תסיסנית ומערכות hematopoietic יונקים חולקים הרבה מאפיינים משותפים, מה שהופך תסיסנית מודל גנטי אטרקטיבי ללמוד hematopoiesis. כאן אנו מדגימים לנתיחת הרכבה של איבר hematopoietic הגדול זחל אימונוהיסטוכימיה. כמו כן, אנו מתארים שיטות Assay שונים תאי hematopoietic זחל כולל hemocytes במחזור ותאי קריסטל נייחים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
קבלות רבות קיימות בין תסיסנית ומערכות hematopoietic יונקות, למרות תסיסנית חסרות את שושלת הלימפה מאפיינות חסינות אדפטיבית יונקת. תסיסנית hematopoiesis יונק להתרחש שלבים ברורים במרחב ובזמן כדי לייצר כמה שושלות תאי דם. שני המערכות לשמור מאגרים של אבות תא דם שבה להרחיב או להחליף שושלות בוגרות. מערכת hematopoietic מאפשרת תסיסנית ויונק להגיב ולהתאים לאתגרים חיסוניים. חשוב לציין, הרגולטורים תעתיק מסלולי איתות השולטים הדור, תחזוקה, והתפקוד של מערכת hematopoietic שמורים מפני זבובים ליונקים. דמיון אלה מאפשרים תסיסנית לשמש לפיתוח ומחלות hematopoietic מודל גנטי.
כאן אנו מבחני פרט לבחון את מערכת hematopoietic של הזחלים תסיסנית. בבפרט, אנו המתאר שיטות למדוד במספרי תא דם וריכוז, לדמיין שושלת בוגרת ספציפית in vivo, ולבצע אימונוהיסטוכימיה על תאי דם שבמחזור באיבר hematopoietic. מבחנים אלה יכולים לגלות שינויים בביטוי גנים ואת תהליכים תאיים כולל איתות, הישרדות, התפשטות, בידול יכולים לשמש כדי לחקור מגוון רחב של שאלות הנוגעות hematopoiesis. בשילוב עם הכלים הגנטיים הזמינים תסיסנית, יכולים לשמש מבחנים אלה כדי להעריך את מערכת hematopoietic על שינויים גנטיים מוגדרים. אמנם לא התווה במיוחד כאן, מבחנים אלה יכולים לשמש גם כדי לבחון את השפעת שינויים סביבתיים, כגון זיהום או דיאטה, על מערכת hematopoietic.
מבוא
המנגנונים המורכבים המסדירים את גורמי שעתוק מסלולי איתות כי לתאם את הפיתוח של מערכת hematopoietic וכי תקלה במחלות המטולוגיות להישאר ממעטים להבין. גורמי שעתוק אלה מסלולי איתות, כמו גם הוויסות שלהם, הם שמורים ביותר בין תסיסנית יונקי hematopoiesis 1-5. לכן מערכת hematopoietic תסיסנית מייצגת מודל גנטי מעולה להגדיר את המנגנונים המולקולריים השולטים hematopoiesis ומחלות המטולוגיות בסיסיות.
בדומה ליונקים, תסיסנית ליצור תאי דם, המכונה hemocytes, ב במרחב ובזמן שלבים ברורים של hematopoiesis. באופן מסורתי, hematopoiesis תסיסנית
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. במחזור ריכוז Hemocyte
- כדי להשיג זחלים של השלב ההתפתחותי בערך אותו הדבר עבור assay זה, להגביל אוסף ביצה בכך שהוא מאפשר לנקבות להטיל ביצים לתקופת זמן קבועה של 2 - 6 שעות.
- אסוף הזחלים לנתח בארות צלחת מלא בופר פוספט 1x (PBS, טבלה 1).
- עבור כל זחל, מקום 10 μl 1x PBS בצינור microcentrifuge על הקרח 10 μl 1x PBS על כרית לנתח נקי. מניח את המשטח לנתח על בסיס סטראו מואר.
