הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ה

11.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54585

⸱

6 באוקטובר 2016

 , 
1Institute for Genetics, Cologne Excellence Cluster on Cellular Stress Responses in Aging-Associated Diseases (CECAD), University of Cologne

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מדגים כיצד ליצור מסומן פלורסנטי, גידולים המשובטים מוגדר גנטית בעין תסיסנית / דיסקים דמותי מחושים (EAD). הוא מתאר כיצד לנתח את EAD והמוח מן הזחלים instar השלישי וכיצד לעבד אותם לחזות ולכמת שינויים בהתבטאות גנים הפולשנות הגידול.

תקציר

Drosophila melanogaster התגלתה כמערכת ניסויית רבת עוצמה למחקרים פונקציונליים ומכניסטיים של התפתחות והתקדמות גידול בהקשר של אורגניזם שלם. טכניקות מתוחכמות ליצירת פסיפסים גנטיים מאפשרות אינדוקציה של שיבוטים מסומנים ויזואלית ומוגדרים גנטית המוקפים ברקמה נורמלית. ניתן לנתח את השיבוטים באמצעות גישות מולקולריות, תאיות ואומיקס מגוונות. מחקר זה מתאר כיצד ליצור גידולים משובטים בעלי תווית פלואורסצנטית של ממאירות משתנה בדיסקים הדמיוניים של העין/אנטנה (EAD) של זחלי דרוזופילה באמצעות ניתוח פסיפס עם טכניקת סמן תאים מדכא (MARCM). הוא מתאר נהלים, כיצד לשחזר את הפסיפס, EAD והמוח מהזחלים, וכיצד לעבד אותם להדמיה סימולטנית של מדווחים טרנסגניים פלואורסצנטיים וצביעת נוגדנים. כדי להקל על אפיון מולקולרי של רקמת הפסיפס, אנו מתארים פרוטוקול לבידוד של סך ה-RNA מה-EAD. הליך הדיסקציה מתאים לשחזור EAD ומוח מכל שלב זחל. פרוטוקול הקיבוע והצביעה של דיסקים דמיוניים עובד עם מספר מדווחים טרנסגניים ונוגדנים המזהים חלבוני דרוזופילה. ניתן ליישם את הפרוטוקול לבידוד RNA על איברי זחלים שונים, זחלים שלמים וזבובים בוגרים. ניתן להשתמש ב-RNA הכולל לפרופיל של שינויים בביטוי גנים באמצעות גישות מועמדות או כלל-גנומיות. לבסוף, אנו מפרטים שיטה לכימות פולשניות של הגידולים המשובטים. למרות שלשיטה זו יש שימוש מוגבל, הרעיון הבסיסי שלה ישים באופן נרחב למחקרים כמותיים אחרים שבהם יש להימנע מהטיה קוגניטיבית.

מבוא

סרטן מייצג את אחד קבוצה הטרוגנית גנטית ביותר של מחלות, אשר שכיחות ותמותה גדל באופן דרמטי, במיוחד בקרב קשישים ברחבי העולם. הסרטן שמקורו clonally מתא ייזום גידול כי נמלט מנגנוני מדכא גידולים טמונים ומחלק יצא מכלל שליטה. ההצטברות ההדרגתית של נגעים גנטיים בשיתוף פעולה לקידום צמיחה, שגשוג תנועתיות תוך עיכוב מוות והבחנה הופכת את יתר השפירה הראשוני לתוך גידול ממאיר, הגרורה וקטלנית מאוד. זה הפך להיות ברור כי בנוסף שינויים גנטיים, התקדמות הגידול דורש שינויים stroma שמסביב crosstalk בין הגידול לבין מספר סוגי תאים (למשל, פיברובלסטים, תאי מערכת החיסון ואת אנדותל) ב microenvironment שלה. הבנת העקרונות המולקולריים שבבסיס שינוי ממאיר כולל אינטראקציות stroma גידול היא בעל חשיבות רבה לפיתוח מונע וטיפולtion ואסטרטגיות המיון המוקדם, כמו גם טיפולים חדשים ויעילים להילחם גרורות סרטן עמידות לתרופות.

זבוב הפרות תסיסנית הפכו למערכת אטרקטיבית חקר הסרטן 1-4 בשל הזמן ההדור המהיר שלה, שימור מדהים של איתות צמתים בין זבובים ובני האדם, יתירות גנטית מוגבלת ועושר של כלים גנטיים מתקדמים המאפשרים מניפולציה של כמעט כל גן ב באופן מצומצם זמנית מרחבית. גנטי גידולים מוגדרים של ממאירות שונות יכולים להיות מהונדסים reproducibly תסיסנית ידי החדרת gain- ופסד של פונקצית מוטציות קבוצת משנה של אבות ב רקמת סוג ברה אחר באמצעות טכניקת MARCM 5. הכלי MARCM משלב FLP / FRT (FLP recombinase / FLP זיהוי מטרות) בתיווך רקומבינציה mitotic 6 עם FLP-אאוט 7 ו Gal4 / כטב"מ (רצף הפעלת Upstream) גן המטרה 8מערכות ביטוי 9. עם ביטוי שיטה זו של כל transgene כטב"מ מבוסס, כולל אונקוגן או cDNAs חלבון פלואורסצנטי או חזרות DNA הפוכות עבור להשתקת גני מושרה dsRNA, יוגבל שיבוט של תאים שאבד מוקד גנטי ספציפי וכן מדכא Gal4 עקב רקומבינציה (איור 1 א). תיקוני משובטים מסומנים פלואורסצנטי ירוק (GFP) או חלבוני ניאון אדום (למשל, RFP, DsRed, mCherry) ניתן לעקוב בקלות ברחבי פיתוח, מבודד ונותח. חשוב לציין, התנהגותם ניתן להשוות ישירות לרקמת סוג הבר הסמוכה. לפיכך, שאלות ענייניות לתא אוטונומי והשפעות חד אוטונומיות של נגעים גנטיים ניתן ללמוד בנוחות. בדומה ליונקים, רק שיבוטים שבו מספר נגעים שבעור משולבים להפוך לממאירים תסיסנית ו לשחזר סימני היכר עיקריים של סרטן יונק. הם overproliferate, להתחמק אפופטוזיס, לגרום דלקת, להיות בן אלמוות invasive, ובסופו של דבר הורג את המארח 10-17.

