הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

השימוש בניתוח מגזר סומטיים מושרה (ISSA) לימוד גנים ומקדמי המעורבים ביצירת עץ ופיתוח גזע משניים

8.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54553

⸱

5 באוקטובר 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Ecosystem and Forest Sciences, Faculty of Science, The University of Melbourne, 2Victorian AgriBiosciences Centre, La Trobe University R&D Park, 3College of Biological Sciences, Department of Plant Biology, University of California, Davis, 4Department of Genetics, Forestry and Agricultural Biotechnology Institute (FABI), University of Pretoria

במאמר זה

סיכום

כאן אנו מציגים פרוטוקול המאפשר אפיון פונקציונלי של תפוקה בינונית עד גבוהה של מבני גנים ומקדם ברקמת גזע משנית של עץ במסגרות זמן קצרות יחסית. הוא יעיל, קל לשימוש וישים באופן נרחב למגוון מיני עצים.

תקציר

צמיחה של גבעול משני עצי היווצרות העץ הקשורים הן משמעותיות הוא מנקודות מבט ביולוגי ומסחרי. עם זאת, יחסית מעט מאוד ידוע על השליטה המולקולרית שולטת התפתחותם. מדובר בין שאר בשל פיסיים, משאבים ומגבלות זמן קשורים לעתים קרובות עם בחקר תהליכי גדילה משניים. מספר טכניקות במבחנה שימשו מעורבים או חלק הצמח או מערכת הצמח כולו בשני וודי מיני צמחים שאינם מעוצים. עם זאת, שאלות על תחולתן לחקר תהליכי צמיחה של גבעול משני, הסרבנות של מינים מסוימים עוצמת עבודה הן לעתים קרובות מונעת על מדיום ליישומי תפוקה גבוהים. כמו כן, כאשר מסתכלים היווצרות פיתוח ועץ גזע משתי התכונות הספציפיות תחת החקירה עלולות רק להיות מדידות מאוחר מחזור החיים של עץ לאחר מספר שנים של צמיחה. בהתמודדות אלטרנטיבת האתגרים הללו in vivo protocols פותחו, בשם מושרה ניתוח מגזר סומטיים, אשר יש בהם משום יצירת סקטורים רקמות סומטיות מהונדס ישירות בגזע המשני של הצמח. מטרת פרוטוקול זה היא לספק אמצעי יעיל, קל ומהיר יחסית כדי ליצור רקמות צמח משני מהונדסות עבור גן ואפיון פונקציונלי אמרגן שניתן לנצלם במגוון של מיני עצים. התוצאות המוצגות כאן עולה כי המגזרים גזע משני מהונדס יכול להיווצר בכל רקמות חיות סוגי תאים משני גבעולי מגוון של מיני עצים וכי תכונות מורפולוגיות עץ כמו גם דפוסי ביטוי האמרגן ב משנית נובעת ניתן להעריך בקלות להקל בינוני עד גבוה אפיון פונקציונלי תפוקה.

מבוא

עץ נובע מהווה כמות משמעותית של ביומסה הכוכבית הלכת הם בעלי חשיבות ומסחרית ביולוגית, תרבותיות עצומה. משני נובע ליצור בית גידול על ידי מתן משאבים ומחסה למצוא צורות חיים רבות אחרות. הם מספקים שירותים רבים אחרים אל המערכות האקולוגיות הם מאכלסים ולפעול כמשאב מתחדש לייצור עץ, עיסת נייר ועץ אחרים מוצרים שאינם עץ. פיתוח גזע משני ובאופן ספציפי היווצרות עץ נשלט על ידי מערכת מולקולרית מורכבת המווסתת את הפיתוח של סוגי תאים מסוימים, את ההרכב הביוכימי של קירות התא שלהם וכיצד הם מסודרים ליצירת רקמות ואיברים. לנתח את הבסיס המולקולרי של פיתוח גזע משתי היווצרות עץ נאלץ להתמודד על ידי גורמים רבים, כוללים ההשתנות של מאפייני עץ גזע בתוך ובין נובעת, משך דור ארוך, מערכות הזדווגות מחוץ למעבר, הטרוזיגוטיות גבוהה, עומס גנטי גבוה, תרדמת עונתית, ארוך בּוֹגֵרתקופות הקמת תכונה ואת הגודל הפיזי העצום של עצים בוגרים. כתוצאה מכך, הבנה של יחסי פיתוח גזע משניים הידע המפורט של רוב ההיבטים האחרים של הבקרה המולקולרית של התפתחות צמח, הוא עדיין בחיתוליו.

