מאמר שיטה

אפיון פנוטיפי של מקרופאגים כליה עכברוש ידי cytometry זרימה

DOI:

10.3791/54599

⸱

18 באוקטובר 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Renal, Vascular and Diabetes Research Lab, IIS-Fundaciòn Jiménez Dìaz, Autonoma University, 2Department of Physiology, Faculty of Medicine, Complutense University, 3Department of Immunology, Centro Nacional de Microbiologìa, Instituto de Salud Carlos III (ISCIII)

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כתב יד זה מתאר פרוטוקול מפורט פנוטיפי ניתוח כמותי של מקרופאגים תושב מכליות עכברוש ידי cytometry זרימה. התאים המוכתמים וכתוצאה מכך ניתן להשתמש גם ליישומים אחרים, כוללים מיון תא, ניתוח ביטוי גנים או מחקרים פונקציונליים, ובכך מגדילים את המידע שהתקבל במודל הניסיון.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ישנן עדויות הולכות וגדלות המצביעות על התפקיד החשוב של דלקת, וכתוצאה מכך, מקרופאגים בהתפתחות והתקדמות של מחלת כליות. מקרופאגים הם תאים הטרוגניים שהיו מעורבים בפגיעה בכליות. ניתן לסווג מקרופאגים לשני פנוטיפים שונים: מקרופאגים המופעלים באופן קלאסי (מקרופאגים M1), המשחררים ציטוקינים פרו-דלקתיים ומקדמים פיברוזיס; ולחילופין מקרופאגים מופעלים (מקרופאגים M2) הקשורים לפונקציות של ויסות חיסוני ועיצוב מחדש של רקמות. יש להבחין ולנתח את הפנוטיפים הללו של מקרופאגים כדי לקבוע את תרומתם לפגיעה בכליות. עם זאת, ישנם מחקרים נדירים המדווחים על מידע פנוטיפי ותפקודי עקבי על תת-סוגים של מקרופאגים במודלים של מחלות כליות דלקתיות, במיוחד בחולדות. עובדה זו עשויה להיות קשורה לסמני המקרופאגים המוגבלים המשמשים בחולדות, בניגוד לעכברים. לכן, יש צורך באסטרטגיות חדשות כדי לכמת ולאפיין את התוכן הכלייתי של תאים חודרים אלה בצורה אמינה. כתב יד זה מפרט פרוטוקול לעיכול כליות וניתוח פנוטיפי וכמותי נוסף של מקרופאגים מכליות חולדות על ידי זרימה ציטומטרית. בקצרה, הכליות הודגרו עם קולגנאז וסך המקרופאגים זוהו על פי הנוכחות הכפולה של CD45 (אנטיגן נפוץ לויקוציטים) ו-CD68 (סמן מקרופאגים PAN) בתאים חיים. לאחר מכן בוצע צביעה על פני השטח של CD86 (סמן M1) ו-CD163 (סמן M2). מקרופאגים פריטונאליים של חולדה שימשו כבקרה חיובית לזיהוי סמני מקרופאגים על ידי ציטומטריית זרימה. הפרוטוקול שלנו הביא לתמותה תאית נמוכה ואיפשר אפיון של סמני חלבון תוך-תאיים ופני שטח שונים, ובכך הגביל את אובדן השלמות התאית שנצפה בפרוטוקולים אחרים. יתר על כן, הליך זה מאפשר שימוש במקרופאגים לטכניקות נוספות, כולל מיון תאים ומחקרי mRNA או ביטוי חלבונים, בין היתר.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחלת כליות היא בעיה בריאותית עולמית, עם שכיחות מוגברת, וקשורה לתחלואה ותמותה מוגברת1. אחד המנגנונים החשובים ביותר המעורבים בהתקדמות והתפתחות של פגיעה כלייתית הוא דלקת, המופעלת בעיקר על ידי מקרופאגים. מקרופאגים ממלאים תפקיד מרכזי במחלות דלקתיות רבות, כולל הפרעות כליות2. לפיכך, נוכחות מוגברת של מקרופאגים חודרים דווחה בביופסיות של חולים עם פגיעה כלייתית חריפה (AKI) או מחלת כליות כרונית (CKD)3,4. מחקרים אחרונים מצביעים על כך שניתן לשלוט בתוצאה ארוכת הטווח של מחלת כליות על ידי מקרופאגים5,6. בתגובה למיקרו-סביבה המקומית, מקרופאגים עשויים להתמיין לפנוטיפים שונים הממלאים פונקציות ביולוגיות מגוונות7. נקבעו שני פנוטיפים של מקרופאגים מובחנים היטב: מקרופאגים המופעלים קלאסית (מקרופאגים M1) ומקרופאגים מופעלים לחלופין (M2)8. מקרופאגים M1 מקדמים דלקת, בעוד שלמקרופאגים M2 יש תפקיד אנטי דלקתי והם מעורבים בתיקון רקמות9. לכן, יש צורך בידע טוב יותר על הטרוגניות מקרופאגים כדי להבין את הוויסות שלהם ותרומתם לפתולוגיה הכלייתית ולפתח גישות טיפוליות חדשות.

