, מחזיק מחט, מספריים להפעלה, זוג מלקחיים ותפר ניילון 5-0. עקר את המכשירים והציוד הכירורגיים.
    2. הכינו צלחת פטרי בקוטר 100 מ"מ עם 10 מ"ל של מי מלח סטריליים עם חוצץ פוספט (PBS) כדי לשמר באופן זמני את רקמת השומן המתקבלת. שקלו את צלחת הפטרי עם PBS באמצעות איזון לפני תחילת הניתוח כדי למדוד את רקמת השומן שנאספה. הניחו את המכשירים והציוד הניתוחי על וילון סטרילי.
    3. להרדים את החולדות על ידי שימוש באיזופלורן ב-3-4% באמצעות מכונת הנשמה מכנית של מכרסמים ולשמור על החולדות באיזופלורן של 2-3% במהלך הניתוח. עקוב אחר עומק ההרדמה על ידי התבוננות בעומק וקצב הנשימה של כל חולדה.
    4. תוך כדי לבישת כפפות סטריליות, מקם את החולדה במצב שכיבה על וילון סטרילי. לגלח את אזור הניתוח בעזרת סכין גילוח חשמלי ולנקות את חלק הבטן של החולדה באמצעות גזה סטרילית ספוגה באתנול 70%.
    5. צור חתך עור באורך של כ-5 ס"מ עם אזמל בבטן התחתונה הצדדית של החולדה. חשוף ונתח את השריר האלכסוני החיצוני. לאחר מכן, חשוף את רקמת השומן האפידידימלית המקיפה את האפידידימיס. משוך בעדינות את רקמת השומן האפידידימלי החוצה.
      הערה: ניתן להשיג את רקמת השומן משני צידי בטן החולדה.
    6. כרתו רק את רקמת השומן האפידידימלית, והימנעו מנזק לאפידידימיס, לאשכים ולכלי הדם האפידידימליים (איור S1). משרים את רקמת השומן הכרותה ב-PBS בצלחת הפטרי כדי למנוע יובש ושוקלים את הרקמה.
    7. סגור את שריר הבטן עם 5-0 VICRYL ואת העור עם תפר ניילון 5-0. לאחר מכן, החזירו כל חולדה שעברה ניתוח לכלוב נפרד (חולדה אחת לכל כלוב).
      הערה: עקוב אחר החולדות עד שהן מתאוששות לחלוטין.
  2. לבודד rASCs מ-2 - 3 גרם של רקמת שומן (שנכרתה מחולדת לואיס ומעובדת על פי שיטה שדווחה בעבר)27. בקצרה, עכל אנזימטית את רקמת השומן שנכרתה עם 0.1% קולגנאז מסוג A ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת כדי לקבל את החלק הסטרומלי-וסקולרי (SVF; איור S2).
    1. הכן מספר מסנני תאים של 100 מיקרומטר, כמה צינורות של 50 מ"ל, כמה צינורות של 15 מ"ל ושני אזמלים על ספסל נקי ביולוגי. הפעל צנטריפוגה וחמם אמבט מים ל -37 מעלות צלזיוס. בנוסף, הכינו כ-50 מ"ל PBS סטרילי בצינור של 50 מ"ל עם 0.1% (ריכוז סופי) של קולגנאז מסוג A.
    2. טוחנים את רקמת השומן לחתיכות קטנות בעזרת שני אזמלים.
    3. העבירו את כל רקמת השומן הטחון לצינור של 50 מ"ל והוסיפו PBS כדי להביא את הנפח הכולל ל-15 מ"ל.
    4. הנח את הצינור של 50 מ"ל זקוף למשך 5 דקות. השליכו את השכבה העליונה ואספו את השכבה התחתונה למעט הפסולת.
    5. הוסף 0.1% מתמיסת קולגנאז מסוג A לצינור של 50 מ"ל עם PBS המכיל את השכבה העליונה על מנת לעכל אנזימטית את רקמת השומן.
      הערה: יש לחמם כ-20 מ"ל PBS לכל 2-3 גרם רקמת שומן באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.
    6. הטה ונער את צינור ה-50 מ"ל בעדינות ב-120 - 130 סל"ד למשך שעה אחת באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.
    7. הנח את צינור ה-50 מ"ל זקוף למשך 5 דקות לאחר הטלטול.