מספר טכניקות במבחנה שמשו ללמוד ולהבין פיתוח גזע משני, בעץ מסוים היווצרות דופן תא משנית. פרוטוקולים אלה כרוכים בשימוש צמח כולו או מערכות חלק צמח, שם גם צמחיים מהונדסים נוצרים או תאים משני ספציפיים או רקמות הופכים לחקר היבטים הספציפיים של עץ ו / או פיתוח גזע מהשני 1. ניתן לשחזר צמחים טרנסגניים פוסט שינוי גנטי ממגוון רחב של רקמות צמח סוגי תאים, עם זאת, ההתקדמות היא איטית, במיוחד בעת ניתוח תכונות סיביות עץ בשל התחדשות ארוכה נובעים פעמי התבגרות (לפי סדר שנים), גבוה טכנית deman העבודהds, תפוקה נמוכה של גנים מועמדים כמו גם קשיים הפצת כמה מיני צמחים עציים. טכניקות דומות פותחו במערכת מודל שאינו עצית, כגון ארבידופסיס כי בהצלחה להתגבר על כמה מגבלות אלה, אך לא כל סוגי תאי גזע משני מתנה אלה גבעולים תכונות הקשורות עונתי או אריכות ימים לא ניתן ללמוד מינים כגון 2. לחלופין, מערכות חלק הצמח, כגון תרבויות יבלת radiata s pinu 3 לצמצם את לוחות הזמנים הכרוכים בכך. שיטות אלה עם זאת מוגבלים המחקר של סוג תאים בודדים סובלים אילוצים דומים כאמור לניסויים במבחנה. בדומה לכך, תרבויות גזע פסגה 4 מעורבי explants כל הגבעול הראו הבטחה אבל עדיין לא יושמו לחקר גנים ספציפיים או מקדמים של עניין. לאחרונה, פרוטוקול חלופי מעורבים תרבויות שורש שעיר פותחה עבור האקליפטוסים והוא מיושם בהצלחה5 מיושם, עם זאת, שיטה זו עדיין דורשת בטיפוח במבחנה, כרוך שורשים משניים ולא גבעולים עד היום הוא מוגבל מין עץ בודד.

ניתוח מגזר סומטיים מושרה (ISSA), כפי שמתואר כאן, פותח כדי להתגבר על כמה בעיות אלה מתן מדיום לכלי הקרנה פונקציונלית קצב העברת נתונים גבוהים עבור גנים ומקדמים עם תפקידים חשודים במבנה עץ התפתחות רקמת גזע משני. ISSA היא מערכת טרנספורמציה והקרנת vivo שבו פותחה כדי לצמצם את הזמן שנדרש כדי לייצר תאים מהונדסים ורקמות בתוך גזע משני שלמים תוך ההתגברות על עבודה, מגבלות טכניות ותפוקה של בשימוש שיגרתי בשיטות במבחנה. הפרוטוקולים המתוארים כאן לאפשר את הקמתה סימולטני של מאה מגזרי רקמות שינו באופן עצמאי תאים משני נובע בתוך פרק הזמן קצר, ב מיני עצים ורקמות של עניין ללא genetic ו / או סביבתי וריאציה בתוך מסגרות זמן קצרות יחסית ועלות עבודה נמוכה. טכניקות vivo ב ISSA תוארו לראשונה עבור רקמות משני גזע 6 ו ניצן 7 ויש לי מאז שוכללה ברקמת גזע משני באמצעות מחקרים של גנים ו / או מקדמי המעורבים בידול cambial וכוללים: טובולין (גיגית) 8, arabinogalactan דמוי fasciclin ( FLA) 9, synthase תאית (CESA) 10, תחום NAC הקשורים דופן התא המשני (SND2) 11, ARBORKNOX (ARK1) 12 ובאמת גן חדש מעניין (RING) H2 חלבון 13. מחקרים אלה נערכו משני גבעולי צמחי צפצפת eucalypt ותובנות הניתנים לתוך מורפולוגיה תא, כימית דופן תא ביטוי גנים.

הפרוטוקולים המתוארים כאן נועדו להפגיש את חווייתידע nd שנרכש באמצעות הפיתוח והיישום של ISSA מתוך מגוון רחב של מחקרים שפורסמו וכן פורסמו בעשור האחרון. הם מתמקדים טרנספורמציה in vivo של רקמות גזע משני 6 ולהתרכז מחקרים שכללו שיבוט 'pyramidalis' Populus alba, אקליפטוס Globulus וכן 11 שיבוטים אקליפטוס Globulus x camaldulensis. מסמך זה לוקח חוקרים באמצעות הפרוטוקול מן גידול צמחים וחיידקים, טרנספורמציה של רקמות גזע, צמיחת קציר של רקמות, זיהוי תאים מהונדסים ורקמות, הכנה והערכות פנוטיפי ושיטות לאיסוף והניתוח של נתונים. בעוד טכניקות יושמו בהצלחה למדוד רכב monosaccharide דופן תא גם 9,11, בשל מגבלות מקום, מסמך זה מתרכז בטכניקות המשמשות למדידת תא ומורפולוגיה רקמות בהבנת דפוסי ביטוי גנים משני stEMS בלבד. לפיכך, הפרוטוקול כפי שמתואר מתאים לאלו המעוניינים לקבל תובנה מעמיקות יותר לתוך התפקיד ו / או הביטוי של גנים הקשורים משני גבעולים באמצעות עלות נמוכה, מבחינה טכנית קלה, בינונית עד שיטת העברת נתונים גבוהה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת חומר צמחי

  1. לפני ניסויים, להעלות שתילים חדשים של מיני עצים המועדף מזרע או חיתוך ולגדול עץ / ים עד קוטר של גזע באזור המיועד לניסויים הוא כ 1 ס"מ קוטר.
    הערה: משך הזמן הנדרש עשויים להשתנות עקב שיעורי גידול צמחים ולכן מאפשרים בין שלושה עד תשעה חודשים של שלב זה.