- היבש היה מונ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
במחזור ריכוז Hemocyte
מספרים Hemocyte ותגבר במהלך התפתחות הזחל 35. כדי להמחיש כי שיטה זו מזהה הבדלים במספרי hemocyte וריכוז, ללא קשר לסיבה הביולוגית, מדדנו ריכוזי hemocyte של זחלים מתעכבים ולא להתעכב. פסד של הורמון prothoracicotropic (ptth) על ידי אבלציה גנטי של תאי עצב מייצרי ptth (ptth> עגום) מייצר עיכוב התפתחות זחל 36. עבור.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
עם השינוי גנטי או סביבתי, ארבע השיטות שתוארו כאן ניתן להשתמש בנפרד או בשילוב לנתח תהליכים שונים במהלך hematopoiesis כגון איתות, הישרדות, שגשוג, והבחנת hematopoiesis תסיסנית היא תהליך דינאמי.; מספר hemocytes לכל חיה מגדיל 35 והביטוי מבנה הגן של בלוטת הלימפה משנה 32 במהלך הפיתוח. לפני ביצוע מבחנים אלה, ולכן, חשוב להגביל אוספי ביצים בכך שהוא מאפשר לנקבות להטיל ביצים עבור כמות קבועה של זמן וכדי לאשר את השלב ההתפתחותי הזחל הרצוי. אוספי ביצה קצרים (פחות מ .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים מתחרים או פיננסיים.
תודות
אנו מודים למתיו או'קונל, מרים ג'האנשאהי ואנדראס ג'ני על הסיוע. אנו מודים ל-István Andó על נוגדנים ספציפיים לפלסמטוציטים, ל-Utpal Banerjee על זבובי dome-meso-EBFP2, לג'וליאן מרטינז-אגוסטו על זבובי antp>GFP, ולמייקל או'קונור על זבובי ptth ו>ptthgrim. שיטות אלה פותחו בתמיכת קרן קימל, אגודת הלוקמיה והלימפומה, NIH/NCI R01CA140451, NSF 1257939, DOD/NFRP W81XWH-14-1-0059 ו-NIH/NCI T32CA078207.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| טבליות PBS | MP Biomedicals | 2810305 | |
| צלחת חיתוך | קורנינג | 7220-85 | |
| צינור מיקרוצנטריפוגה | דנוויל | C2170 | |
| משטח חיתוך סיליקון, עשוי ערכת Sylgard 184 | Krayden (מופץ באמצעות פישר) | NC9644388 (מספר קטלוגי של פישר) | מיוצר בצלחת פטרי על ידי ערבוב רכיבים של ערכת אלסטומר סילגארד בהתאם להוראות היצרן. |
| סטריאומיקרוסקופ | Morrell Instruments (מפיץ ניקון) | mna42000, mma36300 | דגמי ניקון SMZ1000 ו-SMZ645 |
| מגבון רקמות | VWR | 82003-820 | |
| מלקחיים | מיקרוסקופיה אלקטרונית | 72700-DZ | |
| p200 פיפטה | Eppendorf | 3120000054 | |
| רוזנת מונה תאים אוטומטי | Invitrogen | C10227 | |
| שקופיות תא ספירת תאים של הרוזנת | Invitrogen | C10283 | |
| המוציטומטר | Hausser Scientific | 3200 | |
| טריפן כתם כחול | Life Technologies | T10282 | |
| פורמלדהיד | פישר | BP531-500 | |
| טריטון | פישר | BP151-500 | |
| טווין 20 | פישר | BP337-500 | |
| אלבומין סרום בקר | Rocky Mountain Biologicals | BSA-BSH-01K | |
| סרום עיזים רגיל | Sigma | G9023-10ML | |
| סרום חמור רגיל | Sigma | D9663-10ML | |
| 200 הוכחה אתנול | VWR | V1001 | |
| N-פרופיל גלאט | MP ביומדיקל | 102747 | |
| גליצרול | VWR | EM-4750 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | פישר | 62248 | |
| צלחת 6 בארות | קורנינג | 351146 | |
| צלחת 12 בארות | קורנינג | 351143 | |
| , 22 מ"מ מרובע | פישר | 12-544-10 | |
| זכוכית כיסוי מיקרוסקופ, 18 מ"מ עגול | פישר | 12-545-100 | |
| זכוכית מיקרוסקופ שקופיות | פישר | 22-034-980 | |
| מחזורי תרמי | Eppendorf | E950010037 | Mastercycler EP Gradient S |
| PCR tubes | USA Scientific | 1402-2700 | |
| 24 בארות | צלחת קורנינג | 351147 | |
| צינור העברה חד פעמי | פישר | 13-711-9AM | |
| פלואורסצנטי מיקרוסקופ | Zeiss | Axio Imager.Z1 |
מקורות
- Evans, C. J., Hartenstein, V., Banerjee, U. Thicker than blood: conserved mechanisms in Drosophila and vertebrate hematopoiesis. Dev Cell. 5 (5), 673-690 (2003).
- Crozatier, M., Meister, M. Drosophila haematopoiesis. Cell Microbiol. 9 (5), 1117-1126 (2007).
- Crozatier, M.....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