כאן, אנו מתארים פרוטוקול ליצור גנטי מוגדרים גידולים המשובטים בעיניים / מחושים ומוח הרקמות של זחלים תסיסנית באמצעות טכניקת MARCM. השיטה מסתמכת על מנייה בודק MARCM המבטא את recombinase FLP שמרים בשליטת המשפר חסר העיניים (eyFLP) 18,19. בדרך זו, שיבוטי GFP שכותרתו נוצרים בשני האפיתל peripodial ואת העמודים של EAD ואת neuroepithelium של המוח בכל שלבים עובריים זחל (איור 1 א ', ב' ו-התייחסות 20). משובטים ניתן בעקבות בקלות עד לבגרות כמו EAD מפתחת לתוך עין המבוגרת, כמוסת האנטנה והראש בעוד neuroepithelium מוליד neuroblasts המייצרים נוירונים באונה אופטיים מובחנים.

כדי להקל על אפיון מולקולרי, פונקציונלי פנוטיפי נרחב של רקמת הפסיפס, אנחנו דהסופר פרוטוקול לנתיחה של EAD והמוח מן זחלי instar השלישיים מתאר כיצד לעבד אותם במשך שלושה יישומים שונים: (i) זיהוי של כתבי ניאון מהונדסים immunostaining, (ii) כימות הפולשנות גידול (iii) ניתוח ביטוי גנים משנה באמצעות כמותי בזמן אמת PCR (qRT-PCR) או רצף mRNA תפוקה גבוהה (mRNA-seq) (תרשים 1C).

פרוטוקול immunostaining יכול לשמש כדי לחזות חלבון כלשהו של עניין עם נוגדן ספציפי. כתבי תעתיק פלורסנט מהונדסים לספק מידע spatiotemporal נוח ומדויק על פעילות מסלול איתות מסוימת. תא שושלת כתבים ספציפיים, ומצד שני, משקפים שינויים איכותיים וכמותיים אוכלוסיות תאים בתוך הרקמה פסיפס ובקרב גידולים של גנוטיפים ברורים. כימות התנהגות פולשנית מקל על השוואה של ממאירות הגידול בין גנוטיפים. לבסוף, פרוטוקול המתאר איסוף ועיבוד של EAD פסיפס עבור בידוד RNA הוא מתאים הן יישומים במורד הזרם קטן בקנה מידה גדול כגון שעתוק לאחור ולאחריו qRT-PCR ו-seq mRNA רחב הגנום, בהתאמה. הנתונים האיכותיים והכמותיים המתקבלים מבחנים אלה מספקים תובנות רומן לתוך ההתנהגות החברתית של גידולים משובטים. יתר על כן, הם מייצרים בסיס איתן ללימודים תפקודיים על עצם את התפקיד של גנים בודדים, רשתות גנטיות microenvironment גידול בשלבים שונים והיבטים של tumorigenesis.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: עבודה זו מנצלת את eyFLP1; מעשה> y +> Gal4, כטב"מ- GFP; FRT82B, גיגית-Gal80 MARCM 82B הירוק הבוחן קו 11. חציית בתולות בוחן MARCM 82B הירוקה לזכרים של זנים כגון w; כטב"מ-A; כטב"מ-ב RNAi, גנוטיפ mut ג FRT82B יניב צאצאים שבו רקומבינציה mitotic תתרחש בין הזרועות התקינות של כרומוזומים ההומולוגיים 3 rd. בדרך זו, שיבוטים מוטציה הומוזיגוטים הגן c ממוקם דיסטלי לאתר FRT82B יופק בתוך neuroepithelium EAD והמוח. שיבוטים אלה יבטאו GFP, transgene ו dsRNA לכוורו הגן (איור 1 א). קווי הבוחן eyFLP-MARCM שונים עבור רקומבינציה על X, 2L, 2R, 3L ו 3R הוקמו והם זמינים בקהילה זבוב.

1. טיפול טוס, צלבים, ו Staging

  1. הרחב את המניה בודק MARCM המתאים בטמפרטורת החדר על ידי אכלוס bo מרוביםttles בעת ובעונה אחת. תהפוך את המבוגרים לתוך בקבוקים טריים כל 2-3 ימים, כך בתולות מספיק שניתן לגבות עבור צלבים שלאחר מכן.
    הערה: בעת איסוף בתולות, למנוע חשיפה ממושכת ל- CO 2 כמו זה פוגע בפוריות נשית.
  2. בהתאם בסולם של הניסוי, להגדיר צלבים לטוס צלוחיות באמצעות לפחות 10 בתולות בוחן MARCM ו -4 גברים (למשל, הדמיה של כתבי ניאון ו immunostaining) או בבקבוקים עם לפחות 30 בתולות ו -10 גברים (למשל, עבור בידוד RNA וכימות הפולשנות).
  3. תרי צאצאים של 25 מעלות צלזיוס מתחת יום ארוך 16 שעות / 8 שעות מחזור אור כהה. תהפכו להורים לתוך צלוחיות / בקבוקים חדשים כל 24 שעות כדי להקל staging לשחזור של הזחלים כדי למנוע צפיפות יתר.
    הערה: החל ביום 6 לאחר ההטלה (AEL), ההאכלה להפסיק זחלים מלא instar השלישית המנוחה, להתחיל נדודים וזן pupariation. לעומת זאת, תחילת מעבר זחל-הגלמים ניתן לדההנח או אפסי זחלים עם EAD נושאות גידולים המשובטים hyperplastic או ממאיר.

2. איסוף שלישי Instar זחלים

  1. עבור immunostaining, לאסוף כ -20 זחלי instar שלישיים מאוחר (נדודים על הקיר לבין אלה של גודל בגוף מקביל מהמזון). שימוש במלקחיים כדי להרים זחלים בעדינים מהבקבוקון או הבקבוק ולהעביר אותם לתוך צלחת זכוכית עובר מלאה מלוח פוספט שנאגר (PBS).
    1. עבור בידוד RNA וכימותי הפולשנות, לאסוף לפחות 80 זחלי instar שלישיים מאוחר (נדודים על הקיר לבין אלה של גודל בגוף מקביל מהמזון). השתמש בקבוק להשפריץ להשפריץ PBS לתוך בקבוק מרחף שמכיל זחלים עד פני השטח מכוסים.
    2. לרכך את השכבות העליונות של מזון עם מרית ויוצקים את מחית מזון המכיל הזחלים לתוך צלחת פטרי. בעזרת מלקחיים, בעדינות להרים זחלים ולהעביר אותם לתוך צלחת זכוכית עובר המלאה PBS.
  2. לשטוף זחלים עם PBS until כל האוכל שיורית מוסר. בדוק את הזחלים תחת סטראו הניאון עם 8 עד 16X הגדלה כדי להתעלם מכל "הזחלים נמר" שנושאים כתמי GFP החיובי אקראיים בכל גוף הזחל (איור 2 א, 2 ב ו ראה סעיף דיון).
    הערה: עבור בידוד RNA כולל שלב כביסת הלפני אחרון 70% EtOH דקות 1.
  3. מניח את הצלחת המכילה זחלים שנבחרו ב PBS על קרח עד לנתיחה. זחלי תהליך בתוך 30 דקות כדי למנוע תופעות לוואי של קור ורעב.