2. בינארי וקטור בריא

  1. לנהל עבודה סעיף זה לסעיף 7 במעבדה או חממה שבה tumefaciens Agrobacterium ניתן לטפל וכי ציוד מגן אישי מתאים שנקבע במעבדה משמש.
  2. הכין וקטור בינארי המכיל גם גן של מציאת ריבית או קלטת ביטוי יתר וקלטת גן כתב β-glucuronidase (גאס) או אמרגן של העניין התמזג גן גאס בהתאם לסוג של מחקר.
    הערה: ישנם מספר BAC וקטור בינאריkbones כי ניתן מקורות מסחריים או דרך רשתות מחקר וכן טכניקות רבות הזמינות להכניס גנים ומקדמי עניין לתוך וקטורים בינאריים. בהקשר של פרוטוקול זה תלוי אך ורק את הנסיין לקבל את ההחלטה על איך ליצור וקטור בינארי.
  3. Transform וקטור בינארי לתוך זן מנשקו של א tumefaciens באמצעות הלם electroporation או חום 14 ולאחסן כראוי עד הצורך לניסויים.
  4. חזור על שלב 2.2 עבור כל חיובי ו / או שולט שלילי.
    הערה: בקרות שליליות צריכות לכלול וקטור בינארי המכיל לא גן של עניין עבור גן לימוד זיקה בם גאס promoterless עבור אמרגן של מחקר עניין. בקרה חיובית עבור אמרגן של מחקר ריבית צריכה לכלול אמרגן 35s וירוס כרובית פסיפס (CaMV35s) התמזג עיתונאי גאס.

3. הכנת א tumefaciens עבור חיסון

  1. לפחות שבוע לפני experimentation, לקחת כמות קטנה (כ 1 μl) של א tumefaciens מוכן במהלך שלב 2.2 ו -2.3 ולהפיץ דק על מצע נפרד LB עם אגרתי 14 צלחות המכילות אנטיביוטיקה מתאימה לבחירת חיידקים. לגדול ב 28 ° C באינקובטור ליצור מושבות קטנות ולאחר מכן לאחסן ב 4 ° C עד הצורך.
  2. 48 שעות לפני ניסויים, להעביר מושבה אחד א tumefaciens מכל הצלחת לתוך 50 מ"ל נפרד בורג צינורות העליון המכיל 5 מ"ל של טרום התחמם (28 ° C) התקשורת LB 14 המכיל אנטיביוטיקה מתאימה הבחירה חיידקים להתסיס ב 200 סל"ד על חממה שייקר במשך כ -48 שעות ב -28 מעלות צלזיוס עד תערובת מאוד מעונן.
  3. בין 4-6 שעות לפני חיסון גבעולי צמחים (סעיף 4) להוסיף 1 מ"ל של א LB / tumefaciens תערובת לתוך 50 מ"ל טריים לדפוק צינור עליון המכיל 19 מיליליטר (01:20 דילול) של חם הטרי (28 מעלות צלזיוס) LB תקשורת עם אנטיביוטיקה מתאימהמבחר חיידקים. אם צפיפות אופטית (OD) ב 600 ננומטר (OD 600, כפי שהיא נמדדת על ידי ספקטרוסקופיה) היא מעל 0.1, לדלל עוד יותר עם חמי LB ועד להשגתו.
  4. מניחים מדולל LB / א tumefaciens תערובת בחזרה על החממה שייקר ולנער באותם התנאים (200 סל"ד, 28 ° C) עד OD 600 היא בין 0.4-0.6 ולהסיר.
  5. צנטריפוגה LB / א tumefaciens התערובת במשך 15 דקות XG ב 1000 ו 4 ° C.
  6. למזוג נוזל ומיד resuspend א tumefaciens גלולה לתוך 1 מ"ל של מקורר התקשורת MS 15, להעביר 2 מ"ל microtube ולאחסן על הקרח עד נדרש חיסון (סעיף 4). פתרון זה נקרא הרכבת מדיה.

הרכבת חיסון 4. של צמח גזע עם א tumefaciens

  1. התחל ניסויים במהלך סוף האביב או בתחילת הקיץ באמצעות צמחים נוצרו בסעיף 1 כי יש cambium פעיל מצמיחה מהירה. אבחון טוב עבורcambium גדל פעיל ומהיר הוא כי השיפה ניתן קלופים בקלות מן העצה.
  2. מצא קטע ישר ברור של גזע ליד הבסיס של הצמח ולהסיר עלים וענפים.
  3. באמצעות אזמל חד (רצוי מס '11) או סכין גילוח, ליצור "חלון cambial' 1 סנטימטר 2 ב קטע ברור של גזע על ידי החדרת שני חתך מקביל אנכי דרך השיפה של 20 מ"מ אורך ו מ"מ אחד 5 מזה אז חתך אופקי המחבר את שני חתכים אנכיים בקצה הבסיסי שלהם.
  4. מקלף את רצועת השיפה נוצרה על ידי החתך כלפי מעלה חשיפת רקמת העצה לפתח ולהוסיף מדיה חיסון מספיק משלב 3.6 להרטיב את פני השטח של עצת הפיתוח נחשף בעזרת פיפטה (בדרך כלל 5-10 μl). מיד והכנס מחדש את רצועת השיפה.
  5. לחייב את רצועת השיפה לגבעול באופן הדוק עם Parafilm.
  6. חזור על שלבי 4.2 כדי 4.5 כל חלונות cambial נוספים עבור הגן (ים) או אמרגן (ים) של עניין יצירהניו cambial חלונות לפחות 1 ס"מ מעל או מתחת לחלונות cambial אחרים בכל 90 ° לקזז.
  7. צעדים שלמים 4.2 ל 4.5 וקטורי השליטה חיובית ושלילית (שלב 2.4) להבטיח כי כל וקטור מתווסף אותו השורש של כל צמח השתמש בניסוי.
  8. צג צמיחה קוטר גזע מעת לעת הקציר עבור assay גאס (סעיף 5) כאשר הצמיחה רדיאלי של 5 מ"מ לפחות נצפתה הגבעולים.
    הערה: כמות צמיחה רדיאלי שצריך זה תלוי בכמות של רקמת הנדרש לניתוח במורד הזרם.