    8. מסננים את התמיסה באמצעות מסננת תאים של 100 מיקרומטר ויוצקים את התמיסה לתוך צינור חדש של 50 מ"ל. הוצא את התמיסה המסוננת לשני צינורות של 15 מ"ל.
    9. צנטריפוגה את התמיסה בצינורות 15 מ"ל למשך 5 דקות ב-700 x גרם. הסר בזהירות את השכבה העליונה של הסופרנטנט והשאיר 5 מ"ל מהשכבה התחתונה של התמיסה. אין לשאוב את הגלולה.
    10. הוסף כ-5 מ"ל של מדיום תרבית שלם לכל צינור של 15 מ"ל, עד 10 מ"ל לכל צינור של 15 מ"ל, והשעיה מחדש בזהירות את הגלולה.
    11. חזור על שלבים 2.2.8 - 2.2.9. לאחר מכן, השג את ה-SVF.
  3. הכינו שתי צלחות תרבות בגודל 60 ס"מ. אוספים את ה-SVF לאחר שתי צנטריפוגות בחום של 700 × גרם למשך 5 דקות. תלו את ה-SVF וצלחו 10 מ"ל של תמיסת SVF על כל צלחת תרביתבגודל 60 ס"מ.
  4. תרבו את המנות במשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור של 5% CO2.
  5. הכן PBS וחומצה טטראצטית של 0.25% טריפסין-אתילנדיאמין (EDTA), הניתנת לאחסון במשך מספר חודשים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
  6. לאחר הציפוי הראשוני (24 שעות), שטפו את התאים עם PBS 3 פעמים כדי להסיר תאים ופסולת לא מחוברים. הוסף מדיום שלם טרי.
  7. מעבר התאים הכמעט תת-מתכנסים ביום השלישי. הוסף 1 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA ודגר את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממה של 5% CO2 למשך 3 - 5 דקות><. הערה: השלם את שלב הטריפסיניזציה תוך 10 דקות כדי למנוע נזק לתאים.
  8. התבונן בתאים תחת מיקרוסקופ אור לאחר טריפסיניזציה כדי לוודא שכל התאים התנתקו לחלוטין מהכלים. לאחר מכן, הוסיפו 9 מ"ל של מדיום תרבות שלם לכלים.
  9. ספור את מספר התאים באמצעות המוציטומטר.
  10. תת-תרבית התאים בצפיפות של 1.7 x 103 תאים/ס"מ2 כל 3 ימים עד למעבר 3. תרבית התאים התת-מתורבתים ב-37 מעלות צלזיוס באטמוספירה הלחה של אינקובטור 5% CO2.

3. יצירת גיליונות rASC

  1. הכינו כמה כלי תרבות מגיבים לטמפרטורה בקוטר 35 מ"מ. צפו מראש את הכלים ב-FBS (או מדיום שלם המכיל FBS) ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור של 5% CO2 למשך יותר משעה < ל-> הערה: צלחת תרבית מגיבה לטמפרטורה בקוטר 35 מ"מ היא מוצר זמין מסחרית.
  2. הכן צלחת תרמית ודגר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס להליכי הניסוי הבאים.
    הערה: בצע כל הליך באמצעות כלי תרבית מגיבים לטמפרטורה על צלחת תרמית של 37 מעלות צלזיוס כדי למנוע מהתאים להתנתק באופן ספונטני מהצלחת.
    1. מחממים את מדיום התרבות השלם המשמש בהליכים ל-37 מעלות צלזיוס לפני הניסוי.
    2. מעבר זרעים 3 rASCs שמקורם בחולדות לואיס על צלחת תרבית מגיבה לטמפרטורה בקוטר 35 מ"מ בצפיפות של 1.5 x 105 תאים/צלחת למשך 3 ימים תוך שימוש בנפח כולל של 2 מ"ל של מדיום תרבית שלם.
      הערה: כאשר rASCs מצופים על צלחת תרבית חדשה, יש לנדנד את המנה לאט קדימה ואחורה ושמאלה וימינה בחממה כדי להשיג זריעת rASC אחידה ויריעת rASC עבה באופן אחיד.
