מאמר שיטה

הבידוד, בידול, וכימות של האדם נוגדן מפריש תאים B מדם: ELISPOT בתור Readout פונקציונלי של חסינות הלחות

DOI:

10.3791/54582

⸱

14 בדצמבר 2016

1Graduate Institute of Pharmacology, College of Medicine, National Taiwan University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דם היקפי אנושי משמש בדרך כלל להערכת התגובה החיסונית ההומורלית. כאן, מתוארות השיטות לבידוד תאי B אנושיים מדם היקפי, התמיינות תאי B אנושיים לתאי B מפרישי נוגדנים (AB) (ASCs) בתרבית, וספירת סך ה-IgM וה-IgG-ASCs באמצעות בדיקת ELISpot.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המאפיין העיקרי של חסינות לחות הוא ליצור ASCs התפקודית, אשר לסנתז ולהפריש Abs הספציפי לאנטיגן (Ag), כגון פתוגן, ומשמש הגנה מארחת. לקביעת כמותי של המצב התפקודי של התגובה החיסונית הלחות של אדם, הן Abs בסרום ASCs במחזור נמדדים בכינויו readouts פונקציונלי. אצל בני אדם, דם היקפיים הוא מדגם הנוחה ביותר ונגיש בקלות, שניתן להשתמש בהם לצורך קביעת התגובה החיסונית הלחות שהושרו על ידי תאי B המארח. B-cell ברור תת, כולל ASCs, ניתן לבודד ישירות מדם היקפי באמצעות בחירה עם microbeads שושלת ספציפית Ab מצומדות או באמצעות מיון תא עם cytometry זרימה. יתר על כן, תאי B נאיביים וזיכרון מטוהרים יכולים להיות מופעל בדיל לתוך ASCs בתרבות. הפעילות התפקודית של ASCs לתרום הפרשת Ab ניתן לכמת על ידי ELISPOT, המהווה assay כי מתכנס אנזיםassay immunoabsorbance -linked (ELISA) וטכנולוגיות מערביות סופג כדי לאפשר הספירה של ASCs הנפרד ברמת התא הבודד. בפועל, assay ELISPOT נעשה שימוש יותר ויותר להעריך יעילות החיסון בגלל הקלות של טיפול של מספר רב של דגימות דם. שיטות לבודד תאי B האדם מן הדם ההיקפיים, את הבידול של תאי B לתוך ASCs במבחנה, ואת העסקתם של ELISPOT כימות של IgM- סך IgG-ASCs שיתואר כאן.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי B למלא תפקיד מרכזי בפיתוח של חסינות לחות. בהתחלה הוא לפתח במח העצם ולהיכנס לזרם הדם כמו תאי B נאיביים, אשר ניתן להעביר לתוך הרקמות הלימפה, כמו הטחול, בלוטות הלימפה, ואת שקדים, להמשך פיתוח. לאחר מפגש Ag, כמה תאי B נאיביים לנדוד לתוך זקיקי הלימפה, שם מרכז נבטי תאי B יכולים להתמיין לתאי B זיכרון plasmablasts (PBS) / תאי פלזמה (מחשבים). בעוד שרוב PBS / מחשבי היציאה לתוך זרם הדם, כמה בסופו של דבר להתגורר במח העצם כדי לעבור התמיינות מסוף מחשבי חיים ארוכים 1. תאי B שבמחזור הם הטרוגניות, ו על מצב יציב, מחשבי PBS / הם נדירים בדם היקפי 2. כתוצאת הזמינות של סמני משטח ספציפי שושלת, cytometry זרימה הפכה שיטה פופולרית לזיהוי והאפיון של תת B-cell בדם היקפי. יישום מורחב של הזרימה cytometry הוא התוספת של פונקצית סדרן תא, המאפשרת פרדה ובידוד של תת בודדים של תאי B עם טוהר גבוה. בהתבסס על הביטוי של קולטנים משטח ספציפי בשלבים התפתחותיים שונים, תאי B במחזור האדם מסווגים בדרך כלל לשלוש תת-אוכלוסיות עיקריות: תאי B נאיבי (CD19 + CD27 - CD38 -), תאי B זיכרון (CD19 + CD27 + CD38 -), ו PBS / מחשבים (CD19 + CD27 + CD38 +) 3-4 (איור 1). תאי B נאיביים מטבעו לא נתקלו AGS. עם זאת, הם יכולים להיות מובחנים לתוך IgM + CD27 + תאי הזיכרון B. למרות שתאי B נאיבי הם הומוגניים בהבעת הקולטן לאנטיגן B-cell (BCR) מולקולות -associated (למשל, CD19, CD20 ו CD22) הם הטרוגניים ברפרטואר אימונוגלובולינים שלהם 5. רוב תאי B זיכרון CD27 + יכול להיות מובחן לתוך CD27+ / היי CD38 + PBS / מחשבים 6. בנוסף, תאי B זיכרון PBS / מחשבים הם polyclonal ולהציג ההטרוגניות התפתחותית תפקודית 4-7. PBS / מחשבים שבמחזור הם בדרך כלל קצרי מועד מחווי CD138, אבל אלה שנעשו להתיישב במח עצם סופנים יבדילו ולהיות קבוע לטווח ארוך. סופני מחשבים הבדיל להביע CD138 ולמטה להסדיר מולקולות CD27 על פני השטח שלהן 8. מאז הוא PBS ומחשבים מסוגלים מפריש Abs, בהזדמנויות רבות הם מסומנים קולקטיביים ASCs. לעומת זאת, לא תאי B נאיביים ולא תאי B זיכרון יכול לייצר כמות ניכרת של שרירי הבטן 9-10. אף על פי כן, כאשר מבודד, הן תאי B נאיביים וזיכרון יכולים להיות מובחנים לתוך ASCs ב 3 - 10 ימים כאשר הניחו את תנאי התרבות הנכונים 6, 11-15. למעשה, ASCs נגזר ביטויי משטח דומים נתח בידול במבחנה של CD27 ו CD38 עם אלה fr ישירות המבודדדם 6 היקפי אום. בנוסף, ASCs הבדיל במבחנה להביע רמה נמוכה של CD20 השטח, בדומה לזה של מחזורי PBS / מחשבים 6. למרות ASCs נגזרת התרבות היא כל קצרת מועד, הם יכולים להפריש Abs, המציין כי הם תפקודיים מוכשרים ומסוגלים לתרום חסינויות לחות.