קציר 5. עבור גאס היסטולוגית Assay

  1. ובלו 'חלון cambial' מן הגבעול הסרת כל רקמה לא חלק הצמיחה חדשה בתוך חלון cambial.
    1. עבור מחקרים הנוגעים להבשיל עצה ומורפולוגיה תא / רקמות השיפה, לקלף את השיפה מן העצה.
    2. עבור מחקרים שבהם אזור cambial נדרש להישאר דפוסי ביטוי שלם או האמרגן יש להעריךed, פורסים את חלון cambial רוחבי באמצעות סכין גילוח או סכין חדה אחרת לתוך דיסקים של בין 0.5 ו 1 מ"מ עובי.
  2. מניח רקמות חלון cambial מעובדות 14 מיליליטר עגול צינורות תחתונים ולשטוף פעמי חיץ פוספט 0.1 M ב- pH 7 14. ודא כי הרקמה היא שקועה לחלוטין, נשאר בתמיסה במשך חמש דקות לפחות וכל הפתרון העודף מוסר בסוף השטיפה השנייה.
  3. הוסף 5 מ"ל של ריאגנט גאס (0.5 מ"מ X-gluc (חומצה 5-bromo-4-כלורו-3-indolyl-β-D-glucuronic), 10 mM EDTA, 0.5% Triton X-100 V / V, 0.5 מ"מ אשלגן ferricyanide (III), 0.05 פרוציאני אשלגן מ"מ (II), עשה עד נפח סופי עם 0.1 מ"מ פוספט חיץ pH 7;. לראות הוקינס ואח 16) על צינור אחד. אם הרקמה אינה שקועה לחלוטין, להוסיף מגיב גאס נוסף.
  4. דגירה צינורות במשך 10 דקות ב 55 ° C בחושך.
  5. דגירה צינורות עבור שעות 12-16 נוסף על חממה שייקר ב 37 ° C בחושךבאמצעות תסיסה עדינה (בין 30 ל 60 סל"ד), כדי לאפשר ערבוב.
  6. לאחר ההסרה מן החממה שייקר אקראי לבדוק את ה- pH של מגיב גאס בתוך קבוצה קטנה של צינורות באמצעות נייר לקמוס עם מגוון pH 0-7.
    1. אם כל אחד הצינורות יש pH מתחת ל -6 ואז לתייג אותם. המשך לבדוק את שאר הצינורות כדי לאשר את ה- pH ואת התווית אם pH הוא 6 או מתחת.
      הערה: דוגמאות עם pH מתחת ל -6 ואינן מתאימות לניתוח. יש דוגמאות אלה להיכלל לניתוח נוסף.
  7. למזוג גאס מגיב ולהחליף עם אתנול 70% מספיק כדי לכסות רקמות.
  8. חנות ב 4 מעלות צלזיוס עד הצורך.

זיהוי 6. של רקמות מהונדסות

  1. בעזרת מלקחיים, להוציא את כל רקמת חלון cambial משפופרת ומניחה מגש קטן או צלחת פטרי כדי לאפשר להדמיה מיקרוסקופית.
  2. באמצעות מיקרוסקופ לנתח בין 1X והגדלה 4X, לזהות לספור את מספר תאים או רקמותקבצים שיש להם כתמים כחולים בהירים. תאים או רקמה צבעוניים הכחולים מכונים כמגזר מנקודה זו ואילך. טלי אותם בדרכים הבאות.
    1. לקבלת דוגמיות שבו השיפה הוסר (שלב 5.1.1), לספור את מספר סקטורים ברקמת cambial נמצא על פני השטח של העצה מתפתחות (המגזר cambial, איור 1 א).
    2. לקבלת דוגמיות כי קוצצו לתוך דיסקים (שלב 5.1.2), לספור את המגזרים מספר נמצא סוגי תאים או רקמות שונות (1b, 1c, 1D). מגזרים ניתן למצוא סוגי רקמות הבאים: periderm (המגזר periderm, איור 1e), השיפה (המגזר השיפה, איור 1F), רקמות cambial (המגזר Cambial, איור 1G, 1h, ט 1), parenchyma הפצע (פצע מגזר parenchyma, 1J איור) וב tyloses (המגזר Tylose, איור 1k).
      1. במהלך מיקרוסקופיssessment להבטיח ששני הצדדים של דיסק נצפו וכי מגזרים המתרחשים על פני שני דיסקים מותאמים כך מספרים אינם להפריז.
  3. המקום היחיד המגזרים המכיל רקמות בחזרה לתוך שפופרת המכילה 70% אתנול ו החנות עד הצורך.
  4. חזור על שלב 6.1 כדי 6.3 של חלונות cambial נוספת כולל השליטה החיובית ו / או שלילית.
  5. חשב את יעילות השינוי הממוצע עבור כל סוג במגזר עבור כל גן או האמרגן של עניין והבקרות בנפרד על ידי חלוקת סך של המגזרים במספר הכולל של חלונות cambial 1 ס"מ 2 לגזור מספר ממוצע של אירועים טרנספורמציה לס"מ 2 של cambium מחוסן (ATScm -2).
  6. עבור לשלב 7.2 ו -8 עבור ניתוח דפוסי ביטוי אמרגן צעד 7.1, 7.2 או 7.3 עבור טכניקות להעריך תא ומורפולוגיה רקמות ברקמת cambial.