    3. החלף 2 מ"ל מהמדיום ל -2 מ"ל של מדיום תרבית שלם המכיל 16.4 מיקרוגרם/מ"ל L-חומצה אסקורבית פוספט מגנזיום מלח n-הידרט (AA) ביום השלישי לאחר הזריעה לכלי התרבית המגיבים לטמפרטורה שהודגרו על צלחת תרמית של 37 מעלות צלזיוס><. הערה: ניתן לאחסן AA מומס בטמפרטורה של -30 מעלות צלזיוס למשך חודשים.
    4. תרבית התאים למשך 4-5 ימים נוספים והחלפת המדיום כל יומיים במדיום טרי המכיל AA.
    5. אשר את ההתפשטות והיצירה של ASCs תחת מיקרוסקופ אור כדי לקבוע אם התרחשו פערים בין התאים ביריעת תא רציפה.
  3. העבירו את יריעות התאים מהחממה לספסל למשך 15 - 20 דקות כדי לקרר אותן לטמפרטורת החדר.; התבונן בתאים מתנתקים באופן ספונטני כיריעת תאים רציפה. קצרו את יריעת ה- rASC ממשטח הכלי בעזרת זוג מלקחיים.
    הערה: בדרך כלל, ניתן לטפל ביריעות rASC עם זוג מלקחיים. במידת הצורך ניתן להשתמש בקרום העברה להעברת יריעת תא מצלחת התרבית לאתר הפצע אם יריעת התא שבירה ושברירית.

4. הכנת מודל פצע פגם בעור בעובי מלא והשתלת יריעות rASC

  1. הכן מאוורר מכני למכרסמים ו -4% איזופלורן. הכינו כמה קצות כותנה סטריליים, גזה נקייה, תפר ניילון 5-0, אזמל, רספטור פריוסטאלי, מחזיק מחט, מספריים להפעלה וזוג מלקחיים. עקר את המכשירים והציוד הכירורגיים. הניחו את המכשירים והציוד הניתוחי על וילון סטרילי.
  2. הכינו PBS ושמרו אותו בטמפרטורת החדר, יחד עם מעט עור מלאכותי ותחבושת לא דביקה. חותכים מראש את העור המלאכותי (15X10 מ"מ) והחבישה הלא דביקה (20 × 15 מ"מ). יש להשרות את שכבת ספוג הקולגן הפנימית של העור המלאכותי במי מלח לפני השימוש בעור המלאכותי.
    הערה: העור המלאכותי עשוי משתי שכבות: שכבת יריעת סיליקון חיצונית וספוג קולגן פנימי.
  3. השתמש בחולדות ZDF (בנות 16 - 18 שבועות, זכר, 500 - 600 גרם) כמודל לריפוי פצעים לסוכרת מסוג 2 והשמנת יתר.
  4. להרדים את חולדות ה-ZDF על ידי שאיפת איזופלורן 4% באמצעות מאוורר מכני למכרסמים. השראת הרדמה על ידי שימוש באיזופלורן ב-4-5% באמצעות מכונת הנשמה מכנית למכרסמים ושמירה על 3-4% במהלך הניתוח. עקוב אחר עומק ההרדמה על ידי התבוננות בעומק וקצב הנשימה של כל חולדה באמצעות צביטה בבוהן.
  5. תוך כדי לבישת כפפות סטריליות, מקם את החולדה במצב נוטה על וילון סטרילי. נקו את ראש החולדה באמצעות גזה סטרילית ספוגה באתנול 70%, גלחו את אזור הניתוח בעזרת סכין גילוח חשמלי ונקו את העור לאחר הגילוח באמצעות גזה סטרילית ספוגה באתנול 70%.
  6. צור פגם עור מרובע בעובי מלא (15 x 10 מ"מ2) על ראשן של חולדות ZDF מורדמות על ידי הסרת רקמת העור מהאפידרמיס לפריוסטאום. כורתים את העור והרקמה העורית בעזרת אזמל ומסירים את הפריאוסטאום בעזרת רסטור פריוסטאלי.
  7. העבר את ה-rASCs על צלחת התרבית המגיבה לטמפרטורה של 35 מ"מ מהחממה לסביבה בטמפרטורת החדר מיד לפני ההשתלה.