שניהם ELISA ו ELISPOT הוא ללא ספק השיטות ביותר מיושם כלל עם אשר להשיג מידע פונקציונלי על תגובת הלחות החיסונית. ELISA הוא assay 96-היטב מבוססי צלחת, והוא משמש לעתים קרובות כדי למדוד את טיטר של שרירי הבטן בסרום Ag ספציפיים analytes אחרים (למשל, ציטוקינים). זה נוח, וניתן להרחבה. ELISA נועד להשתמש assay אנזים מוצק שלב כדי לזהות הנוכחות של שרירי בטן או חומרים אחרים, כגון סרום, במדגם נוזל 16. המצגים מ ELISAs בסרום היו בשימוש נרחב לייצג את התגובה החיסונית של הגוף. כלי הכרחי לרכישה מחדשadouts מבחני ELISA הוא קורא microplate spectrophotometric. הקורא יכול לקבוע את הצפיפות האופטית (OD) של מוצרי הקצה בדרך כלל בעקבות התגובה של peroxidase חזרת (HRP) Abs זיהוי מצומדות ו -17 מצעים הספציפיים שלהם. באשר לדיווח תגובת הלחות החיסונית, רמות Ab בסרום שקבעו ELISA לציין הקולקטיב, אבל לא אישית, ההישגים של ASCs בגוף. בנוסף, ELISA אינה מביאה בחשבון את ההשתתפות ידי תאי B זיכרון, אשר לא מפרישים Abs.

כמו ELISA, ELISPOT היא שיטה בשימוש נרחב לאיתור וניטור התגובה החיסונית בדגימות דם היקפיים 17-18. ELISPOT היא טכניקה הקשורים כריך ELISA. בכל זאת, התאים ממוקמים לתוך difluoride polyvinylidene (PVDF) בארות מגובי הממברנה של 96 גם microplates לתרבות לטווח קצר. את assay ELISPOT משול ביצוע המערבי סופג על microplate ואת developing הכתם על הממברנה PVDF בכל טוב. מערכת קורא אוטומטית ELISPOT או סטראו עבור ספירה ידנית נדרשת. היתרון העיקרי של ELISPOT באיתור תגובה חיסונית הוא הרגישות המעולה שלה כימות של ASCs ותאי ציטוקינים, מפריש. הוא מדווח פעילויות הפעילות שלהן חסינות הלחות ואת הסלולר, בהתאמה. במדידת תפקוד הלחות חיסונית, רמות Ab בסרום שקבעו ELISA ומספר ASCs שמפרטת ELISPOT מתואמות לעתים קרובות, אבל readouts הנתונים משני מבחנים אלה יש כמה בדלי השלכות פונקציונליות 19-20. היתרון העיקרי של ELISPOT הוא רגישותו של השיטה. רמת טיטר בסרום Ab כפי שדווחה על ידי ELISA מוצגת חצי כמותית כמו readouts OD, המציינת את רמת Ab יחסית, או יותר באופן כמותי, כפי readouts ריכוז כאשר כמות ידועה של isotypes התקין של שרירי הבטן נכללה לעיון. לעומת זאת, התוצאות של ELISPOT הם presenteד כמספר מוחלט של ASCs בתוך שלולית התא של עניין (למשל, תאי דם היקפיים mononuclear unfractionated (PBMCs) ותאי B מטוהרים מן PBMCs). ELISPOT יכול לזהות ASC יחיד, אבל ELISA דורש כמויות Ab מ ASCs להגיע ריכוזי assay התלוי אופטימיזציה לפני המדידה. לפיכך, ELISPOT הוא ללא ספק עדיף על ELISA ברגישות של כימות. יתר על כן, ELISPOT מתאים גם לכימות במבחנה ASCs הבדיל מתאי B זיכרון מופעל. תאי B זיכרון לא מפרישים Abs אבל יכול להתמיין ASCs באקטיבציה; הם ולכן אין תרומה Abs בסרום זוהה על ידי ELISA. לפיכך, ELISPOT היא השיטה של ​​בחירה במדידה של התגובה החיסונית של תאי B זיכרון לאחר ההפעלה בתרבות. היא מאפשרת ניטור של החזקת חסינות הלחות לטווח ארוך.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דם היקפי אדם יש לקבל מתורמים בריאים תחת הסכמה מדעת, ושימוש דגימות דם חייב לעמוד בהנחיות שאשרו שהקימו לוחות סקירה מוסדיים בודדים. במחקר זה, כי הפרוטוקול משתמשים בדם אדם בהפגנה של תוצאות cytometry זרימה (איור 1) מבחני ELISPOT (איור 3) אושרה על ידי המועצה לביקורת פנימית של בית החולים האוניברסיטאי הלאומי בטייוואן (מספר פרוטוקול 201307019RINB).