3. Dissection של הזחלים

  1. כדי לנתח את EAD תחת סטראו, להשתמש זוג אחד של מלקחיים ללחוץ על החלק האמצעי בעדינות של הזחל נגד בתחתית צלחת זכוכית. בעזרת המלקחיים השניים, לתפוס את פי ווי זחל ולמשוך אותם מהגוף (איור 2 ג).
    הערה: כוח המשיכה היא לעתים קרובות מספיק כדי לשבור את גבעולי הראיה המקשר את EAD פאיr אל האונות במוח. אם המוח או חלקיו להישאר קשור EAD ונוכחותם אינה רצויה עבור יישומים נוספים, לחתוך את הגבעולים האופטיים עם עזרה של שני זוגות מלקחיים. עבור גידולי פולשני (למשל, ראס V12 scrib 1) הקשר בין EAD ואת האונות במוח הופך מוסתר יותר ויותר עם הזמן על ידי overgrowing ו תאים נודדים המשובטים.
    1. כדי להכין את מורכבות EAD / המוח עם חוט עצב גחון ללא פגע (VNC) (איור 2 ד), להשתמש במלקחיים כדי לחתוך זחל באמצע הגוף. מחק את חצי האחוריים.
    2. החזק את החצי הקדמי של גוף הזחל בין הקצים אחד מלקחיים, להעיף את הזחל מבפנים החוצה, בכך שדחפו ווי הפה עם קצה המלקחיים השניים על ידי גלגול לציפורן על זה עם זוג המלקחיים הראשון.
  2. בעזרת מלקחיים להסיר את כל הרקמות הזרות בקפידה (למשל, בלוטות רוק, שומן גוף, ואת הבטן) תוך השארת זוג EAD אובמתחם EAD / המוח מחובר ווי הפה. להתיר את הפה ווים מן לציפורן שמעליה. לשחרר את VNC על ידי ניתוק תחזיות axonal הארכת השרירים בגוף האפידרמיס (1B דמויות, 2C, 2D).
    הערה: פי הווים לאפשר מניפולציה בטוחה של רקמות עם מלקחיים להקל טביעתה יעילה יותר והכרה קלה של רקמות במהלך כביסה. גזור מורפולוגיה שינוי EAD יחסית מהר כאשר כל הזמן מבולבל ב PBS. הגבל את הזמן לנתיחה כדי 20-30 דקות.
  3. כדי להעביר את רקמות, מעיל טיפ micropipette P20 ידי pipetting הגוף הנותרים שלדי מספר פעמים למעלה ולמטה. כדי להעביר את מתחמי EAD / מוח גדול יותר, לחתוך את קצה micropipette P20 במספריים.
    הערה: הליך הציפוי הוא קריטי כדי למנוע הידבקות ואובדן הרקמה גזורה במהלך העברה. שימוש micropipette P20 ממזער את העברת PBS לתוך פתרון מקבע, הגבלת דילול רצוי.
    1. עבור immunostaining, להעבירגזור EAD לתוך צינור 0.5 מ"ל מלא 400 μl paraformaldehyde 4% מקבע (PFA). השתמש 1.5 צינור מ"ל עם 1 מ"ל PFA עבור EAD גדול / מתחמי המוח מיועד הניקוד הפולשנות.
      זהירות: PFA היא רעילה ביותר. יש להשתמש בכפפות וביגוד מגן. יש להימנע ממגע עם עור, עיניים או ריריות.
    2. עבור בידוד RNA להעביר את EAD גזור לתוך צלחת זכוכית חדשה מלאות PBS קר. שימוש במלקחיים כדי לנקות EAD מבלוטות טבעת הלימפה, כדי למזער זיהומים מדגמים.
    3. לנתק את EAD מן הפה הווים על ידי ניתוק הקשר בין דיסקי אנטנת ווי פה באמצעות מלקחיים (2E איור). כדי למנוע שפלת RNA וממצאי ביטוי גנים, להגביל את זמן הניתוח עד 30 דקות. עבור לשלב 7.
      הערה: חוקר מנוסה יכול לנתח כ -60 זחלים בזמן למעט 30 דקות הדרוש לאיסוף כביסת זחלים. תשואות RNA סה"כ תלוי בגודל EAD שמשתנה בין גנוטיפים developmentaבשלבי l. דיסקציה של זוגות 80-100 מלא EAD מן זחלי instar שלישיים מנוחים אמורה להניב רנ"א הכל 5-8 מיקרוגרם.