מודלים של עכברים וחולדות היו בשימוש נרחב להבנת המנגנון המולקולרי והתאי המעורב בפגיעה כלייתית10. עם זאת, ישנם הבדלים מהותיים בסמנים המגוונים המשמשים לזיהוי פנוטיפים של מקרופאגים בין מכרסמים אלה. לפיכך, מספר סמני עכברים, כגון F4/80 או Ly6C אינם משמשים בחולדות, ובכך מגבילים את האקסטרפולציה של הממצאים בין מינים אלה. יתר על כן, יש מספר מוגבל של סמנים המתארים פנוטיפים של מקרופאגים בחולדות, מה שמסביר את המחקרים הנדירים המנתחים הטרוגניות של מקרופאגים בבעלי חיים אלה בהשוואה לעכברים. לכן, אסטרטגיות חדשות לאפיון תת-קבוצה של מקרופאגים נחוצות כדי להבין את תפקידם של מקרופאגים במודלים של מחלות כליות בחולדות.

כתב יד זה מתאר פרוטוקול לניתוח פנוטיפי וכמותי של מקרופאגים מכליות חולדות על ידי זרימה ציטומטרית. ניתן לעקוב אחר טכניקה זו על ידי מספר בדיקות, כולל מיון תאים ומחקרי mRNA או ביטוי חלבונים כדי לאפשר אפיון מעמיק של תפקיד המקרופאגים במחלת כליות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה אושר על ידי טיפול מקומי מוסדיים בעלי חיים ועדות השתמש בעקבות ההוראה 2010/63 / האיחוד האירופי של הפרלמנט האירופי הלאומי מנחה 53/2013.

1. הכנת ריאגנטים ופתרונות

  1. יש להכין את כל ריאגנטים ופתרונות בתנאים סטריליים ולהשתמש מתחת למכסה המנוע זרימה למינרית. שמור פתרונות על 4 מעלות צלזיוס.
  2. הכן חיץ מכתים (2% עוברית שור סרום (FBS) ב- PBS של 1x Dulbecco).
  3. כן פתרון collagenase ידי הוספת 0.5 מ"ג של collagenase לכל מיליליטר של תמיסת מלח.
  4. כן פתרון הרדמה של קטמין / xylazine (2: 1 v / v).