בידוד וטיהור 1. של אדם תאי הדם ההיקפי B

  1. צייר ~ 10 מ"ל של דם מהעורק cubital החציוני (ב הקדמי fossa cubital עד המרפק) לתוך צינור 15 מ"ל המכיל EDTA K 2 (1.5 עד 2.0 מ"ג / מ"ל דם) ומיד להפוך את הצינור מספר פעמים כדי למנוע קריש היווצרות.
  2. להוסיף 35 מ"ל של autoclaved (121 ° C, 15 דקות) תאי דם אדומים (RBC) תמוגה חיץ (150 מ"מ NH 4 Cl, 10 מ"מ 3 KHCO, ו 1 mM EDTA; pH 7.4) כדי צינור המכיל את דגימת הדם טרי (≥ 3: 1 כרך / כרך) ו דגירה בטמפרטורת החדר (RT) למשך לא יותר מ -5 דקות.
    הערה: המראה של העברת אור דרך הצינור מציין את השלמת תמוגה RBC.
  3. צנטריפוגה ב 600 XG ב RT במשך 5 דקות. ודא כי הגלולה היא בצבע לבנה.
  4. Resuspend גלולה עם 10 מ"ל של תמיסת מלח פוספט שנאגרו autoclaved (PBS, 137 מ"מ NaCl, KCl 2.7 מ"מ, 4.3 מ"מ Na 2 4 HPO, ו 1.47 מ"מ KH 2 PO 4; pH 7.4) ו צנטריפוגות כמו בשלב 1.3.
  5. בטל supernatant, resuspend גלולה עם 10 מ"ל של RPMI 1640 בינוני (תוספי: נסיוב עגל עוברית 10%, 100 U / mL פניצילין / סטרפטומיצין, 0.25 מיקרוגרם / מ"ל ​​amphotericin B, ו -2 מ"מ L- גלוטמין), ולאחר מכן צלחת תאים לתוך צלחת תרבות 10 ס"מ (10 מ"ל של דם לכל צלחת). מניח את הצלחת בתוך 37 ° C חממה עם 5% CO 2 למשך 30 דקות.
  6. מערבולת בעדינות את מנת התרבות כמה פעמים ומקוםמדיום תרבות (תאי השעיה) לתוך צינורות חרוטי פלסטיק 15 מיליליטר. מחק את התאים החסידים (בעיקר מקרופאגים) על תרבות המנות.
  7. צנטריפוגה ב 600 XG ב RT במשך 5 דקות. בטל supernatant.
  8. Resuspend גלולה עם 1 מ"ל של מדיום RPMI 1640. ספירת התאים עם hemocytometer או נגד תא אוטומטי.
    הערה: הכדאיות של לויקוציטים מבודד היא בדרך כלל יותר מ -90% על ידי הרחקה הכחולה trypan.
  9. צנטריפוגה כמו בשלב 1.7 ו resuspend התאים ~ 200 μL של חיץ קר PBS (אלבומין 0.5% שור (BSA) ו 2 מ"מ EDTA) בריכוז של 5 - 10 x 10 6 תאים / מ"ל.
  10. הוסף 5 μL של קוקטייל Ab אנטי אנושי biotinylated ספציפי לתאי דם (עבור הסלקציה השלילית של תאי B) לכל 10 6 תאי דגירה על קרח למשך 30 דקות 21.
    הערה: קוקטייל Ab אנטי אנושי צריך לפחות כוללים Abs ספציפי CD2 (או CD3), CD14, CD16 ו.
  11. הוספת נפח עודף של פי 10של PBS סטרילי אל התאים, צנטריפוגות ב 600 XG במשך 5 דקות, וזורקים supernatant.
  12. להוסיף כמויות שווות של microbeads streptavidin מצומדות (5 μL לכל 10 6 תאים) על הגלולה ומערבבת היטב.
  13. דגירה על קרח למשך 30 דקות בתוך צינור חרוטי פלסטיק 15 מ"ל.
  14. הוסף 2 מ"ל של חיץ PBS לתוך הצינור.
  15. מניחים את הצינור לתוך מעמד מגנטי דגירה ב RT עבור 8 דקות. Microbeads חום יצרף בהדרגה אל הקיר צינור ליד המגנט 22.
  16. עם הצינור שנותרו לעמוד מגנטי, ובזהירות להעביר את supernatant לתוך צינור 15 מ"ל סטרילי חדש 22.
  17. חזור על שלבים 1.14 כדי 1.16, ולשלב את שני supernatants המכילים את תאי B פגע. מחק את microbeads.
  18. צנטריפוגה ב 600 XG ב RT במשך 5 דקות. בטל supernatant.
  19. Resuspend גלולה במדיום RPMI 1640 לניסויים במורד הזרם.
    הערה: בדרך כלל, 1 - 5 x 10 5 B תאים שנינותחה טוהר יותר מ 95% מ -10 מ"ל של דם היקפיים ניתן לבודד 23.