תיקון 4., Immunostaining, ו השמה

  1. תקן דגימות מקבע PFA במשך 25 דקות תוך nutating בטמפרטורת החדר. שעת הקיבעון יכול להתארך עד 60 דקות מבלי לשנות מורפולוגיה רקמות ואת antigenicity של חלבונים.
  2. הסר את דגימות מקבע לשטוף עם PBST (PBS עם 0.1% Triton X-100) שלוש פעמים במשך 10 דקות באמצעות nutator. השתמש נפח מספיק של PBST עבור כל צעד כביסה (400 μl / 0.5 צינור מ"ל).
    הערה: קבוע מתחמי EAD / המוח מיועד הניקוד הפולשנות אינם דורשים immunostaining. אות ה- GFP נשארה גם גלויה לאחר קיבוע. עבור לשלב 4.4 לנתיחה הסופית.
    1. עבור immunostaining, רקמת בלוק 200 μl של פתרון לחסימת (PBST עם 0.3% BSA) במשך 20 דקות עם תסיסה עדינה בטמפרטורת החדר.
      1. דגירה עם חסודהנוגדנים האר"י מדוללים 100 μl של פתרון חסימת הלילה ב 4 ° C תוך רעד בעדינות. עיין גיליון נוגדן ראשוני או ספרות שפורסמה בגין דילול נוגדן מומלץ.
        הערה: דילול הנוגדן הראשוני עלול צריך להיות מותאם.
      2. לאחר חמש שוטף 10 דקות ב PBST, רקמת הכתם עם נוגדנים משני ניאון מדולל חסימת פתרון תוך רעד בעדינות במשך 2 שעות בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 ° C בחושך.
      3. לשטוף דגימות שלוש פעמים 10 דקות PBST.
  3. החלף PBST עם 500 μl של פתרון DAPI מכתים. כדי לתייג F- אקטין, להוסיף phalloidin מצומדות כדי פלורסנט לצבוע פתרון DAPI מכתים. לאחר 15 דקות nutation בחושך, לשטוף רקמות פעם במשך 10 דקות עם PBST.
    הערה: F- אקטין תיוג יכול להתבצע באופן עצמאי של מכתים DAPI.
  4. עבור השלב הסופי לנתיחה, להעביר רקמות בחזרה לתוך צלחת זכוכית PBS מלא באמצעות pi 1 מ"לpette. באמצעות שני זוגות מלקחיים קליפ את פי ווים.
    1. הפרד את המוח אשר ישמש כימות של הפולשנות מן EAD על ידי חיתוך הגבעול האופטי כמו EAD מגודל עלול להקשות על הניתוח.
  5. מניח ירידה של מדיום ההרכבה (15 μl עבור coverslip 22 מ"מ x 22 מ"מ) על שקופית אובייקטיבית. בעזרת טיפים מלקחיים, להפיץ המדיום לתוך שכבה דקה. העבר EAD, המוח או מתחמי EAD / המוח לתוך המדיום גובר עם micropipette P20.
  6. השתמש בעצות מלקחיים או מוט טונגסטן להפיץ רקמות וליישר את VNC בשקופית.
  7. כדי למנוע היווצרות של בועות תוך הרכבה, המגע הראשון קצה אחד של coverslip אל המדיום גובר ואז מורידים לאט על הרכבה בינונית בעזרת מלקחיים. השתמש חתיכות קטנות של נייר סינון או רקמות לנגב לספוג הרכבה בינונית עודף בקצוות coverslip.
    הערה: DABCO / פולי (ויניל אלכוהול) 4-88 הרכבה מתקשה בינוניב 4 ° C תוך שעה. שקופיות יכול להיות מאוחסן במשך חודשים 4 ° C.

5. הדמיה Confocal

  1. רוכשת חלקים confocal יחיד ערימות באמצעות מיקרוסקופ confocal מצויד 20X, מטרות שמן 40X ו 60X.
  2. למנוע רווית פיקסל. השתמש באותם פרמטרים רכישת התמונה כולל רזולוציית התמונה, כוח קלט לייזר, רווח, אופסט, מיצוע מסגרת, גודל צעד בסדרה-z ולשמור הגדרות אלה עבור כל גנוטיפים כדי לאפשר השוואתם של עוצמות פיקסל בין גנוטיפים שונים 21,22.
    הערה: להדמיה של מורכבות EAD / מוח, ליצור תחזיות מקסימלית לתפור בהתאמה, תמונות שכנות. להכנת תמונה סופית, השתמש בתוכנה לעיבוד תמונות פוסט להרכבה בלוח וכדי לכוון את הבהירות והניגודיות.

כימות 6. גידול הפולשנות

  1. גדר שיטת ניקוד שתאפיין את הרמות השונות של invasivenes גידולזה בהתחשב דפוס המרחבים של פלישה ואת כמות תאי GFP החיובי מתפשטים לתוך מוח VNC. הכן מגיליונות ההערכה למסמכים (איור 3 א).
  2. הר לפחות 80 קבוע המוח ללא שינוי בכל גנוטיפ בשקופית אחת באמצעות 40 μl של הרכבה בינונית לכל 24 מ"מ x 50 מ"מ coverslip.
    1. כדי לאפשר ניקוד משוחד, לשאול צד ניטראלי לאנונימי השקופיות, כך שנוהל הניקוד משוחד. להעריך שקופיות ואנונימי ידי שני חברי המעבדה באופן עצמאי. לחשוף גנוטיפים רק לאחר הספירה נגמרה.
  3. להעריך את מידת ממאירות על ידי הבקיע עיוור של המוח רכוב תחת סטראו פלורסנט מצויד להגדיר מסנן GFP. השתמש סמן כדי לתייג את המוח כי נצפה כבר להימנע מספירה כפולה (איור 3 ב).
  4. חישוב אחוזי המוח נופל לתוך אחת מהקטגוריות פולשנית המוגדרות לכל גנוטיפ. קבע את הים הסטטיסטיignificance באמצעות מבחן חי בריבוע (איור 3 ג).

7. בידוד RNA, טיפול DNase, ולבדוק את איכות

הערה: כל ריאגנטים (פתרונות, plasticware) שמשמש בשלבים הבאים צריך להיות חופשי של פעילות RNase. תמיד ללבוש כפפות ולהשתמש במנדף כימי לעבודה עם ממסים אורגניים.

