מאמר שיטה

חיישן מבוסס-Polyaniline של חומצות גרעין

DOI:

10.3791/54590

⸱

1 בנובמבר 2016

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Southern Mississippi

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חומצות גרעין הן אנליטים נפוצים להערכת מערכות ביולוגיות; עם זאת, הטיה ממניפולציה אנזימטית עלולה לגרום לדאגה. כאן מתוארת שיטה לזיהוי ללא תווית של חומצות גרעין באמצעות פוליאנילין. טכנולוגיית חיישנים רגישה וחסכונית זו יכולה להבחין בהבדלים בין נוקלאוטידים בודדים בין מולקולות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איתור חומצות גרעין נמצא במרכז טכנולוגיות האבחון המשמשות במחקר ובקליניקה. גישות סטנדרטיות המשמשות בטכנולוגיות אלה מסתמכות על שינוי אנזימטי שיכול להכניס הטיה וחפצים. מרכיב קריטי בפלטפורמות הגילוי של הדור הבא יהיה חישה מולקולרית ישירה, ובכך ימנע צורך בהגברה או תוויות. ננו-חומרים מתקדמים עשויים לספק את השיטות הכימיות המתאימות למימוש חיישנים ללא תוויות. פולימרים מצומדים הם אידיאליים לחישה ביולוגית, בעלי תכונות התואמות לביומולקולות ומציגים רגישות גבוהה לשינויים סביבתיים מקומיים. במאמר זה מוצגת שיטה לאיתור חומצות גרעין באמצעות הפולימר האלקטרו-מוליך פוליאנילין. אוליגונוקלאוטידים פשוטים של "בדיקה" של DNA המשלימים לחומצות גרעין מטרה מחוברים אלקטרוסטטית לפולימר, ויוצרים מערכת חיישנים שיכולה להבדיל בין הבדלי נוקלאוטידים בודדים במולקולות המטרה. מחוץ לאופי הספציפי והבלתי משוחד של טכנולוגיה זו, היא חסכונית ביותר.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פולימרים מצומדים מספקים אפשרויות רבות לחיישנים מולקולריים. זה כולל תגובות פלואורסצנטיות, אלקטרוניות וקולורימטריות1. נעשו מאמצים רבים לשלב פולימרים מצומדים בחיישני חומצות גרעין. עם זאת, רוב המערכות דורשות גילוי משני, מה שמגביל את אפשרויות החישה2. לאחרונה דיווחנו על פלטפורמת חיישנים מצומדת מבוססת פולימר הבנויה על פוליאנילין (PANI) המנצלת את התכונות של פולימר זה, ויוצרת מערכת נטולת תוויות3. PANI הוא פולימר אלקטרו-אקטיבי מצומד באופן נרחב בעל תכונות כגון פלואורסצנטיות ועמידות המתאימות למדידת מערכות ביולוגיות4. האקסיטונים בתוך המבנה אינם ממוקמים מה שמוביל לניידות של המטען החיובי בין תת-יחידות מונומריות. זה מספק פיגום גמיש של מטענים חיוביים שיכולים לקיים אינטראקציה עם עמוד השדרה הטעון שלילית של DNA5,6. חשוב לציין, DNA מחובר אלקטרוסטטית מכוון כך שבסיסים חנקניים יכולים להשתתף בזיווג בסיסים. אסוציאציה לדנ"א משנה את התכונות האלקטרוניות של PANI, אפקט שניתן להגביר על ידי קרינת UV (איור 1)3. באמצעות מערכת זו, ניתן לשתק אוליגונוקלאוטידים המשלימים לחומצות גרעין מטרה על PANI. מחקרים מרובים הראו כי בעת הכלאה אוליגונוקלאוטידים נספגים אלקטרוסטטית מתנתקים מ-PANI או מטריצות קטיוניות אחרות עקב שינויים קונפורמטיביים הנגרמים על ידי המעבר למבנה DNA דו-גדילי3,5,7.

במערכת חיישנים שבה חיבור הגשושית מווסת את תכונות הפולימר המצומדים, ניתן להמיר אירועי הכלאה ללא תוויות או שינוי אנזימטי של בדיקות או חומצות גרעין מטרה. פולימרים מצומדים מציעים גמישות רבה בשיטות זיהוי, שאחת מהן היא פלואורסצנטיות. באמצעות ניטור פלואורסצנטי PANI, ניתן לזהות ריכוזים של חומצות גרעין מטרה נמוכות עד 10-11 M (10 pM)3. הזיהוי מהיר, מתרחש תוך 15 דקות מרגע ההכלאה, וספציפי כאשר ניתן להבדיל בין אי התאמה בודדת במולקולת מטרה3.