2. טיהור והפרדה של זיכרון והתמים B תאי מתאי B מבודדים

  1. השתמש בתאים מטוהרים משלב 1 ולקבוע את מספר הסלולרי באמצעות hemocytometer או דלפק תא אוטומטי.
  2. Resuspend התאים 100 μL של חיץ PBS קר לאחר צנטריפוגה ב 600 XG ו RT במשך 5 דקות.
  3. להוסיף 1 - 2 מיקרוגרם של מב CD27 biotinylated לכל 10 6 תאים דגירה על קרח למשך 30 דקות.
  4. הוסף 10 מ"ל של חיץ PBS אל הצינור צנטריפוגות ב 600 XG במשך 5 דקות.
  5. בטל supernatant ו resuspend התאים 50 μL של חיץ PBS.
  6. להוסיף כמויות שוות של microbeads מגנטי streptavidin (1 - 2 מיקרוגרם / 10 6 תאים) לתאים צינור חרוטי פלסטיק 15 מ"ל.
  7. בעדינות מערבבים היטב דגירה על קרח למשך 30 דקות.
  8. להוסיף 2 - 3 מ"ל של חיץ PBS אל הצינור.
  9. מניחים אתצינור לתוך עמדת מגנטי הדגירה ב RT עבור 8 דקות כדי לאפשר microbeads החום לצרף את הצד הקרוב המגנט.
  10. עם הצינורית לעמוד המגנטי, ובזהירות להעביר את החלק היחסי supernatant לתוך צינור סטרילי חדשה. חלק זה מכיל את CD27 המועשר - תאי B נאיבי.
  11. הוסף 5 מ"ל שפופרת המכילה את microbeads בעדינות resuspend microbeads (כלומר, את החלק היחסי מועשר של תאי זיכרון B CD27 +) 24-25.
  12. צנטריפוגה ב 600 XG ב RT במשך 5 דקות. Resuspend את הכדורים עם מדיום RPMI 1640 עבור הניסויים במורד הזרם.
    הערה: בדרך כלל, ~ 30 - 60% של תאי B יכולים להיטהר כתאי זיכרון CD27 + מן PBMCs של מתורם בריא 7, 25-26.

3. מיון תאים עבור האוסף של תאי B הנאיבי, תאי B הזיכרון, ו- PBS / מחשבים

  1. באמצעות תאים מטוהרים משלב 1, לקבוע את מספר הסלולרי באמצעות hemocytometer או דלפק תא אוטומטי.
  2. Resuspend התאים חיץ PBS קר בריכוז של 10 7 לכל מ"ל בתוך שפופרת קלקר 5 מ"ל.
  3. להוסיף 1 - 2 מיקרוגרם של IgG אדם לכל 10 6 תאים דגירה על קרח למשך 10 דקות עבור בלוק Fc.
  4. הוסף 1 מיקרוגרם אחד נגד CD19-APC (שיבוט: HIB19), אנטי CD27-eFluor450 (שיבוט: O323), ואנטי-CD38-PE (שיבוט: HIT2) לכל 10 6 תאים; מערבבים היטב לדגור על קרח למשך 30 דקות 4, 27.
  5. ב -5 הדקות האחרונות בשלב 3.4, להוסיף 5 μL של D 7-aminoactinomycin המסחרי (7-AAD).
  6. הוסף 2 מ"ל של PBS על הצינור, מערבולת, ו צנטריפוגות ב 600 XG במשך 5 דקות.
  7. Resuspend התאים מיון חיץ (PBS סטרילי עם BSA 2% ו 2 מ"מ EDTA) בריכוז של 1 - 5 x 10 7 תאים לכל מ"ל בתוך שפופרת 15 מ"ל.
  8. סנן את התאים דרך מסננת תא רשת ניילון (40 מיקרומטר גודל נקבובי) לחסל גושי תאים.
  9. הפרד את התאים עם מעין תזרים cytometricאה מצויד בשלושה לייזרים: סגול (405 ננומטר), כחול (488 ננומטר), ואדום (640 ננומטר).
    הערה: לייזר כחול בלבד מספיקה עבור 3-צבע cytometry זרימה 27-28.
  10. מיין התאים לשלושה צינורות 15 מ"ל (המכיל 5 מ"ל של מדיום RPMI) לאיסוף סימולטני של תאי B נאיבי (CD19 + CD27 -), תאי B זיכרון (CD19 + CD27 +), ו PBS / מחשבים (CD19 + CD27 + / היי CD38 +) 3-4, 28.
    הערה: ממוין נאיבי וזיכרון B תאים יכולים להיות מתורבתים כמתואר בשלב 4.