  8. התבונן ב-rASCs על צלחת התרבית המגיבה לטמפרטורה של 35 מ"מ מתנתקת באופן ספונטני כיריעה משטח הכלי לאחר היווצרות פצע. קצרו את יריעות ה- rASC לאחר 7 ימי גידול על צלחות תרבית המגיבות לטמפרטורה. הסר את המדיום המתורבת ושטוף את יריעת ה- rASC עם PBS שלוש פעמים. משרים את יריעת ה- rASC ב- PBS עד להשתלה כדי למנוע התייבשות.
  9. הנח את יריעת ה-rASC מיד מעל הפגם בגולגולת באמצעות זוג מלקחיים. אם יריעת התא שבירה ושברירית, קרום יכול לשמש כפיגום להעברת יריעת התא מצלחת התרבות לאתר הפצע.
  10. כסו את יריעת ה-rASC והפגם בעור המלאכותי (15 x 10 מ"מ2) וסגרו את הפצע בכ-10 תפרים באמצעות תפר הניילון 5-0. כדי להגן על הפצע, יש להניח תחבושת לא דביקה (20 x 15 מ"מרבוע) על העור המלאכותי, תוך שימוש בתפרי ניילון 5-0 כדי לשמור על סביבת הפצע לחה ולספוג הפרשות.
    הערה: התחבושות הלא דביקות יוסרו על ידי חולדות ZDF תוך מספר ימים לאחר היישום. לכן, יש צורך לעקוב באופן קבוע אחר החולדות לאחר ההשתלה. בדרך כלל, התחבושת הלא דביקה מוחלפת כל יומיים בהרדמה כללית.
  11. החזירו כל חולדה שעברה ניתוח לכלוב נפרד עד להחלמה מלאה (חולדה אחת לכל כלוב). לאחר תקופת תצפית, המתת חסד של החולדות בשיטה המאושרת של מנת יתר של איזופלורן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה ניסה לבסס טיפול מבוססת תא חדש עבור פצעי סוכרת סורר. בקצרה (כמו מאויר באיור1), גליונות allogeneic rASC שנוצרו חולדות רגילה באמצעות הנדסה תא גיליונות, ואז הושתלו באמצעות bilayer עור מלאכותי על פגם מלא-עובי העור על עכבר סוכרתית. מיקרוסקופ אור תמונות של דוגמה טובה של גיליון rASC (איור 2 א) דוגמה רעה של גיליון rASC (איור 2B) מוצגים באיור2. כאשר השיקופיים הם מצופה על גבי צלחת תרבות חדשה, המנה צריך להיות לאט שזעזעו ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השלבים הקריטיים ביותר בהצלחה culturing גיליון rASC הן כדלקמן: 1) הטמפרטורה חייבת להישמר כ 37 מעלות צלזיוס במהלך culturing על המנות תרבות מגיבים טמפרטורה. במהלך היצירה של גיליון rASC, כל הליך בוצעה על התרמו-צלחת 37 ° C, ו כל ריאגנט היה התחמם עד 37 ° C כדי למנוע את התאים באופן ספונטני ניתוק מן המנה31. 2) לעכברושים ZDF הנמען חייב להיות במעקב כדי למנוע הסרת החבישה ללא דבק, אשר הוא קריטי עבור השתלת מוצלחת של גליונות rASC. אם הרוטב מוסר, יש להחיל ההלבשה ללא דבק חדש כדי למנוע את הסדינים ASC המושתלים של נ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים הבאים לחשוף יחסים פיננסיים הרלוונטיות בפרסום זה: Okano השנה הוא מייסד ומנהל של הלוח של תא הזרע בע מ, אשר רשיונות טכנולוגיה, פטנטים מאוניברסיטת טוקיו לנשים הרפואי, ואת השנה Okano יאמאטו יתבוננו הם בעלי תפקידים באוניברסיטה לרפואה תא זרע inc. טוקיו נשים מקבל וקרנות מחקר של תא הזרע בע מ המחברים אחרים מצהירים כי אין הם יחסים פיננסיים הרלוונטיות בפרסום זה.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים תודה ד ר קוגה יוקיקו של המחלקה של פלסטיק, ניתוח לשחזור, Juntendo הספר לרפואה של אוניברסיטת, מתן עצות מעשיות. אנו מודים גם מר מוראטה Hidekazu על סוכרת במרכז של טוקיו של הנשים רפואי הספר לרפואה של אוניברסיטת לתמיכה טכנית מצוינת. מחקר זה נתמך על ידי יצירה של חדשנות המרכזים לתוכנית מתקדם בין-תחומי מחקר אזורים של הפרויקט עבור מערכות מתפתחות חדשנות "תא גליון רקמות הנדסה מרכז (CSTEC)" של משרד החינוך, תרבות, ספורט, מדע, טכנולוגיה (MEXT) של יפן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