ייצור חיישני PANI הוא פשוט. ניתן לייצר PANI במשקל מולקולרי גבוה המפוזר היטב במים באמצעות הליכי סינתזה סטנדרטיים הכוללים מונומר אנילין, פעילי שטח ותוספת מבוקרת של מחמצן. היבול יכול להיות גבוה מאוד ומחמצן לא מגיב מוסר על ידי שטיפה במים, מה שמבטיח שלא תהיה צמיחה נוספת של PANI. קשר PANI-בדיקה מתרחש באופן ספונטני עם התערובת, והיווצרות מורכבת מוגברת על ידי חשיפה קלה ל-UV. הכלאה יכולה להתבצע באופן מיידי, ולבחון את השינויים בפלואורסצנטיות PANI לאחר דגירה קצרה. הפשטות של טכנולוגיה זו הופכת אותה לנגישה מאוד למעבדות רבות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סינתזה 1. processable פאני

  1. ממיסים אנילין (1 מ"ל, 11 מילימול) לחלוטין ב -60 מ"ל של כלורופורם בתוך 250 מ"ל בבקבוק מסביב לתחתית. מערבבים בסל"ד 600 במשך 5 דקות ומצננים עד 0-5 מעלות צלזיוס עם קרח. זה בדרך כלל לוקח 15-20 דקות (איור 2 א).
  2. להוסיף sulphonate בנזן dodecyl נתרן (NaDBS) (7.44 גר ', 21 מילימול) לפתרון אנילין בבקבוק עגול תחתית תוך ערבוב ב 600 סל"ד.
  3. ממסי אמוניום persulphate (APS) (3.072 גרם, 13.5 mmol) ב 20 מ"ל מים ולהוסיף את כל זה טיפה חכמה יותר מ -30 דקות כדי למנוע התחממות יתר התגובה.
  4. לבצע את התגובה על C 0-5 מעלות למשך 24 שעות, ולאפשר לו להגיע לטמפרטורת החדר למשך 24 שעות.
  5. שים את תערובת התגובה בתחילה להלבין חלבי לאחר 15 דקות, ולאחר מכן חום כהה לאחר 2 שעות, ולבסוף לירוק כהה לאחר 24 שעות (איור 2 ב-F).
  6. סנן הפתרון פאני-NaDBS עם משפך בוכנר. מערבבים עם כלורופורם 80 מ"ל ו -120 מ"ל מים כמומשפך eparation (איור 2G).
  7. דגירת הפתרון למשך 24 שעות בטמפרטורת חדר לאסוף את פאני הירוק כהה מן ארובת ההפרדה, עוזב NaDBS ו APS unreacted ב supernatant המימי.

ערבוב פאני-חללית 2. ו- UV הקרנה

  1. לדלל פתרון פאני 10x עם כלורופורם-מים (1: 3 v / v) ומערבבים 200 μl של פאני מדולל 6.4 μmol של oligonucleotides DNA בדיקה על ידי נדנדה עדין במשך 15 דקות בתוך שפופרת microfuge.
  2. מקרינים הפתרון פאני-DNA עם 1,200 μJ / 2 ס"מ של UV בתוך crosslinker 2 דקות. זה קריטי, כי החשיפה ל- UV מוגבלת לסכום המצוין. חשיפה רבה UV פוגעת שינוי קרינת פאני, כנראה עקב פאני cross-linking של קוולנטיים ו- DNA.
  3. מתחמי גלולה ידי צנטריפוגה ב 17,000 XG במשך 6 דקות, ולשטוף עם בופר פוספט (PBS). גלול שוב, מחדש להשעות ב PBS.

3. Hybridization של חללית פאני

  1. הוסף 8 μl של 100 מיקרומטר oligonucleotides DNA משלימים או למקד חומצות גרעין 200 μl של מתחמי פאני-בדיקה.
  2. בצע הכלאה ידי נדנדת תערובת פתרון במשך 15 דקות ב 40 מעלות צלזיוס.
  3. גלולה מתחמי פאני על ידי צנטריפוגה ב 17,000 XG במשך 6 דקות. לשטוף עם PBS מחדש להשעות במים.