4. במבחנת הבידול של CD19 האדם מבודד תאים + B, תאי CD19 + CD27 + זיכרון B ו- CD19 + CD27 - תאי B הנאיבי

  1. באמצעות התאים מטוהרים בצעדים 1.19, 2.10, 2.11 ו -3.10, לקבוע את המספר הסלולרי עם hemocytometer או דלפק תא אוטומטי.
  2. Resuspend התאים עם המדיום RPMI 1640בריכוז של 1 - 10 x 10 5 לכל מ"ל ו aliquot אותם לתוך הבארות של צלחת 12-היטב.
  3. להוסיף CPG (ODN 2006) בשעה 5 מיקרוגרם / 10 6 תאים / מ"ל 18, 29.
  4. התרבות התאים בתוך 37 ° C חממה עם 5% CO 2 למשך 5 ימים.
  5. קציר התאים מכל טוב, למקם אותם בתוך צינוריות 15 מ"ל, מוסיפים 5 מ"ל של PBS על צינור אחד, צנטריפוגות אותם ב 600 XG ו RT במשך 5 דקות.
  6. ספירת התאים באמצעות hemocytometer או דלפק תא אוטומטי. Resuspend התאים בריכוז של 1 - 10 x 10 5 לכל מ"ל עם RPMI 1640 בינוני.

5. Assay ELISPOT

  1. הוסף 30 μL של אתנול 35% במים מזוקקים היטב כל הצלחות ELISPOT למשך 30 שניות.
    הערה: כאשר pipetting, להימנע מלגעת קרום בבארות בכל עת.
  2. הפוך את צלחות ELISPOT להסיר את אתנול.
  3. שים 150 μL של DDH autoclaved 2 O לתוך זה היטב דגירהאותם ב RT במשך 5 דקות כדי לשטוף את אתנול שיורית; בצע עם לשטוף של PBS סטרילי ב RT במשך 3 דקות.
    הערה: שלבי 5.1 כדי 5.3 עשויים להיות אופציונליים, תלוי בייצור של הצלחות.
  4. שים 50 μL של 5 מיקרוגרם / מ"ל polyclonal F (ab ') 2 שבר (IgA IgG + IgM +) אנטי אנושי איג (PBS) לבאר כל הצלחות ELISPOT דגירה אותם ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה (המועדפת) או 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות 11.
    הערה: לאטום את הקצוות של הצלחות עם Parafilm עד השימוש.
  5. הפוך את הצלחות להסיר Abs המאוגד, להוסיף 200 μL של PBS על כל היטב, דגירה אותם פעמים ב RT במשך 3 דקות בכל פעם.
  6. הוספת 200 μL של PBS עם 5% BSA (או RPMI 1640 בינוני) זה טוב עבור חסימה, דגירה אותם ב RT עבור 2 שעות.
  7. הפוך את הצלחות להסיר למאגר החסימה. לשטוף כל פעמיים גם עם 200 μL של PBS, כמו בשלב 5.5.
  8. הוספת 100 μL של RPMI 1640 בינוני היטב כל דגירה אותם ב 37 מעלות צלזיוס.
  9. כאשר מוכן זרע התאים, להפוך את הצלחות להסיר את מדיום RPMI 1640.
  10. זרע 100 μL (5 x 10 4), 50 μL (2.5 x 10 4), ו -25 μL (1.25 x 10 4) של התאים (מן הצעדים 1.19, 2.10, 2.11, 3.10, ו -4.6) לתוך הבארות של צלחת ELISPOT. עם המדיום RPMI 1640, ולהביא את נפח 150 μL / טוב.
    הערה: מינימום של אחד או שניים דילולים סדרו פי 2 עבור ציפוי התא מומלץ.
  11. דגירה צלחות 37 ° C חממה עם 5% CO 2 עבור 8 - 14 שעות 18. הימנע הזזת הצלחות במהלך דגירה.
  12. הפוך את הצלחות כדי להסיר את התאים ובינוניים RPMI 1640.
  13. הוספת 200 μL / טוב של PBS-T (PBS עם 0.05% Tween 20) דגירה אותם 5 פעמים ב RT, בכל פעם למשך 3 דקות. הפוך את הצלחת להסיר את החיץ לשטוף בין כל 5 הכביסות.
  14. להוסיף או עז נגד אדם phosphatase IgG-אלקליין (AP), שרירי הבטן ספציפי Fcγ (לגילוי IgG, 1: 5,000 ב PBS-T) או עז נגד אדם IgM-AP, Fcμ שבר ספציפי Abs (לגילוי IgM, 1: 5,000 ב PBS-T) לתוך הבארות המיועדות לדגור על RT עבור 2 שעות בחושך.
  15. לשטוף כל פעמיים גם עם 200 μL של PBS, כמו בשלב 5.5.
  16. הוסף 50 μL / היטב tetrazolium כחול פוספט-ניטרו bromochloroindolyl פתרון המצע (BCIP / NBT). כתמים סגולים בצבע בדרך כלל מופיעים 5 - 15 דקות.
  17. הוספת 100 μL / טוב של DDH 2 O כדי למנוע כתמים התפתחות יתר.
  18. יש לשטוף את הצלחות עם ריצה ברז מים לאחר הפיתוח המלא של כל הכתמים.
  19. הסר את underdrain של הצלחות ולאפשר להם אוויר יבש בחושך.
  20. לספור את הנקודות באמצעות קורא צלחת אוטומטית עם יחידת רכישת תמונה / ניתוח (לדוגמא, סורק אוטומטי או ידני באמצעות מיקרוסקופ לנתח).
    הערה: ניתן לאחסן את הצלחות ב RT בחושך ונותחו לאחר מכן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PBMCs היו מתרוקנים של RBCs ותאי חסיד (שלבים 1.2 כדי 1.7). דוגמא מתמיסה בסיסית (2 x 10 6) של תאים היו נתוני ניתוח התזרים cytometric כדי להמחיש את האוכלוסיות של תאי B נאיביים, תאי B הזיכרון, PBS / מחשבים בדם היקפי (איור 1). בשנת PBMCs של תורם זה, כ -10% של לימפוציטים היו תאי CD19 + B. בתא B-cell, אחוז CD19 + CD27 - תאי B נאיבי היה בסביבות 50%. מצד השני, כ -50% מכלל תאי CD19 + B ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בידוד וטיהור של אדם תאי הדם ההיקפי B