7. ניתוח שלמורפולוגיה תאים ורקמות רקמות Cambial

הערה: להלן מבחר של טכניקות אשר שימשו בהצלחה לניתוח של ISSA נגזר דגימות.

  1. ניתוח של שטח תא עצה, אזור לומן, עובי דופן תא ואזור דופן תא באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM).
    הערה: פרוטוקול זה דורש הכנת מדגם מינימאלית ומאפשר העברת נתונים גבוהות יחסי של ניתוח מגזר הנוגע תכונות המורפולוגיות התוו.
    1. משלב זה ואילך בבקשה להבטיח מעבדה מעיילת, הגנה וחקר עיני כפפות משמשות בכל פעם רקמות וודי מטופל ומטופל.
    2. זהה את מגזר cambial לניתוח ולעשות חתך כ 0.5 מ"מ מכל צד של אותו באמצעות סכין גילוח קצה יחיד ליצור (איור 2 א) דיסק.
    3. חתוך את רקמת עצה עודפת עוזב כ 1 מ"מ של רקמת עצה לצד המשיק של הסקטור (איור 2b).
    4. זָהִירly לחתוך רוחבי דרך המרכז במגזר באמצעות סכין גילוח כפול קצה טרי (איור 2 ג).
    5. לעשות שני חתכים רדיאליים רדוד נוספים על המטוס הרוחבי משני צדי מגזר לתחום הרקמה המהונדסת (איור 2). כפי מכתים גאס לא תחדור עמוק לתוך הרקמה לבצע יחד את הקבצים רדיאלי של תאים משני צדי רקמה צבעונית נמצאים על פני שטח cambial.
    6. צרף הפנים cambial במגזר מוכן עד שלב של בדל סיכה SEM הר באמצעות קלטת מוליך SEM (איור 2E) ולשמור על ייבוש עד הצורך להדמיה SEM.
    7. חזור על שלבי 7.1.2 עד 7.1.6 עבור סקטורים נוספים לרבות אלה מהשליטה השלילית.
    8. באמצעות SEM במצב ואקום נמוך (kV אנרגיה 5, במקום 3.0 ננומטר), לחזות לצלם תמונות של תאים / רקמות בתוך המגזר וכן רקמת תאים / ישירות בסמוך במגזר (איור 2F). כמות ההגדלהתלוי בתכונות של עניין. לסיבי עצה, 2,000X מתאימה (2G איור).
    9. פעם במגזר cambial כבר דמיין ותצלומים שצולמו הגדלה מתאימה, למדוד עצת תא / רקמות תכונות מורפולוגיות של עניין באמצעות תוכנה למדידת תמונה.
    10. לניתוח סטטיסטי, מתחייב pairwise מספר ניתוחים באמצעות מבחני t מזווגים להשוות את ההבדל בין מורפולוגיים נמדדו במגזר המהונדס ותאי שליטה הלא המהונדס הסמוכים / הרקמות (נמדדו בתוך 0.5 מ"מ מקצה מגזר) לכל מגזר לקבוע p -ערך.
    11. חזור על שלב 7.1.10 עבור הביקורת השלילית.
      1. במקרים בם השליטה החיובית מראה p-value נמוך (α <0.05), לחשב את ההבדל בין מהונדס ותאים הלא מהונדס סמוך / רקמות אחראיות לתכונה מורפולוגיים. השתמש ב 'ערך ההבדל "זה מבחן t-מזווג כדי להשוות את האפקט של הגן של עניין עם negative הבקרה כדי לקבוע א-ערך p.
  2. ניתוח histochemical של תא cambial / מורפולוגיה רקמות או ביטוי אמרגן דפוסים ברקמות גזע תאים / באמצעות מיקרוסקופ אור.
    הערה: בעוד זמן רב יותר, שיטה זו מאפשרת אפשרויות ניתוח נוספות, כולל היבטים של דינמיקת cambial, למשל, רוחב cambial כמו גם דפוסי ביטוי אמרגן. בנוסף, אם אין אפשרות לגשת SEM, פרוטוקול זה יכול לשמש כחלופה עבור צעד 7.1.
    1. במגזר ובלו של עניין באמצעות סכין גילוח וכמה רקמה שמסביב כמו קוביות קטנות (לא יותר מ 1 מ"מ 3) ומניחים ישירות 1-3 מיליליטר של 100% אתנול בבקבוקון מדגם עם כובע בורג עבור 2 ימים לפחות ב 4 ° C על שייקר. הכן את הבלוק הקטן באופן שיאפשר את פני השטח של עניין ונגיש באמצעות microtome.
    2. חזור על פעולה עבור כל מגזרים נוספים כולל אלה מהשליטה השלילית.
    3. הסר נוזלי ולהחליף עם 25% אתנול: 75% תערובת לבנה LR עבור 2 ימי שמירה על תנאים.
    4. חזור על שלב 7.2.3 עם 50% אתנול: לבן 50% LR, 25% אתנול: 75% LR לבן ולבסוף פעמיים עם לבן 100% LR.
    5. מקם את הבלוק קטן Embedding עובש עם פני השטח של עניין מיושר הקצר ומכסים בזהירות עם לבן טרי LR לפלמר לפי הוראות היצרן.
    6. חותכים 5 מיקרומטר חלקים ממשטח ריבית על microtome סיבובית ו הר בשקופית זכוכית. השתמש Safranin O (0.01%) מכתים לדמיין דופן התא ו / או תכונות אחרות.
    7. הוסף מדיה הרכבה, במקום להחליק לכסות ולאפשר להגדיר לילה.
    8. צפה תחת מיקרוסקופ אור בין הגדלה 100X ו 600X ו לכידת תמונה.
    9. לכידת תכונות מורפולוגיות מן התמונות באמצעות תוכנת מדידת תמונה.
      1. לניתוח סטטיסטי של תכונות מורפולוגיות כמוני, בצע על משלב 7.1.10.
      2. לניתוח איכותי של תכונות מורפולוגיות,להשוות לתאר דפוסים שנצפו עבור הגן או האמרגן של ריבית שלילית ו / או בקרה חיובית.
  3. ניתוח של מיקרופיברילות זווית (MFA) בסיבים macerated באמצעות מיקרוסקופ אור.
    1. מהונדס והבלו רקמת העצה ישירות מתוך מגזר וכן מרקמות הלא מהונדס הסמוכים לו (בתוך 0.5 מ"מ, איור 2H) ומניחים צינורות 1.5 מ"ל נפרד. חזור על פעולה עבור כל מגזרים נוספים כולל אלה מהשליטה השלילית.
    2. פעולות מלאות 7.3.3 כדי 7.3.5 במנדף.
    3. הוסף 250 μl של מי חמצן ו -250 μl של חומצה אצטית קרחונית על צינור אחד.
    4. מניח צינורית הגוש חום 90 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות ב במנדף.
    5. הסרה של רקמה משפופרות ובזהירות לשטוף עם מים מזוקקים לפחות פעמיים.
    6. באמצעות תקשורת הרכבה מסיסה במים, הר רקמות בשקופית זכוכית ניסיתי להפריד עם מלקחיים חדים לפני ההדבקה להחליק את מכסה.
    7. נוףתחת מיקרוסקופ תמונות ולכידות לאור סיבים בודדים בהגדלה גדולה יותר 400X.
    8. כדי לקבוע זווית מיקרופיברילות של סיבים, למדוד את הזווית בין הפתחים הבורים ו / או פסי קיר תא לבין ציר הזמן של הסיבים (האיור 2i) באמצעות תוכנת מדידת תמונה.
    9. לניתוח סטטיסטי, בצע על משלב 7.1.10.