  1. מעביר את EAD הנקי עם טיפ micropipette P20 מצופה לתוך 1.5 מיליליטר צינור.
  2. בואו כיור רקמה על החלק התחתון של הצינור, להסיר בזהירות PBS ולהחליפה 100 מגיב μl תמוגה RNA (מספיק עד 140 EAD).
  3. Lyse הרקמה על ידי vortexing. בשלב זה, דגימות יכולות להיות עמוקות קפוא בחנקן נוזלי מאוחסן ב -80 ° C או מעובד באופן ישיר עם פרוטוקול בידוד RNA סטנדרטי.
    הערה: דוגמאות של גנוטיפים דומה סיבובים לנתיחה מרובים ניתן ונקווה פעם מגיב תמוגה RNA.
  4. מלאו את נפח דגימה 0.9 מ"ל עם מגיב תמוגה RNA. להוסיף 0.2 מ"ל של כלורופורם ומערבבים דגימות Vigorously במשך 15-20 שניות.
  5. לאחר דגירה 2 עד 3 דקות בטמפרטורת החדר, בצנטריפוגה דגימות XG 10,000 במשך 15 דקות ב 4 ° C.
  6. העבר בשלב מימית העליון חסר צבע RNA המכיל לתוך צינור טרי מבלי להפריע את שלבי הביניים. התרחקו שלבי מכיוון שהיא מכילה חלבונים ו- DNA הגנומי.
    הערה: נפח התאושש צריך להיות כ -60% מנפח של מגיב תמוגה RNA המשמש המגון.
  7. לזרז את הרנ"א על ​​ידי הוספת 0.5 מ"ל של אלכוהול איזופרופיל. וורטקס דגירה דגימות בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
  8. צנטריפוגה דגימות XG 10,000 במשך 15 דקות ב 4 ° C..
  9. בטל supernatant ולשטוף את גלולת RNA פעם עם 600 μl של אתנול 75%. אחרי מערבולת צנטריפוגה קצרה (XG 10,000 במשך 7 דקות ב 4 ° C) וזורק את כל אתנול ולתת גלולת RNA-אוויר יבש למשך 5-10 דקות צבת הצינור הפתוח על רקמות נקיות לנגב.
    הערה: גלולת RNA עשויה להיות גלויה כמו st לבן / אטום זעירבשלים בתחתית הצינור או סמויה. טיפות אתנול הנותרים ניתן להסיר בזהירות עם קצה micropipette P10.
  10. ממיסים רנ"א 50 μl מים DEPC שטופלו על ידי vortexing או עובר פתרון כמה פעמים באמצעות קצה פיפטה.
  11. כדי למזער זיהום עם הדנ"א הגנומי, לטפל RNA הכולל עם DNase על ידי הוספת 50 μl של תערובת המכילה 1 μl של DNase (2 U / μl) ו -10 μl של 10x חיץ DNase במים DEPC שטופלו. וורטקס ו ספין למטה.
  12. דגירת דגימות ב 37 מעלות צלזיוס באמבט מים או בלוק חימום במשך 30 עד 40 דקות. לאחר דגירה, להוסיף 100 μl של מים DEPC שטופלו לתוך מדגם זה.
  13. כדי להשבית את הפעילות האנזימטית ו- RNA נקייה DNase, להוסיף 200 μl של פנול: כלורופורם: isoamyl אלכוהול (25: 24: 1) פתרון, מערבולת דקות 1 ו צנטריפוגות דגימות ב XG 10,000 במשך 7 דקות ב 4 ° C.
  14. להעביר בזהירות את השלב מהימי העליון המכיל RNA לתוך צינור טרי. להוסיף נפח שווה (200 μl)של כלורופורם, לערבב וחזור על צעד צנטריפוגה מלמעלה.
  15. אסוף בקפידה השלב העליון המשקע RNA על ידי הוספת 1/10 נפח של נתרן אצטט M 3, pH 5.2 ערוכים DEPC H 2 O ו 2.5 כרכים של אתנול 100%. מערבבים היטב על ידי vortexing.
    הערה: הוספת 0.5 גליקוגן μl (20 מיקרוגרם / μl) כדי שילוב ממטרים עוזרת לדמיין גלולת RNA. כדי להקטין את איבוד RNA, השתמש siliconized, נמוך מחייב צינורות 1.5 מ"ל microcentrifuge.
  16. משקע RNA ב -20 מעלות צלזיוס במשך לפחות 1 שעה.
    ההערה: הדגירה עלולה להתבצע בין לילה. דוגמאות ניתן להציב ב -80 ° C, כמו גם.
  17. גלולה הרנ"א על ​​ידי צנטריפוגה ב XG 10,000 למשך 30 דקות ב 4 ° C. לשטוף גלולה ויבשה, לאחר התיאור 7.9.
  18. ממיסים רנ"א 10-15 μl מים DEPC שטופלו. RNA החנות ב -80 מעלות צלזיוס.
  19. לקבוע כמות וטוהר של RNA על ידי מדידת OD ב 230 ננומטר, 260 ננומטר ו -280 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר. חישוב שיתוף RNAncentration ידי החלת האמנה כי 1 OD ב 260 ננומטר שווה 40 מיקרוגרם / מ"ל ​​RNA.
    הערה: היחס 260/280 של "טהור" RNA שווה 2.0 ואילו יחס 260/230 צריך להיות בטווח של 2.0-2.2. דגימות רנ"א עם יחס 260/280 בין 1.7 ו -2.0 מתאימות ליישומים במורד כגון סינתזת cDNA. עבור הכנת ספריות mRNA-seq את האיכות והכמות של RNA צריכה להיבדק באמצעות מערכת אלקטרופורזה אוטומטית. יחס 28S / 18S צריך להיות מעל 1.8.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כדי להדגים את הפוטנציאל של טכניקת eyFLP-MARCM ליצור תיקוני מסומן GFP של גנוטיפים שהוגדרו תסיסנית EAD, שלושה סוגים של שיבוטים היו מושרים: (1) GFP להביע בקרה בלבד (2) גידולים ממאירים הבעת טופס שבעור של קטן G- חלבון ראס (ראס V12) ב רקע של אובדן הומוזיגוטים של שרבוט גנים מדכאי סרטן (scrib 1) ו- (3) overgrowing אבל לא פולשנית ראס V12 scrib 1 JNK שיבוטים DN,

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הטכניקות כדי ליצור פסיפסים גנטיים תסיסנית הם בין הכלים המתוחכמים ביותר לניתוח וטיפול גן פונקצית 33. מערכת eyFLP-MARCM הוכיחה חזקה ויציבה שכן היא מאפשרת האינדוקציה של מסומן באופן ויזואלי, שיבוטים מוגדרים גנטי באופן מוגבל מרחבית, כלומר, ברקמות שבו משפר חסר העיניים היא 9,18 פעיל. הדבר חשוב במיוחד כאשר נגעים גנטיים מרובים משולבים אותם התאים. למרות היותו מאוד אלה תיקונים סוטים להתיר התפתחות זחל כאשר מוגבל neuroepithelia EAD והמוח, הם עלו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם ניגוד אינטרסים.