בדרך כלל, RBCs ניתן מקרע ביעילות מסומן על ידי חיץ תמוגה (שלב 1.2). חשוב לא כדי לדגור PBMCs עם למאגר תמוגה RBC יותר מ -5 דקות, כפי כדאיות התא עלול להיות מושפע אמוניום כלוריד. לחלופין, RBCs וטסיות ניתן להסיר זמנית על ידי הפרוטוקול הבא.

מערבבים טריים דם שלם עם ציטרט חומצה דקסטרוז (ACD) חיץ (חומצת לימון 39 מ"מ,...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחבר מצהיר שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי מענק מחקר ממשרד המדע והטכנולוגיה של היואן המנהלי של טייוואן (NSC99-2320-B-002-011). ברצוני להודות לשירות המצוין הניתן על ידי ליבת הניתוח והמיון הציטומטרי של מעבדת הליבה הראשונה במכללה לרפואה של האוניברסיטה הלאומית של טייוואן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
BD Vacutainer K2EBD Biosciences367525צינור 10 מ"ל
Ficoll-Paque PlusGE Healthcare17-1440-02ללא אנדוטוקסין
טריפן כחול 0.5% תמיסהתעשיות ביולוגיות03-102-1B
IMag סט העשרת לימפוציטים B אנושיBiosciences558007
ביוטינילציה CD27 mAbBiolegendשיבוט 302804O323
סטרפטווידין מיקרו-חרוזים מגנטייםBD Biosciences9000810
15 מ"ל צינורות בזBD Falcon352196
מסננת תאי רשת ניילון כחולה, 40 μ mBD Falcon352340
אנטי אנושי CD19-APCBiolegend302212שיבוט HIB19
אנטי אנושי CD27-eFluor 450eBioscience48-0279-42שיבוט O323
אנטי אנושי CD38-PE-Cy7Biolegend303516שיבוט HIT2 
אנטי-אנושי CD38-PE-Cy7BD Biosciences560677שיבוט HIT2 
שיבוט אנטי אנושי CD45-FITCBiolegend304006שיבוט HI30
אנטי אנושי CD45-FITCBD Biosciencesשיבוט 555482HI30
נגד עכבר/חולדה/אדם CD27-PerCP Cy5.5שיבוט Biolegend124213LG.3A10
אנטי-אנושי CD27-PerCP Cy5.5BD Biosciences65429שיבוט L128
אנטי אנושי CD19-FITCMiltenyi Biotec130-098-064שיבוט LT19
אנטי אנושי CD19-FITCGeneTexשיבוטGTX75599 LT19
אנטי אנושי CD20-FITCBD Biosciencesשיבוט555622 2H7
ביוטינילציה אנטי אנושי CD27Biolegend302804שיבוט O323
ביוטינילציה אנטי אנושי CD27eBioscience13-0279-80שיבוט O323
7-aminoactinomycin D (7-AAD)BD Biosciences559925
CpG (ODN 2006) InvivoGentlrl-2006סוג B CpG
רקומביננטי אנושי IL-2PeproTech200-02
רקומביננטי אנושי IL-10PeproTech200-10
רקומביננטי אנושי IL-21PeproTech200-21
רקומביננטי אנושי sCD40LPeproTech310-02
חלבון A של S. aureus Cowan (SAC)Sigma-Aldrich82526
Pokeweed mitogen (PWM)Sigma-AldrichL9379
לוחות סינון MultiScreen, 0.45 ומיקרו; m גודל נקבוביותMerck MilliporeMSIPS4510צלחת סינון סטרילית, שקופה 96 בארות עם קרום PVDF הידרופובי
תמיסת BCIP / NBTSigma-AldrichB6404
BCIP / NBT מגיב יחיד, מצע פוספטאז אלקלייןMerck MilliporeES006
IgG אנושיג'קסון ImmunoResearch009-000-003
IgG אנושי, שבר Fcג'קסון ImmunoResearch009-000-008
F(ab')2 שבר של Ig אנטי-אנושי של עז (IgG + IgM + IgA)Jackson ImmunoResearch109-006-127
עז אנטי-אנושי IgG-אלקליין פוספטאז, Fcγ שבר ספציפיג'קסון109-055-008
עז אנטי-אנושי IgM-אלקליין פוספטאז, Fcµ ג'קסון ספציפי לשבר ImmunoResearch109-055-043
עז אנטי אנושי IgG-peroxidase, Fcγ מקטעספציפי ג'קסון ImmunoResearch109-035-008
עז אנטי אנושי IgM-peroxidase, Fcµ מקטעספציפי ג'קסון ImmunoResearch109-035-095
ערכת מצע BD ELISPOT AEC BDBiosciences551951
מנתח C.T.L. ImmunoSpotסי.טי.אל.
BD