8. ניתוח של יזם דפוסי הביטוי

  1. ניתוח של דפוסי ביטוי יזם ברקמות גזע משתיים.
    1. טלי שכיחותה של כל סוג במגזר עבור האמרגן של עניין, כמו גם בקרות חיוביות ושליליות כאמור בשלב 6.2.2.
    2. השווה את התדירות של סוגים במגזר השונים עבור האמרגן של עניין עם השליטה החיובית באמצעות בדיקות צ'י מרובעות להקים-ערכי p. ניתוח נוסף של סגוליות תא / רקמות יכול להתבצע באמצעות צעד 7.2 כנדרש.
      1. אם יותר אמרגן אחדעניין נחקרת מכן חזור השוואת עשיית ניתוח זה בין כל היזמים של ריבית השליטה החיובית.
      2. אם סקטורים או כתמים כחולים הם נצפו בבקרה שלילית ואז להוסיף את זה בניתוח או לנטוש תלוי במידה או אם מכתים אנדוגני חשוד (ראה דיון).
  2. ניתוח של דפוסי ביטוי יזם במהלך פיתוח נגזרי Cambial והבחנה.
    1. באמצעות מיקרוסקופ לנתח, לחזות את כל המגזרים cambial (איור 1g, 1h, 1i) שזוהה בשלב 6.2 ולקבוע את נוכחות / היעדרות של כתמים כחולים בסוגים שלוש רקמות נגזר cambium; השיפה (P), פיתוח עצה (X1) או רקמות עצה מפותחות (X2) (ראה איור 3 א).
    2. כמו לכל צעד 8.1.2, להשוות את התדירות של נוכחות / היעדרות של מכתים גאס ב P, אזורי X1 ו- X2 של אמרגן של interest עם השליטה החיובית באמצעות בדיקות צ'י מרובעות להקים-ערכי p. ניתוח נוסף של סגוליות תא / רקמות יכול להתבצע באמצעות צעד 7.2 כנדרש.
      1. עיין בשלבים 8.1.2.1 ו 8.1.2.2 עבור שיקולים נוספים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

