חומצות גרעין הן אנליטים נפוצים להערכת מערכות ביולוגיות; עם זאת, הטיה ממניפולציה אנזימטית עלולה לגרום לדאגה. כאן מתוארת שיטה לזיהוי ללא תווית של חומצות גרעין באמצעות פוליאנילין. טכנולוגיית חיישנים רגישה וחסכונית זו יכולה להבחין בהבדלים בין נוקלאוטידים בודדים בין מולקולות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
איתור חומצות גרעין נמצא במרכז טכנולוגיות האבחון המשמשות במחקר ובקליניקה. גישות סטנדרטיות המשמשות בטכנולוגיות אלה מסתמכות על שינוי אנזימטי שיכול להכניס הטיה וחפצים. מרכיב קריטי בפלטפורמות הגילוי של הדור הבא יהיה חישה מולקולרית ישירה, ובכך ימנע צורך בהגברה או תוויות. ננו-חומרים מתקדמים עשויים לספק את השיטות הכימיות המתאימות למימוש חיישנים ללא תוויות. פולימרים מצומדים הם אידיאליים לחישה ביולוגית, בעלי תכונות התואמות לביומולקולות ומציגים רגישות גבוהה לשינויים סביבתיים מקומיים. במאמר זה מוצגת שיטה לאיתור חומצות גרעין באמצעות הפולימר האלקטרו-מוליך פוליאנילין. אוליגונוקלאוטידים פשוטים של "בדיקה" של DNA המשלימים לחומצות גרעין מטרה מחוברים אלקטרוסטטית לפולימר, ויוצרים מערכת חיישנים שיכולה להבדיל בין הבדלי נוקלאוטידים בודדים במולקולות המטרה. מחוץ לאופי הספציפי והבלתי משוחד של טכנולוגיה זו, היא חסכונית ביותר.
מבוא
פולימרים מצומדים מספקים אפשרויות רבות לחיישנים מולקולריים. זה כולל תגובות פלואורסצנטיות, אלקטרוניות וקולורימטריות1. נעשו מאמצים רבים לשלב פולימרים מצומדים בחיישני חומצות גרעין. עם זאת, רוב המערכות דורשות גילוי משני, מה שמגביל את אפשרויות החישה2. לאחרונה דיווחנו על פלטפורמת חיישנים מצומדת מבוססת פולימר הבנויה על פוליאנילין (PANI) המנצלת את התכונות של פולימר זה, ויוצרת מערכת נטולת תוויות3. PANI הוא פולימר אלקטרו-אקטיבי מצומד באופן נרחב בעל תכונות כגון פלואורסצנטיות ועמידות המתאימות למדידת מערכות ביולוגיות4. האקסיטונים בתוך המבנה אינם ממוקמים מה שמוביל לניידות של המטען החיובי בין תת-יחידות מונומריות. זה מספק פיגום גמיש של מטעני....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
סינתזה 1. processable פאני
- ממיסים אנילין (1 מ"ל, 11 מילימול) לחלוטין ב -60 מ"ל של כלורופורם בתוך 250 מ"ל בבקבוק מסביב לתחתית. מערבבים בסל"ד 600 במשך 5 דקות ומצננים עד 0-5 מעלות צלזיוס עם קרח. זה בדרך כלל לוקח 15-20 דקות (איור 2 א).
- להוסיף sulphonate בנזן dodecyl נתרן (NaDBS) (7.44 גר ', 21 מילימול) לפתרון אנילין בבקבוק עגול תחתית תוך ערבוב ב 600 סל"ד.
- ממסי אמוניום persulphate (APS) (3.072 גרם, 13.5 mmol) ב 20 מ"ל מים ול....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
איור 2 א לוכדת את התקנת התגובה בתחילת תהליך פילמור, כלומר, לפני כן APS. היווצרות micelle הוא השלב הראשוני התגובה תהליך-פאני סינתזה המתרחשת בבית הממשק micellar. איור 2B מראה פתרון חלבי לאחר 5 דקות. 30 דקות לאחר APS מתווסף התגובה פונה בצבע חום מעט. איור 2C מציג את השינוי הצבע המזוהה עם היווצרות של oligomers. איור 2 ד מראה צבע חום כהה לאחר 4 שעות, המעיד על ריכוז גבוה של.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
חיישן מבוסס פאני של חומצות גרעין דורש solubilization של הפולימר במים כדי אינטראקציה עם DNA ו- RNA. פיזור פאני במים מושג באמצעות פעילי שטח, ויצר מיצלות כפי שדווח בעבר 8. בנוסף NaDBS משמש כאן פעילי שטח anionic אחרים כמו אסתר dodecyl של חומצה 4-sulfophthalic, פעילי שטח nonionic כמו ethoxylate פנול nonyl, או פעילי שטח קטיוני כמו ברומיד אמוניום cetyltrimethyl יכול לשמש גם לסינתזה של processable פאני 9,10. הסינתזה המתוארת כאן מתחילה עם יחס קבוע של NaDBS הפעיל שטח a.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
העבודה נתמכה על ידי המכללה למדע וטכנולוגיה של אוניברסיטת דרום מיסיסיפי ומכללת מיסיסיפי למדע וטכנולוגיה ותוכנית INBRE של מיסיסיפי (פרס מספר P204M103476 מהמכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית).
תודות
למחברים אין מה לחשוף.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| אנילין | פישר סיינטיפיק | A7401-500 | ACS, נוזלי, בקירור |
| אמוניום פרוקסידיסולפט | פישר סיינטיפיק | A682-500 | ACS, גבישי |
| נתרן דודצילבנזן סולפונאט | Pfaltz & באואר | D56340 | 95% מוצק |
| כלורופורם | פישר סיינטיפיק | MCX 10601 | נוזל |
| פריימרים ל-DNA | אופרון MWG | n/a | רצף DNA מותאם אישית ~20 מיקרופלייט bps |
| ארה"ב מדעית | 1402-9800 | 96 ובכן, פוליפרופילן מכיוון שהוא אינו מגיב לכלורופורם | |
| סרט דבק מיקרופלייט | ארה"ב מדעי | 2920-0000 | מפחית זיהום באר לבאר, שפיכת דגימה ואידוי |
| כיסוי מיקרוסקופ זכוכית | פישר סיינטיפיק | 12-544-D | PANI מצופה על זכוכית כיסוי מוקרנת UV |
| קרוסלינקר UV | UVP | HL-2000 | אנרגיה: X100 μ J/cm2; זמן: 2 דקות |
| תנור היברידיזציה | VWR | 01014705 T | טמפרטורה: 400 ° C; עם נדנדה למשך 15 דקות |
| מכשירי זכוכית | פישר סיינטיפיק | בקבוק תחתון עגול בעל שלושה צווארים לתגובה; משפך נופל, פקקים, מעבה, משפך מפריד | |
| מיקרוסקופ | Leica Microsystems | Leica IMC S80 | הגדלה 20X; צבע פסאודו 536 ננומטר; חשיפה 86 מילי-שניות; רווח פי 1.0; גמא 1.6 |
| קורא מיקרופלטות | התקנים מולקולריים | ברקוד 89429-536 |
מקורות
- Hahm, J. I. Functional polymers in protein detection platforms: optical, electrochemical, electrical, mass-sensitive, and magnetic biosensors. Sensors (Basel). 11 (3), 3327-3355 (2011).
- Rahman, M. M., Li, X. B., Lopa, N. S., Ahn, S. J., Lee, J. J.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