כליות 2. זלוף הפקה

  1. להרדים חולדות בזריקה intraperitoneal של קטמין / xylazine (75 מ"ג / 12 מ"ג / משקל ק"ג). בזהירות קמצוץ קפל קטן של העור, כדי לבדוק כי בעל החיים הוא הרדים מספיק. לאחר מכן, לכסות את העיניים עם משחת וטרינר כדי למנוע יובש לאחר הרדמה. הערה: 4-monה בן חולדות Wistar משמשות assay זה.
  2. לאחר העכברוש הוא מורדם לחלוטין, והנח אותו על שולחן ניתוחים במצב שכיבה.
  3. החל 70% אתנול אל הבטן.
  4. ביצוע חתך מרכזי דרך העור הצפק בטן, מן החיק אל כלוב הצלעות, לחשוף את חללי פלאורלי ו בטן.
  5. להזריק תמיסת מלח (0.9%) לתוך אבי העורקים בבטן כדי perfuse הכליות באמצעות מערכת טפטוף עד שכל הדם יוסר הכליות. חותכים את אבי העורקים ברמת הבטן כדי לעזור לשחרר את הדם.
  6. הסר את שתי הכליות מן החולדה על ידי חיתוך מן hilum כליות (עורק הכליה, העורק שופכן). כדי decapsulate הכליה, לחץ על הקצה של הכליה באמצעות אצבעות, בזהירות להפריד הקפסולה 11.
  7. מניחים את כליה לתוך תמיסת מלח מאוזנת "הנקס.

3. עיכול כליות תרחיף תא

  1. חותכים חצי כליה במספריים לחתיכות קטנות ולשים אתחתיכות לתוך צינור 1.5 מ"ל.
    הערה: כל הריכוזים הבאים מחושבים 1 מדגם (כליות של עכברוש 1/2).
  2. הוסף 1 מ"ל של תמיסת collagenase לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. מערבבים על ידי היפוך כל 5 דקות כדי לוודא כי פתרון collagenase ניגש הרקמה כולה.
  3. לאסוף את הפתרון ולהעביר אותו דרך מסננת (40 מיקרומטר) בעזרת הבוכנה, ואת resuspend אותו 10 מ"ל של חיץ מכתים.
  4. צנטריפוגה ב 400 XG במשך 15 דקות.
  5. Re- להשעות גלולה ב 1 מ"ל ACK (אמוניום-כלוריד-אשלגן) lysing הצפת. לאחר 1 דקות 30 שניות בטמפרטורת החדר, להוסיף 10 מ"ל של חיץ מכתים כדי לעצור את התגובה.
  6. צנטריפוגה ב 400 XG במשך 10 דקות.
  7. Re- להשעות הגלולה בנפח נאות מכתים חיץ (1 מיליליטר) ולסנן את השעית התא באמצעות מסננת (30 מיקרומטר).
  8. ספירת התאים באמצעות הרחקה trypan כחול על hemocytometer ולהוסיף 2 מיליון תאים לצינור 1.5 מ"ל עבור staining.