α-MEM glutamaxInvitrogen32571-036קרלסבד, קליפורניה
סרום בקר עוברי (FBS)יפן Bioserum Co Ltd.S1650-500
פניצילין/סטרפטומיציןLife Technologies15140-122
קולגנז ARoche Diagnostics10 103 578 001מנהיים, גרמניה
60 ס"מ2 צלחת תרבית רקמות פרימריהBD Biosciences353803פרנקלין לייקס, ניו ג'רזי
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (PBS)Life Technologies1490-144
0.25% טריפסין-אתילנדיאמין חומצה טטראצטית (EDTA)Life Technologies25200-056
L-חומצה אסקורבית פוספט מלח מגנזיום n-הידראטWako013-19641
צלחת תרבית 35 מ"מ מגיבה לטמפרטורה (UpcellTM)CellSeedNUNC-174904טוקיו, יפן
צלחת מיקרו-חמה (MP-1000)Kitazato Science Co., Ltd. 1111
מאוורר מכני מכרסמיםStoelting#50206ווד דייל, אילינוי
4% איזופלורןפייזר יפן114-13340-3טוקיו, יפן
עור מלאכותי (Pelnac® )Smith & אחייןPN-R40060  טוקיו, יפן
חבישה לא דביקה (Hydrosite plus® )Smith & אחיין66800679ידוע בשם Allevyn non-adhessing® < / sup> בארצות הברית
5-0 תפר ניילוןAlfresaEP1105NB45-KF2
20 CELLSTAR TUBESgreiner bio-one227 261
15 מ"ל צינור צנטריפוגהקורנינג משולב430791
14 גולדמן-פוקס periostealHu-FriedyP14שיקגו, אילינוי

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. International Diabetes Federation. IDF Diabetes Atlas, 7 ed.. , International Diabetes Federation. Brussels, Belgium. Available from: http://www.diabetesatlas.org/ (2015).
  2. Boulton, A. J., Vileikyte, L., Ragnarson-Tennvall, G., Apelqvist, J. The global burden of diabetic foot disease. Lancet. 366 (9498), 1719-1724 (2005).
  3. Zannettino, A. C., et al. Multipotential human adipose-derived stromal stem cells exhibit a perivascular phenotype in vitro and in vivo. J Cell Physiol. 214 (2), 413-421 (2008).
  4. Kern, S., Eichler, H., Stoeve, J., Kluter, H., Bieback, K. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells. 24 (5), 1294-1301 (2006).
  5. Casteilla, L., Planat-Benard, V., Laharrague, P., Cousin, B. Adipose-derived stromal cells: Their identity and uses in clinical trials, an update. World J Stem Cells. 3 (4), 25-33 (2011).
  6. Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7 (2), 211-228 (2001).
  7. Zuk, P. The ASC: Critical Participants in Paracrine-Mediated Tissue Health and Function. , (2013).
  8. Nie, C., et al. Locally administered adipose-derived stem cells accelerate wound healing through differentiation and vasculogenesis. Cell Transplant. 20 (2), 205-216 (2011).
  9. Shin, L., Peterson, D. A. Human mesenchymal stem cell grafts enhance normal and impaired wound healing by recruiting existing endogenous tissue stem/progenitor cells. Stem Cells Transl Med. 2 (1), 33-42 (2013).
  10. Okano, T., Yamada, N., Sakai, H., Sakurai, Y. A novel recovery system for cultured cells using plasma-treated polystyrene dishes grafted with poly(N-isopropylacrylamide). J Biomed Mater Res. 27 (10), 1243-1251 (1993).
  11. Yamato, M., et al. Thermo-responsive culture dishes allow the intact harvest of multilayered keratinocyte sheets without dispase by reducing temperature. Tissue Eng. 7 (4), 473-480 (2001).