תודות

אנו מודים למרכז המניות של בלומינגטון (בלומינגטון, ארה"ב), דירק בוהמן, קטיה ברוקנר ואישטוואן אנדו על מלאי הזבובים והנוגדנים. אנו מודים למארק ג'ינדרה ולקולין דונוהו על ההערות על כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי פרס Sofja Kovalevskaja ל-M.U. מקרן אלכסנדר פון הומבולדט ופרויקט DFG UH243/1-1 ל-M.U. מקרן המחקר הגרמנית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אגרגווü rzmü hle Brecht, Eggenstein, גרמניה00262-0500מתכון למזון זבובים: הכינו 20 ליטר מזון זבוב עם 160 גרם אגר, 360 גרם שמרים, 200 גרם קמח סויה, 1.6 ק"ג קמח תירס צהוב, 1.2 ליטר תמצית מאלט, 300 מ"ל סירופ תירס בהיר, 130 מ"ל חומצה פרופיונית ו -200 מ"ל 15% ניפגין. יש לבשל מזון זבובים במשך שעה ב-85  °C.
סירופ תירסGrafschafter Krautfabrik Josef Schmitz KG, מקנהיים, גרמניה01939
חומצה פרופיוניתCarl Roth GmbH, קרלסרוהה, גרמניה6026.1
CornmealReformKontor GmbH, Zarrentin, גרמניה4010155063948
תמצית מאלטCSM Deutschland GmbH, ברמן, גרמניה728985
קמח סויהStockmeier Food GmbH, הרפורד, גרמניה1000246441010
YeastWerner Ramspeck GmbH, Schwabach, גרמניה210099K
Methyl-4-benzoate/ NipaginSigma-Aldrich, Deisenhofen, גרמניהH5501הכן תמיסת מלאי של 15% עם 70%
בקבוקוני מזון זבובים של EtOH DrosophilaKisker Biotech, שטיינפורט, גרמניה789008
פקקי בקבוקוןK-TK e.K., Retzstadt, גרמניה1002
בקבוקי מזון זבוב דרוזופילהGreiner Bio-One, Frickenhausen, גרמניה960177
פקקי בקבוקיםK-TK e.K., Retzstadt, גרמניה1002 S
Poly (אלכוהול ויניל) 4-88/[-CH2CHOH-]nSigma-Aldrich, Deisenhofen, גרמניה81381מתכון בינוני הרכבה: ממיסים 6 גרם פולי (אלכוהול ויניל) 4-88 ב 39  מ"ל Millipore H2O, 6 מ"ל 1 M Tris (pH 8.5) ו-12.5 מ"ל גליצרול. ערבבו למשך הלילה בחום של 50  ° C וצנטריפוגה 20  דקה ב-5,000 סל"ד. הוסף את DABCO לסופרנטנט כדי לקבל ריכוז סופי של 2.5%. אחסן את הכמות ב -20  °C.
1,4-דיאזאביציקלו[2.2.2]אוקטן/ DABCO Sigma-Aldrich, Deisenhofen, גרמניהD2522
Triton X-100Sigma-Aldrich, Deisenhofen, גרמניה9002-93-1
תמיסת מלח חוצצת פוספט / PBS137 מ"מ NaCl, 2.7 מ"מ KCl, 10 מ"מ Na2HPO4 ו-1.8 mM KH2PO4, pH 7.4 ב- Millipore H2O
PBST0.1% Triton X-100 ב- PBS
Paraformaldehyde / PFASigma-Aldrich, Deisenhofen, גרמניה158127מתכון קיבוע 4% PFA: להמיס 4  גרם PFA ב-80 מ"ל Millipore H2O על צלחת מערבל מגנטית המחוממת ל-55  °C. הוסף 1 M NaOH טיפתית עד שכל חלקיקי ה-PFA מומסים. הוסף 10 מ"ל 10x PBS והתאם את ה-pH ל-7.4 עם 1 M HCl. מערבבים פנימה 100 ומיקרו; l Triton X-100 וממלאים ב-Millipore H2O עד 100 מ"ל. אחסן את המינון בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס. הימנע מהפשרה חוזרת. (זהירות: PFA רעיל מאוד. הכן את קיבוע ה-PFA במכסה אדים. ללבוש מכשיר נשימה עצמאי, כפפות ובגדים. יש להימנע ממגע עם העור, העיניים או הריריות.)
סרום בקר אלבומין / BSASigma-Aldrich, Deisenhofen, גרמניהA3059מתכון לתמיסת חסימה: ממיסים 0.3% BSA ב- PBST
Fluorescently phalloidinInvitrogen, קרלסרוהה, גרמניה, בדיקות מולקולריותA12379, A22283, A22284תמיסת מלאי פלואידין: ממיסים אבקה (300 U) ב -1.5 מ"ל מתנול. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס. לצביעה, השתמש בדילול 1:250 (A12379, A22283) ו-1:100 (A22284) ב-PBST.
4',6-Diamidino-2-phenylindol Dihydrochlorid/ DAPICarl Roth GmbH, קרלסרוהה, גרמניה6335תמיסת צביעה DAPI: הכן תמיסת מלאי של 5 מ"ג/מ"ל ב-Millipore H2O ואחסן את הכמות ב-4 °C. משמש בדילול 1:1,000 ב-PBST.
נוגדן נגד H2 עכברKurucz et al., 2003משמש בדילול 1:500 בתמיסה חוסמת
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch, Suffolk, UK715-175-151משמש בדילול 1:500 בתמיסת חסימה
Dumont #5 מלקחייםFine Science Tools, היידלברג, גרמניה11295-10
צלחת עובר זכוכית (30  mm)Thermo Scientific, Schwerte, גרמניהE90
מחטי טונגסטןFine Science Tools, היידלברג, גרמניה10130-20