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bemark, M. Translating transitions - how to decipher peripheral human B cell development. J. Biomed. Res. 29 (4), 264-284 (2015).
  2. Odendahl, M., et al. Generation of migratory antigen-specific plasmablasts and mobilization of resident plasma cells in a secondary immune response. Blood. 105 (4), 1614-1621 (2005).
  3. Jackson, S. M., Wilson, P. C., James, J. A., Capra, J. D. Human B cell subsets. Adv. Immunol. 98, 151-224 (2008).
  4. Sanz, I., Wei, C., Lee, F. E., Anolik, J. Phenotypic and functional heterogeneity of human memory B cells. Semin. Immunol. 20 (1), 67-82 (2008).
  5. Perez-Andres, M., et al. Human peripheral blood B-cell compartments: A crossroad in B-cell traffic. Cytometry B Clin. Cytom. 78 (Suppl 1), S47-S60 (2010).
  6. Huggins, J., et al. CpG DNA activation and plasma-cell differentiation of CD27- naïve human B cells. Blood. 109 (4), 1611-1619 (2007).
  7. Wu, Y. C., Kipling, D., Dunn-Walters, D. K. The relationship between CD27 negative and positive B cell populations in human peripheral blood. Front. Immunol. 2, 81(2011).
  8. Maïga, R. I., Bonnaure, G., Rochette, J. T., Néron, S. Human CD38hiCD138⁺ plasma cells can be generated in vitro from CD40-activated switched-memory B lymphocytes. J. Immunol. Res. 2014, 635108(2014).
  9. Wienands, J., Engels, N. The memory function of the B cell antigen receptor. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 393, 107-121 (2016).
  10. Kurosaki, T., Kometani, K., Ise, W. Memory B cells. Nat. Rev. Immunol. 15 (3), 149-159 (2015).
  11. Tzeng, S. J., Li, W. Y., Wang, H. Y. FcγRIIB mediates antigen-independent inhibition on human B lymphocytes through Btk and p38 MAPK . J. Biomed. Sci. 22, 87-98 (2015).
  12. Ettinger, R., et al. IL-21 induces differentiation of human naïve and memory B cells into antibody-secreting plasma cells. J. Immunol. 175 (12), 7867-7879 (2005).
  13. Bekeredjian-Ding, I., Foermer, S., Kirschning, C. J., Parcina, M., Heeg, K. Poke weed mitogen requires Toll-like receptor ligands for proliferative activity in human and murine B lymphocytes. PLoS One. 7 (1), e29806(2012).
  14. Bernasconi, N. L., Traggiai, E., Lanzavecchia, A. Maintenance of serological memory by polyclonal activation of human memory B cells. Science. 298 (5601), 2199-2202 (2002).
  15. Defrance, T., Vanbervliet, B., Brière, F., Durand, I., Rousset, F., Banchereau, J. Interleukin 10 and transforming growth factor beta cooperate to induce anti-CD40-activated naive human B cells to secrete immunoglobulin A. J. Exp. Med. 175 (3), 671-682 (1992).
  16. Hornbeck, P., Fleisher, T. A., Papadopoulos, N. M., et al. Chapter 2, Unit 2.2, Isotype determination of antibodies. Current Protocols in Immunology. Coligan, J. E., et al. , (2001).
  17. Tanguay, S., Killion, J. J. Direct comparison of ELISPOT and ELISA-based assays for detection of individual cytokine-secreting cells. Lymphokine Cytokine Res. 13 (4), 259-263 (1994).
  18. Crotty, S., Aubert, R. D., Glidewell, J., Ahmed, R. Tracking human antigen-specific memory B cells: a sensitive and generalized ELISPOT system. J. Immunol. Methods. 286 (1-2), 111-122 (2004).
  19. Zhang, Y., Wang, Y., Zhang, M., Liu, L., Mbawuike, I. N. Restoration of retarded influenza virus-specific immunoglobulin class switch in aged mice. J. Clin. Cell. Immunol. 7 (2), 403(2016).
  20. Doedée, A. M., Kannegieter, N., Öztürk, K., van Loveren, H., Janssen, R., Buisman, A. M. Higher numbers of memory B-cells and Th2-cytokine skewing in high responders to hepatitis B vaccination. Vaccine. 34 (19), 2281-2289 (2016).
  21. Coligan, J. E., et al. Chapter 7, Unit 7.5, Isolation of human B cell populations. Current Protocols in Immunology. , (2011).
  22. Safarík, I., Safaríková, M. Use of magnetic techniques for the isolation of cells. J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. 722 (1-2), 33-53 (1999).
  23. Morbach, H., Eichhorn, E. M., Liesem, J. G., Girschickm, H. J. Reference values for B cell subpopulations from infancy to adulthood. Clin. Exp. Immunol. 162 (2), 271-279 (2010).