4. פליטה יציבה מדידת קרינת המדינה

  1. להוסיף פאני מטיפולים שונים לתוך microplate 96 באר ולמדוד קרינת פליטה בטווח 270-850 ננומטר ידי עירור ב 250 ננומטר. שיא פליטה עבור פאני יש לשים לב סביב 500 ננומטר.

5. מדידה מיקרוסקופ פלואורסצנטי של הכלאה דופלקס

  1. זרוק מעיל פאני על coverslip בורוסיליקט זכוכית ויבש ב 40 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.
  2. להוסיף בדיקה (8 μl של 100 מיקרומטר) על סרט פאני יבשים מכשיר אותו עם האור האולטרה סגול (1,200 μJ / 2 ס"מ ) למשך 2 דקות.
  3. שטפו את הסרט פאני-בדיקה עם PBS ויבש ב 40 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.
  4. בצע הכלאה במשך 15 דקות על ידי הוספת חומצות גרעין יעד. זה יכול להיות דגימה ביולוגית או oligonucleotide ליעד האיזון (8 μl של 100 מיקרומטר). עקוב עם לשטוף PBS.
  5. להשיג את התמונות פלורסנט בהגדלה 40X, עם מסנן מסירה ארוכה 500 ננומטר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 2 א לוכדת את התקנת התגובה בתחילת תהליך פילמור, כלומר, לפני כן APS. היווצרות micelle הוא השלב הראשוני התגובה תהליך-פאני סינתזה המתרחשת בבית הממשק micellar. איור 2B מראה פתרון חלבי לאחר 5 דקות. 30 דקות לאחר APS מתווסף התגובה פונה בצבע חום מעט. איור 2C מציג את השינוי הצבע המזוהה עם היווצרות של oligomers. איור 2 ד מראה צבע חום כהה לאחר 4 שעות, המעיד על ריכוז גבוה של שרשרת...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חיישן מבוסס פאני של חומצות גרעין דורש solubilization של הפולימר במים כדי אינטראקציה עם DNA ו- RNA. פיזור פאני במים מושג באמצעות פעילי שטח, ויצר מיצלות כפי שדווח בעבר 8. בנוסף NaDBS משמש כאן פעילי שטח anionic אחרים כמו אסתר dodecyl של חומצה 4-sulfophthalic, פעילי שטח nonionic כמו ethoxylate פנול nonyl, או פעילי שטח קטיוני כמו ברומיד אמוניום cetyltrimethyl יכול לשמש גם לסינתזה של processable פאני 9,10. הסינתזה המתוארת כאן מתחילה עם יחס קבוע של NaDBS הפעיל שטח a...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

העבודה נתמכה על ידי המכללה למדע וטכנולוגיה של אוניברסיטת דרום מיסיסיפי ומכללת מיסיסיפי למדע וטכנולוגיה ותוכנית INBRE של מיסיסיפי (פרס מספר P204M103476 מהמכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית).

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אנילין פישר סיינטיפיק A7401-500 ACS, נוזלי, בקירור
אמוניום פרוקסידיסולפטפישר סיינטיפיק A682-500 ACS, גבישי
נתרן דודצילבנזן סולפונאטPfaltz & באואר D56340 95% מוצק
כלורופורםפישר סיינטיפיק MCX 10601 נוזל
פריימרים ל-DNAאופרון MWGn/aרצף DNA מותאם אישית ~20  מיקרופלייט bps
 ארה"ב מדעית 1402-9800 96 ובכן, פוליפרופילן מכיוון שהוא אינו מגיב לכלורופורם
סרט דבק מיקרופלייטארה"ב מדעי 2920-0000 מפחית זיהום באר לבאר, שפיכת דגימה ואידוי
כיסוי מיקרוסקופ זכוכיתפישר סיינטיפיק 12-544-D PANI מצופה על זכוכית כיסוי מוקרנת UV
קרוסלינקר UV UVP HL-2000 אנרגיה: X100 μ J/cm2; זמן: 2 דקות
תנור היברידיזציהVWR01014705 Tטמפרטורה: 400  ° C; עם נדנדה למשך 15 דקות
מכשירי זכוכית פישר סיינטיפיקבקבוק תחתון עגול בעל שלושה צווארים לתגובה; משפך נופל, פקקים, מעבה, משפך מפריד
מיקרוסקופLeica Microsystems Leica IMC S80הגדלה 20X; צבע פסאודו 536 ננומטר; חשיפה 86 מילי-שניות; רווח פי 1.0; גמא 1.6
קורא מיקרופלטותהתקנים מולקולריים ברקוד 89429-536