  12. Sekine, H., et al. Cardiac cell sheet transplantation improves damaged heart function via superior cell survival in comparison with dissociated cell injection. Tissue Engineering Part A. 17 (23-24), 2973-2980 (2011).
  13. Kuhlmann, J., et al. Intramyocellular lipid and insulin resistance: a longitudinal in vivo 1H-spectroscopic study in Zucker diabetic fatty rats. Diabetes. 52 (1), 138-144 (2003).
  14. Slavkovsky, R., et al. Zucker diabetic fatty rat: a new model of impaired cutaneous wound repair with type II diabetes mellitus and obesity. Wound Repair Regen. 19 (4), 515-525 (2011).
  15. Oltman, C. L., et al. Progression of vascular and neural dysfunction in sciatic nerves of Zucker diabetic fatty and Zucker rats. Am J Physiol Endocrinol Metab. 289 (1), E113-E122 (2005).
  16. Coppey, L. J., Gellett, J. S., Davidson, E. P., Dunlap, J. A., Yorek, M. A. Changes in endoneurial blood flow, motor nerve conduction velocity and vascular relaxation of epineurial arterioles of the sciatic nerve in ZDF-obese diabetic rats. Diabetes Metab Res Rev. 18 (1), 49-56 (2002).
  17. Galiano, R. D., Michaels, V., Dobryansky, M., Levine, J. P., Gurtner, G. C. Quantitative and reproducible murine model of excisional wound healing. Wound Repair Regen. 12 (4), 485-492 (2004).
  18. Lin, Y. C., et al. Evaluation of a multi-layer adipose-derived stem cell sheet in a full-thickness wound healing model. Acta Biomater. 9 (2), 5243-5250 (2013).
  19. McLaughlin, M. M., Marra, K. G. The use of adipose-derived stem cells as sheets for wound healing. Organogenesis. 9 (2), 79-81 (2013).
  20. Cerqueira, M. T., et al. Human adipose stem cells cell sheet constructs impact epidermal morphogenesis in full-thickness excisional wounds. Biomacromolecules. 14 (11), 3997-4008 (2013).
  21. Koga, Y., et al. Recovery course of full-thickness skin defects with exposed bone: an evaluation by a quantitative examination of new blood vessels. J Surg Res. 137 (1), 30-37 (2007).
  22. Cianfarani, F., et al. Diabetes impairs adipose tissue-derived stem cell function and efficiency in promoting wound healing. Wound Repair Regen. 21 (4), 545-553 (2013).
  23. Matsuda, K., Suzuki, S., Isshiki, N., Ikada, Y. Re-freeze dried bilayer artificial skin. Biomaterials. 14 (13), 1030-1035 (1993).
  24. Miyahara, Y., et al. Monolayered mesenchymal stem cells repair scarred myocardium after myocardial infarction. Nat Med. 12 (4), 459-465 (2006).
  25. Iwata, T., et al. Cell sheet engineering and its application for periodontal regeneration. J Tissue Eng Regen Med. , (2013).
  26. Elloumi-Hannachi, I., Yamato, M., Okano, T. Cell sheet engineering: a unique nanotechnology for scaffold-free tissue reconstruction with clinical applications in regenerative medicine. J Intern Med. 267 (1), 54-70 (2010).
  27. Watanabe, N., et al. Genetically modified adipose tissue-derived stem/stromal cells, using simian immunodeficiency virus-based lentiviral vectors, in the treatment of hemophilia. B. Hum Gene Ther. 24 (3), 283-294 (2013).
  28. Kim, W. S., et al. Wound healing effect of adipose-derived stem cells: a critical role of secretory factors on human dermal fibroblasts. J Dermatol Sci. 48 (1), 15-24 (2007).
  29. Nakagami, H., et al. Novel autologous cell therapy in ischemic limb disease through growth factor secretion by cultured adipose tissue-derived stromal cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25 (12), 2542-2547 (2005).
  30. Asahara, T., et al. VEGF contributes to postnatal neovascularization by mobilizing bone marrow-derived endothelial progenitor cells. EMBO J. 18 (14), 3964-3972 (1999).
  31. Kato, Y., et al. Allogeneic transplantation of an adipose-derived stem cell (ASC) sheet combined with artificial skin accelerates wound healing in a rat wound model of type 2 diabetes and obesity. Diabetes. , db141133(2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Zucker

מאמרים קשורים