שימוש בפרוטוקול זה כל סוגי תאים ורקמות גזע משני חיים הוכחו להיות רגישים א tumefaciens טרנספורמציות הוגדרו לתוך סוגים במגזר בהתאם לסוג תא טרנספורמציה בתחילה וזה דפוס הצמיחה התפתחותי שלאחר מכן. סוגי מגזר כוללים periderm, השיפה, cambial, פצע parenchyma ו tylose (1b, 1c, 1D) וניתן למצוא במקומות עקביים לתאר ביתר פסק זו. מגזר periderm מורכב מקבוצה של תאים טרנספורמציה נמצא באופן בלעדי periderm ול...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול ISSA הוא שיטה פשוטה יחסית ויעילה ליצירת רקמות גזע מהונדסת מיני עצים במרחב של כמה חודשים לניתוח של גנים ומקדמים של האינטרס הכרוך עץ גזע היווצרות. מעט מאמץ, מעבר שמירת צמחים בחיים, נדרש לגדל רקמות גזע מהונדסות הבאות חיסון אשר עומד בניגוד לשיטות במבחנה שבה culturing הנרחב נדרש לשמור רקמות או צמחים, שבו ייצור עץ עשוי להימשך עד שנה כדי להתחיל או שם אמיתי גזע משני אינה נוצרת 1. ISSA גם הוכח לחול על מגוון רחב של מיני עצים, כולל מינים של הסוג של Populus,

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

המחברים מבקשים להכיר בתמיכה במימון היבט של העבודה באמצעות מענקי קישור LP0776563 (GB, AS) ו-LP0211919 (GB) ושותפים בתעשייה Sappi ו-Mondi, כמו גם פרס אוסטרלי לתואר שני (EM) ממועצת המחקר האוסטרלית ופרס החדשנים והמדענים הצעירים באמצעות משרד החקלאות האוסטרלי (LT). אנו רוצים גם להודות לזנדר מייבורג, צ'ינג וואנג, קולין מקמילן וסיימון סאות'רטון על הדיונים והרעיונות הרבים שהם העלו במהלך פיתוח פרוטוקול זה ולמרטין ראניק, מיניק דה קסטרו, חוליו נג'רה, ואלרי פרסיאנט, אנג'ליק מנואל ונואמי דפקס על הסיוע בעבודה הקשורה למעבדה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צמחיםNANAאנא התייעץ עם ספקי משתלות מקומיים לצמחים לפי הצורך
זן AgrobacteriumNANAישנן דרכים אפשריות רבות להשיג זני Agrobactrium. אנו מציעים לך לעקוב בקהילת המחקר המקומית שלך מכיוון שעשויות להיות הגבלות בהשגת החיידקים במדינה ובאזור שלך.
וקטור בינארי (גן ומקדם)NANAפיתחנו מגוון וקטורים שיתאימו לפרוטוקול ISSA באמצעות מערכת Gateway Recombinse. זה כולל ביטוי יתר, נוקאאוט RNAi וקטורי היתוך מקדם המבוססים על וקטורי pCAMBIA ששונו ושמחים לספק לפי הצורך. בנוסף, ישנם וקטורים רבים הזמינים לקהילת המחקר.
LB mediaSigmaL3022ניתן להשיג את אותו מוצר מחברה אחרת
LB media עם אגרSigmaL2897מוצר דומה יכול להיות מקורו מחברה אחרת
אנטיביוטיקהSigmaNAהמספר הקטלוגי יהיה תלוי באנטיביוטיקה הדרושה לך מכיוון שמגוון אנטיביוטיקה משמשת לבחירת חיידקים בווקטורים בינאריים. מוצר זה יכול להיות מקורו ב-a  מגוון חברות
50 מ"ל צינורות בורג עליוניםפישר סיינטיפיק14-432-22ניתן להשיג את אותו מוצר מחברה אחרת
2 מ"ל MicrotubeWatson Bio Lab132-620Cניתן להשיג את אותו מוצר מחברה אחרת
MS MediaSigmaM9274ניתן להשיג את אותו מוצר מחברה אחרת
להב אזמל מס' 11SigmaS2771ניתן להשיג את אותו מוצר מחברה אחרת
Parafilm "M"BemisPM996זהו המוצר הטוב ביותר לשימוש כדי לקשור את החלון הקמביאלי לאחר היצירה 
צינורות תחתונים עגולים 14 מ"לThermo Scientific150268ניתן להשיג את אותו מוצר מחברה אחרת
EDTASigmaE6758ניתן להשיג את אותו מוצר מחברה אחרת
TritonSigmaX100ניתן להשיג את אותו מוצר מחברה אחרת
X-GlucX-GLUC ישירתצטרך להיכנס לאתר כדי להזמין - http://www.x-gluc.com/index.html
אשלגן פריציאניד (III)סיגמא244023ניתן להשיג את אותו מוצר מחברה אחרת
אשלגן פרוציאניד (II)סיגמאP9387ניתן להשיג את אותו מוצר מחברה אחרת
נייר לקמוססיגמאWHA10360300להשיג את אותו מוצר מחברה אחרת
סכין גילוח קצה יחידProSciTechL055ניתן להשיג את אותו מוצר מחברה אחרת
סכין גילוח כפולקצה ProSciTechL056ניתן להשיג את אותו מוצר מחברה אחרת
SEM Pin StubProSciTechGTP16111ניתן להשיג את אותו מוצר מחברה אחרת
בקבוקון לדוגמא עם מכסה בורגProSciTechL6204ניתן להשיג את אותו מוצר מחברה אחרת
אתנולסיגמאE7023אותו מוצר יכול להיות מקורו בחברה אחרת
LR לבןProSciTechC025ניתן להשיג את אותו מוצר מחברה אחרת
הטמעת עובשProSciTechRL090אנו ממליצים על מגוון זה, אולם יש הרבה אפשרויות זמינות
Water Soulable הרכבהProSciTechIA019דוגמה אחת למדיית הרכבה שניתן להשתמש בה, אולם קיימות אפשרויות אחרות וניתן לבחון אותה.
מי חמצןסיגמא216763מוצר דומה יכול להיות מקורו מחברה אחרת
חומצה אצטית קרחוניתסיגמאA9967מוצר דומה יכול להיות מקורו מחברה אחרת
Safranin OProSciTechC138מוצר דומה יכול להיות מקורו מחברה אחרת
Quanta Environmental Scanning Electron MicroscopeFEIזהו המכשיר ששימש בחלק ממחקר זה, אך ניתן להשתמש בכל SEM אחר שיש לו מצב ואקום נמוך ניתן להשתמש
בתוכנתמכתובת האתר הבאה http://rsbweb.nih.gov/ij/
ניתן הדמיה ImageJ