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hahm, J. I. Functional polymers in protein detection platforms: optical, electrochemical, electrical, mass-sensitive, and magnetic biosensors. Sensors (Basel). 11 (3), 3327-3355 (2011).
  2. Rahman, M. M., Li, X. B., Lopa, N. S., Ahn, S. J., Lee, J. J. Electrochemical DNA hybridization sensors based on conducting polymers. Sensors (Basel). 15 (2), 3801-3829 (2015).
  3. Sengupta, P. P., et al. Utilizing Intrinsic Properties of Polyaniline to Detect Nucleic Acid Hybridization through UV-Enhanced Electrostatic Interaction. Biomacromolecules. 16 (10), 3217-3225 (2015).
  4. Song, E., Choi, J. -W. Conducting Polyaniline Nanowire and Its Applications in Chemiresistive Sensing. Nanomaterials. 3 (3), 498(2013).
  5. Liu, S., et al. Polyaniline nanofibres for fluorescent nucleic acid detection. Nanoscale. 3 (3), 967-969 (2011).
  6. Oliveira Brett, A. M., Chiorcea, A. -M. Atomic Force Microscopy of DNA Immobilized onto a Highly Oriented Pyrolytic Graphite Electrode Surface. Langmuir. 19 (9), 3830-3839 (2003).
  7. Zhang, Y., et al. Poly(m-Phenylenediamine) Nanospheres and Nanorods: Selective Synthesis and Their Application for Multiplex Nucleic Acid Detection. PLoS ONE. 6 (6), e20569(2011).
  8. Namgoong, H., Woo, D. J., Lee, S. -H. Micro-chemical structure of polyaniline synthesized by self-stabilized dispersion polymerization. Macromol Res. 15 (7), 633-639 (2007).
  9. John, A., Palaniappan, S., Djurado, D., Pron, A. One-step preparation of solution processable conducting polyaniline by inverted emulsion polymerization using didecyl ester of 4-sulfophthalic acid as multifunctional dopant. J Polym Sci A: Polym Chem. 46 (3), 1051-1057 (2008).
  10. El-Dib, F. I., Sayed, W. M., Ahmed, S. M., Elkodary, M. Synthesis of polyaniline nanostructures in micellar solutions. J Appl Polym Sci. 124 (4), 3200-3207 (2012).
  11. Tsotcheva, D., Tsanov, T., Terlemezyan, L., Vassilev, S. Structural Investigations of Polyaniline Prepared in the Presence of Dodecylbenzenesulfonic Acid. J Therm Anal Calorim. 63 (1), 133-141 (2001).
  12. Jia, W., et al. Polyaniline-DBSA/organophilic clay nanocomposites: synthesis and characterization. Synthetic Met. 128 (1), 115-120 (2002).
  13. Kim, B. -J., Oh, S. -G., Han, M. -G., Im, S. -S. Preparation of Polyaniline Nanoparticles in Micellar Solutions as Polymerization Medium. Langmuir. 16 (14), 5841-5845 (2000).
  14. Scales, C. W., et al. Corona-Stabilized Interpolyelectrolyte Complexes of siRNA with Nonimmunogenic, Hydrophilic/Cationic Block Copolymers Prepared by Aqueous RAFT Polymerization†. Macromolecules. 39 (20), 6871-6881 (2006).
  15. Kadashchuk, A., et al. Localized trions in conjugated polymers. Phys Rev B. 76 (23), 235205(2007).
  16. Chang, H., Yuan, Y., Shi, N., Guan, Y. Electrochemical DNA Biosensor Based on Conducting Polyaniline nanotube Array. Anal. Chem. 79, 5111-5115 (2007).
  17. Zhu, N., Chang, Z., He, P., Fang, Y. Electrochemically fabricated polyaniline nanowire-modified electrode for voltammetric detection of DNA hybridization. Eletrochim. Acta. 51, 3758-3762 (2006).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

DNAUV

מאמרים קשורים