מחזיק סיכות מצופה ניקלFine Science Tools, היידלברג, גרמניה26018-17
שקופיות מיקרוסקופVWR, דרמשטדט, גרמניה631-1553
כיסויים 22 x 22 מ"מ (#1 Menzel-Glä ser)VWR, דרמשטדט, גרמניה631-1336
כיסויים 24 x 50 מ"מ (0.13-0.16  mm)Thermo Scientific, Schwerte, גרמניה1076371
Kimtech Science מגבונים מדויקיםThermo Scientific, שוורטה, גרמניה06-677-70
ניתוח סטריאומיקרוסקופאולימפוס, המבורג, גרמניהSZX7 (DF PLAPO 1X-4 יפן)
סטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטיאולימפוס, המבורג, גרמניהSZX16 (SDF PLAPO 0.8X יפן) עם מצלמתDP72 CCDמצויד בסט מסנן הפס הכחול הצר לעירור של GFP, פלואורוכרומים מעוררים כחולים אחרים (מסנן עירור BP460-480 ננומטר, מסנן מחסום BA495-540 ננומטר) ועירור ירוק צר ומסנן מחסום ארוך עבור RFP ופלואורוכרומים מעוררים ירוקים אחרים (מסנן עירור BP530-550, מסנן מחסום BA575IF). תוכנה: Olympus cellSens Standard 1.11.
מיקרוסקופ קונפוקליאולימפוס, המבורג, גרמניהFV1000מצויד במיקרוסקופ IX81 הפוך. מטרות: 20 פעמים; UPlan S-Apo (NA 0.85), 40 ופעמים; UPlanFL (NA 1.30) ו-60× UPlanApo (NA 1.35). לייזרים: דיודת לייזר UV LD405 (50  mW), לייזר ארגון, רב קווי 457/(476)/ 488/515 (40  mW), דיודת לייזר צהובה/ירוקה LD560 (15  mW) ודיודת לייזר אדומה 635 (20  mW). תוכנה: Fluoview 2.1c תוכנה
חממה מקוררת דרוזופילה EwaldInnovationstechnik GmbH, באד ננדורף, גרמניה  Sanyo MIR553
Squirt bottleVWR , דרמשטאדט, גרמניה215-8105
BD Clay Adams NutatorMixer VWR , דרמשטאדט, גרמניה15172-203
ELMI Digital Rocking ShakerVWR, דרמשטאדט, גרמניהDRS-12
5 PRIME Isol-RNA Lysis ReagentVWR, דרמשטאדט, גרמניה2302700הפרוטוקול תואם לריאגנטים אחרים מבוססי TRIzol, למשל , TRIreagent מבית Sigma (Cat. Nr.T9424), מגיב TRIzol מתרמופישר (Cat. Nr. 15596).
דיאתיל פירוקרבונט / DEPCSigma-Aldrich, Deisenhofen, גרמניהD5758לדלל DEPC 1:1,000 ב- Millipore H2O, לערבב למשך הלילה ולחטוף.
פנול UltraPure : כלורופורם: אלכוהול איזואמיל (25: 24: 1)ThermoFischer Scientific, Invitrogen, קרלסרוהה, גרמניה15593-031
כלורופורםMerck, דרמשטדט, גרמניה102445
TURBO DNase (2 U/µ l)Thermo Scientific, שוורטה, גרמניהAM2238
Invitrogen UltraPure GlycogenThermoFischer Scientific, Invitrogen, קרלסרוהה, גרמניה10-814-010
נתרן אצטט טריהידרטVWR, דרמשטדט, גרמניה27652.232הכן תמיסת נתרן אצטט 3 M עם DEPC-H2O והתאם את ה-pH ל-5.2-פרופנול
Merck, דרמשטדט, גרמניה
אתנולמרק, דרמשטדט, גרמניה100983להכין דילול של 75% EtOH עם DEPC-H2O.
UV/Vis-Spectrophotometre NanoDrop ND-8000Thermo Scientific, שוורטה, גרמניהND-8000
Eppendorf Microcentrifuge (מקורר)Thermo Scientific, שוורטה, גרמניה5417R
Experion RNA StdSens Analysis KitBio-Rad Laboratories GmbH, Mü nchen, גרמניה7007103
Experion Automated Electrophoresis StationBio-Rad Laboratories GmbH, Mü nchen, גרמניה7007010
SuperScript III Reverse TranscriptaseThermo Scientific, Schwerte, גרמניה18080044
Oligo d(T) PrimerIntegrated DNA Technologies, Leuven, BelgiumPrepare 100 µ פתרונות מלאי M ב-DEPC-H2O ומאחסנים ב-20 מעלות; C
dNTP BlendTakara Bio Europe/Clonetech, Saint-Germain-en-Laye, צרפת4030חנות מינויים של 25 ומיקרו; l ב-20° C
CFX96 מגע מערכת זיהוי PCR בזמן אמתBio-Rad Laboratories GmbH, Mü nchen, גרמניה1855195
iQ SYBR Green SupermixBio-Rad Laboratories GmbH, Mü nchen, גרמניה170-8882
צלחות PCR עם מעטפת קשה 96 בארות, קיר דקBio-Rad Laboratories GmbH, Mü nchen, גרמניהHSP9601
Microseal 'B' FilmBio-Rad Laboratories GmbH, Mü nchen, גרמניהMSB1001
rp49 פריימר קדימהטכנולוגיות DNA משולבות, לובן, בלגיה5' TCC TAC CAG CTT CAA GAT GAC 3'
rp49 פריימר הפוךטכנולוגיות DNA משולבות, לובן, בלגיה5' CAC GTT GTG CAC CAG GAA CT 3'
mmp1 פריימר קדימהטכנולוגיות DNA משולבות, לוון, בלגיה5' AGG GCG ACA AGT ACT ACA AGC TGA 3'
mmp1 פריימר הפוךטכנולוגיות DNA משולבות, לובן, בלגיה5' ACG TCT TGC CGT TCT TGT AGG TGA 3'
109634