מקורות

  1. Spokevicius, A. V., Tibbits, J. F. G., Bossinger, G. Whole plant and plant part transgenic approaches in the study of wood formation - benefits and limitations. TPJ. 1 (1), 49-59 (2007).
  2. Chaffey, N. Wood formation in forest trees: from Arabidopsis to Zinnia. Trends Plant Sci. 4 (6), 203-204 (1999).
  3. Moller, R., McDonald, A. G., Walter, C., Harris, P. J. Cell differentiation, secondary cell-wall formation and transformation of callus tissue of Pinus radiata D. Don. Planta. 217 (5), 736-747 (2003).
  4. Spokevicius, A. V., Van Beveren, K., Leitch, M. M., Bossinger, G. Agrobacterium-mediated in vitro transformation of wood-producing stem segments in eucalypts. Plant Cell Rep. 23 (9), 617-624 (2005).
  5. Plasencia, A., et al. Eucalyptus hairy roots, a fast, efficient and versatile tool to explore function and expression of genes involved in wood formation. Plant Biotech J. , (2015).
  6. Van Beveren, K. S., Spokevicius, A. V., Tibbits, J., Wang, Q., Bossinger, G. Transformation of cambial tissue in vivo provides efficient means for Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) and gene testing in stems of woody plants species. Funct Plant Biol. 33 (7), 629-638 (2006).
  7. Spokevicius, A. V., Van Beveren, K., Bossinger, G. Agrobacterium-mediated transformation of dormant lateral buds in poplar trees reveals developmental patterns in secondary stem tissues. Funct Plant Biol. 33 (2), 133-139 (2006).
  8. Spokevicius, A. V., et al. beta-tubulin affects cellulose microfibril orientation in plant secondary fiber cell walls. Plant J. 51 (4), 717-726 (2007).
  9. MacMillan, C. P., et al. The fasciclin-like arabinogalactan protein family of Eucalyptus grandis contains members that impact wood biology and biomechanics. New Phytol. 206 (4), 1314-1327 (2015).
  10. Creux, N. M., Bossinger, G., Myburg, A. A., Spokevicius, A. V. Induced somatic sector analysis of cellulose synthase (CesA) promoter regions in woody stem tissues. Planta. 237 (3), 799-812 (2013).
  11. Hussey, S. G., et al. SND2, a NAC transcription factor gene, regulates genes involved in secondary cell wall development in Arabidopsis fibers and increases fiber cell area in Eucalyptus. BMC Plant Biology. 11, (2011).
  12. Melder, E., Bossinger, G., Spokevicius, A. V. Overexpression of ARBORKNOX1 delays the differentiation of induced somatic sector analysis (ISSA) derived xylem fiber cells in poplar stems. Tree Genet. Genomes. 11 (5), (2015).
  13. Baldacci-Cresp, F., et al. PtaRHE1, a Populus tremula x Populus alba RING-H2 protein of the ATL family, has a regulatory role in secondary phloem fiber development. Plant J. 82 (6), 978-990 (2015).
  14. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning: A laboratory manual. , 3rd edn, Cold Springs Harbour Press. (2001).
  15. Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15 (3), 473-497 (1962).
  16. Chaffey, N. The use of GUS histochemistry to visualise lignification gene expression in situ during wood formation. Wood formation in trees: Cell and Molecular Biology Techniques. , Taylor and Francis. 271-295 (2002).
  17. Hodal, L., Bochardt, A., Nielsen, J. E., Mattsson, O., Okkels, F. T. Detection, expression and specific elimination of endogenous beta-glucuronidase activity in transgenic and nontransgenic plants. Plant Sci. 87 (1), 115-122 (1992).
  18. Hansch, R., Koprek, T., Mendel, R. R., Schulze, J. An improved protocol for eliminating endogenous beta-glucuronidase background in barley. Plant Sci. 105 (1), 63-69 (1995).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

GUS
השימוש בניתוח מגזר סומטיים מושרה (ISSA) לימוד גנים ומקדמי המעורבים ביצירת עץ ופיתוח גזע משניים
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.