  24. Thornton, A. M., et al. Chapter 3, Unit 3.5A, Fractionation of T and B cells using magnetic beads. Current Protocols in Immunology. Coligan, J. E., et al. , (2003).
  25. Klein, U., Rajewsky, K., Küppers, R. Human immunoglobulin (Ig)M+IgD+ peripheral blood B cells expressing the CD27 cell surface antigen carry somatically mutated variable region genes: CD27 as a general marker for somatically mutated memory)Bcells. J.Exp. Med. 188 (9), 1679-1689 (1998).
  26. Bohnhorst, J. Ø, Bjørgan, M. B., Thoen, J. E., Natvig, J. B., Thompson, K. M. Bm1-Bm5 classification of peripheral blood B cells reveals circulating germinal center founder cells in healthy individuals and disturbance in the B cell subpopulations in patients with primary Sjögren's syndrome. J. Immunol. 167 (7), 3610-3618 (2001).
  27. Bleesing, J. J., et al. Chapter 7, Unit 7.35, Assays for B cell and germinal center development. Current Protocols in Immunology. Coligan, J. E., et al. , (2003).
  28. Horvatinovich, J. M., Sparks, S. D., Mann, K. P. Establishing a pure lymphocyte gate for subset analysis by flow cytometry. Cytometry. 26 (2), 172-177 (1996).
  29. Ruprecht, C. R., Lanzavecchia, A. Toll-like receptor stimulation as a third signal required for activation of human naive B cells. Eur. J. Immunol. 36 (4), 810-816 (2006).
  30. Smith, K., et al. Rapid generation of fully human monoclonal antibodies specific to a vaccinating antigen. Nat. Protoc. 4 (3), 372-384 (2009).
  31. Caraux, A., et al. Circulating human B and plasma cells. Age-associated changes in counts and detailed characterization of circulating normal CD138- and CD138+ plasma cells. Haematologica. 95 (6), 1016-1020 (2010).
  32. Kuchen, S., Robbins, R., Sims, G. P., Sheng, C., Phillips, T. M., Lipsky, P. E., Ettinger, R. Essential role of IL-21 in B cell activation, expansion, and plasma cell generation during CD4+ T cell-B cell collaboration. J. Immunol. 179 (9), 5886-5896 (2007).
  33. Pinna, D., Corti, D., Jarrossay, D., Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Clonal dissection of the human memory B-cell repertoire following infection and vaccination. Eur. J. Immunol. 39 (5), 1260-1270 (2009).
  34. Jahnmatz, M., et al. Optimization of a human IgG B-cell ELISpot assay for the analysis of vaccine-induced B-cell responses. J. Immunol. Methods. 391 (1-2), 50-59 (2013).
  35. Weiss, G. E., et al. High efficiency human memory B cell assay and its application to studying Plasmodium falciparum-specific memory B cells in natural infections. J. Immunol. Methods. 375 (1-2), 68-74 (2012).
  36. Leehan, K. M., Koelsch, K. A. T Cell ELISPOT: For the identification of specific cytokine-secreting T cells. Methods. Mol. Biol. 1312, 427-434 (2015).
  37. Karahan, G. E., et al. Quantification of HLA class II-specific memory B cells in HLA-sensitized individuals. Hum. Immunol. 76 (2-3), 129-136 (2015).
  38. Hadjilaou, A., Green, A. M., Coloma, J., Harris, E. Single-cell analysis of B cell/antibody cross-reactivity using a novel multicolor FluoroSpot assay. J. Immunol. 195 (7), 3490-3496 (2015).
  39. Janetzki, S., Rueger, M., Dillenbeck, T. Stepping up ELISpot: multi-level analysis in FluoroSpot assays. Cells. 3 (4), 1102-1115 (2014).
  40. Alatrakchi, N., Graham, C. S., He, Q., Sherman, K. E., Koziel, M. J. CD8+ cell responses to hepatitis C virus (HCV) in the liver of persons with HCV-HIV coinfection versus HCV monoinfection. J. Infect. Dis. 191 (5), 702-709 (2005).
  41. Smith, S. G., et al. Identification of major factors influencing ELISpot-based monitoring of cellular responses to antigens from Mycobacterium tuberculosis. PLoS. One. 4 (11), e7972(2009).
  42. Sundararaman, S., et al. High reproducibility of ELISPOT counts from nine different laboratories. Cells. 4 (1), 21-39 (2015).
  43. Janetzki, S., et al. Guidelines for the automated evaluation of Elispot assays. Nat. Protoc. 10 (7), 1098-1115 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

ELISpotBB

מאמרים קשורים