מקורות

  1. Miles, W. O., Dyson, N. J., Walker, J. A. Modeling tumor invasion and metastasis in Drosophila. Dis Model Mech. 4 (6), 753-761 (2011).
  2. Stefanatos, R. K. A., Vidal, M. Tumor invasion and metastasis in Drosophila: a bold past, a bright future. J Genet Genomics. 38 (10), 431-438 (2011).
  3. Patel, P. H., Edgar, B. A. Tissue design: How Drosophila tumors remodel their neighborhood. Semin Cell Dev Biol. 28, 86-95 (2014).
  4. Gonzalez, C. Drosophila melanogaster: a model and a tool to investigate malignancy and identify new therapeutics. Nat Rev Cancer. 13 (3), 172-183 (2013).
  5. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends Neurosci. 24 (5), 251-254 (2001).
  6. Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
  7. Struhl, G., Basler, K. Organizing activity of wingless protein in Drosophila. Cell. 72 (4), 527-540 (1993).
  8. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  9. Wu, J. S., Luo, L. A protocol for mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) in Drosophila. Nat Protoc. 1 (6), 2583-2589 (2006).
  10. Brumby, A. M., Richardson, H. E. scribble mutants cooperate with oncogenic Ras or Notch to cause neoplastic overgrowth in Drosophila. EMBO J. 22 (21), 5769-5779 (2003).
  11. Pagliarini, R. A., Xu, T. A genetic screen in Drosophila for metastatic behavior. Science (New York, NY). 302 (5648), 1227-1231 (2003).
  12. Uhlirova, M., Bohmann, D. JNK- and Fos-regulated Mmp1 expression cooperates with Ras to induce invasive tumors in Drosophila. EMBO J. 25 (22), 5294-5304 (2006).
  13. Turkel, N., et al. The BTB-zinc finger transcription factor abrupt acts as an epithelial oncogene in Drosophila melanogaster through maintaining a progenitor-like cell state. PLoS Genet. 9 (7), e1003627(2013).
  14. Cordero, J. B., et al. Oncogenic Ras Diverts a Host TNF Tumor Suppressor Activity into Tumor Promoter. Dev Cell. 18 (6), 999-1011 (2010).
  15. Khoo, P., Allan, K., Willoughby, L., Brumby, A. M., Richardson, H. E. In Drosophila, RhoGEF2 cooperates with activated Ras in tumorigenesis through a pathway involving Rho1-Rok-Myosin-II and JNK signalling. Dis Model Mech. 6, 661-678 (2013).
  16. Jiang, Y., Scott, K. L., Kwak, S. J., Chen, R., Mardon, G. Sds22/PP1 links epithelial integrity and tumor suppression via regulation of myosin II and JNK signaling. Oncogene. 30 (29), 3248-3260 (2011).
  17. Figueroa-Clarevega, A., Bilder, D. Malignant Drosophila Tumors Interrupt Insulin Signaling to Induce Cachexia-like Wasting. Dev Cell. 33 (1), 47-55 (2015).
  18. Newsome, T. P., Asling, B., Dickson, B. J. Analysis of Drosophila photoreceptor axon guidance in eye-specific mosaics. Development. 127 (4), 851-860 (2000).
  19. Quiring, R., Walldorf, U., Kloter, U., Gehring, W. J. Homology of the eyeless gene of Drosophila to the Small eye gene in mice and Aniridia in humans. Science. 265 (5173), 785-789 (1994).
  20. Külshammer, E., Uhlirova, M. The actin cross-linker Filamin/Cheerio mediates tumor malignancy downstream of JNK signaling. J Cell Sci. 126 (Pt 4), 927-938 (2013).
  21. North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. J Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).
  22. Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. J Cell Biol. 185 (7), 1135-1148 (2009).
  23. Igaki, T., Pagliarini, R. A., Xu, T. Loss of cell polarity drives tumor growth and invasion through JNK activation in Drosophila. Curr Biol. 16 (11), 1139-1146 (2006).
  24. Külshammer, E., et al. Interplay among Drosophila transcription factors Ets21c, Fos and Ftz-F1 drives JNK-mediated tumor malignancy. Dis Model Mech. 8 (10), 1279-1293 (2015).
  25. Pastor-Pareja, J. C., Wu, M., Xu, T. An innate immune response of blood cells to tumors and tissue damage in Drosophila. Dis Model Mech. 1 (2-3), 144-154 (2008).
  26. Chatterjee, N., Bohmann, D. A versatile ΦC31 based reporter system for measuring AP-1 and Nrf2 signaling in Drosophila and in tissue culture. PloS One. 7 (4), e34063(2012).
  27. Petraki, S., Alexander, B., Brückner, K. Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva. J Vis Exp. (105), (2015).
  28. Makhijani, K., Alexander, B., Tanaka, T., Rulifson, E., Bruckner, K. The peripheral nervous system supports blood cell homing and survival in the Drosophila larva. Development. 138 (24), 5379-5391 (2011).
  29. Kurucz, E., et al. Hemese, a hemocyte-specific transmembrane protein, affects the cellular immune response in Drosophila. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (5), 2622-2627 (2003).
  30. Andersen, D. S., et al. The Drosophila TNF receptor Grindelwald couples loss of cell polarity and neoplastic growth. Nature. 522 (7557), 482-486 (2015).
  31. Srivastava, A., Pastor-Pareja, J. C., Igaki, T., Pagliarini, R., Xu, T. Basement membrane remodeling is essential for Drosophila disc eversion and tumor invasion. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (8), 2721-2726 (2007).
  32. Larionov, A., Krause, A., Miller, W. A standard curve based method for relative real time PCR data processing. BMC Bioinformatics. 6 (1), (2005).
  33. Blair, S. S. Genetic mosaic techniques for studying Drosophila development. Development. 130 (21), 5065-5072 (2003).
  34. Mirth, C. K., Shingleton, A. W. Integrating body and organ size in Drosophila: recent advances and outstanding problems. Front Endocrinol. 3 (49), (2012).
  35. French, V., Feast, M., Partridge, L. Body size and cell size in Drosophila: the developmental response to temperature. J Insect Physiol. 44 (11), 1081-1089 (1998).
  36. Ashburner, M., Bonner, J. J. The induction of gene activity in drosophila by heat shock. Cell. 17 (2), 241-254 (1979).
  37. Frazier, M. R., Woods, H. A., Harrison, J. F. Interactive effects of rearing temperature and oxygen on the development of Drosophila melanogaster. Physiol Biochem Zool. 74 (5), 641-650 (2001).
  38. Lai, S. L., Lee, T. Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila. Nat Neurosci. 9 (5), 703-709 (2006).
  39. Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis. Cell. 141 (3), 536-548 (2010).
  40. del Valle Rodrìguez, A., Didiano, D., Desplan, C. Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila. Nature Methods. 9 (1), 47-55 (2011).
  41. Rynes, J., et al. Activating Transcription Factor 3 Regulates Immune and Metabolic Homeostasis. Mol Cell Biol. 32 (19), 3949-3962 (2012).
  42. Claudius, A. K., Romani, P., Lamkemeyer, T., Jindra, M., Uhlirova, M. Unexpected role of the steroid-deficiency protein ecdysoneless in pre-mRNA splicing. PLoS Genet. 10 (4), e1004287(2014).
  43. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J Vis Exp. (41), (2010).
  44. Tauc, H. M., Tasdogan, A., Pandur, P. Isolating intestinal stem cells from adult Drosophila midguts by FACS to study stem cell behavior during aging. J Vis Exp. (94), (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

טכניקת MARCMמיקרוסקופיה פלואורסצנטיתדימיון קונפוקאליבידוד RNAסיגנלינג של JNKחדירת המוציטיםביטוי של MMP1
ה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.