4. Cell מכתים ניתוח תזרים Cytometry

  1. תאי צנטריפוגה ב 100 XG במשך 5 דקות.
  2. Re- להשעות גלולה ב 100 μl של סרום חולדה (מדולל 1: 100) במשך 10 דקות ב 4 ° C לחסום קולטני Fc.
  3. לשטוף ידי הוספת 1 מ"ל של חיץ מכתים XG צנטריפוגות 100 במשך 5 דקות.
  4. מערבבים את נוגדנים מכתים פני התא ב 100 μl של חיץ מכתים עבור כל תנאי: CD45 APC-Cy7 (1: 100), CD163 A647 (4: 100) פתרון כדי לזהות תאים חיים (3: 1,000).
  5. Re- להשעות את התא גלולה בתמהיל נוגדן עבור 20 דקות ב 4 ° C בחושך.
  6. לשטוף ידי הוספת 1 מ"ל של חיץ צנטריפוגות מכתים ב 100 XG במשך 5 דקות. חזור על שלב זה.
  7. להוסיף 600 μl של פתרון קיבוע / Permeabilization במשך 20 דקות ב 4 ° C בחושך.
  8. לשטוף 2 פעמים עם 1 מ"ל חיץ צנטריפוגות Permeabilization / שטפי ב 170 XG במשך 5 דקות.
  9. מוסיפים את הנוגדן CD68 FITC (35: 1000) עבור intracelמכתים lular 100 μl של חיץ Permeabilization / לשטוף עבור כל תנאי.
  10. Re- להשעות גלולה בפתרון נוגדנים CD68 ו דגירה 50 דקות ב 4 ° C בחושך.
  11. לשטוף עם 1 מ"ל חיץ צנטריפוגות Permeabilization / שטפי ב 170 XG במשך 5 דקות.
  12. Re- להשעות גלולה ב 100 μl של חיץ Permeabilization / Wash, להוסיף נוגדן CD86PE (35: 1000) ו דגירה של 20 דקות ב 4 ° C בחושך.
  13. לשטוף ידי הוספת 1 מ"ל של Permeabilization / לשטוף חיץ צנטריפוגות ב 100 XG במשך 5 דקות.
  14. Re- להשעות גלולה ב 100 μl של חיץ Permeabilization / לשטוף ולהעביר אותו תזרים cytometry צינור.
  15. ניתוח דגימות על ידי cytometry הזרימה. לקבוע מכתים CD45 ב תאי חיים מגודרים האור המפוזר-Side / אור-המפוזר קדימה חלון (SSC / FSC). במקום השני בשלב, לנתח CD86 וביטוי CD163 בתאים CD68 +.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתחנו ההטרוגניות מקרופאג במודל ניסיוני דלקתיות של פגיעה כלייתית הקשורים נוכחות מוגברת של הסתננות מקרופאגים בכליות. במודל זה, נזק כלייתי הושרה על ידי הממשל של אלדוסטרון (1 מ"ג -1 ק"ג -1 יום) בתוספת מלח (% NaCl 1) במי שתייה במשך 3 שבועות בחולדות Wistar, כפי שדווח בעבר 12.

לוח הזמנים של הניסויים שלנו מוצג באיו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המקרופאגים הם תאים הטרוגנית לשחק תפקיד חשוב במחלות דלקתיות שונות, כולל הפרעות כליות. יש התעניינות גוברת באפיון של תת מקרופאגים מחלת כליות כי כל תת-אוכלוסיית מקרופאג תורמת בצורה שונה להתפתחות פגיעה כלייתית, כפי שדווחה גלומרולונפריטיס, נפרופתיה סוכרתית בסרטן הכליות 14-16. בשלבים המוקדמים של פגיעה כלייתית חריפה, דומיננטיות של מקרופאגים M1 הוא ציין, קידום נמק ודלקת צינורי. עם זאת, בשלבים מאוחרים יותר תוכן גבוה של מקרופאגים M2 הוא ציין לפתור דלקת ולהשתתף שיפוץ רקמות. במחלת כ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

החוקרים אין לי מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מ-FIS/FEDER (Programa Miguel Servet: CP10/00479, PI13/00802 ו-PI14/00883), האגודה הספרדית לטרשת עורקים, האגודה הספרדית לנפרולוגיה ו-Fundaciòn Renal Iñigo Alvarez de Toledo (FRIAT) לחואן אנטוניו מורנו. FIS/FEDER מממן PI14/00386 ו-Instituto Reina Sofìa de Investigaciòn Nefrològica ל-Jesús Egido. Fundaciòn Conchita Rabago to Melania Guerrero Hue. Fundaciòn Renal Iñigo Alvarez de Toledo (FRIAT) אל אלפונסו רוביו נבארו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
קולט אדים זרימה למינריתציוד מהיר יותראו שווה ערך
צנטריפוגהHettichאו ציוד שווה ערך
ציטומטר זרימה (FACSAria)BD Biosciences
סרום בקר עובריBioWestS1820-500
PBS 10xLONZABE17-515Q
קולגנאזסיגמא-אולדריץ'12/1/9001
ACK מאגר ליסינגתרמו פישר סיינטיפיקA10492-01
מסנני ציטומטריית זרימהBD Biosciences340626
מסנני תאי פלקוןתרמו פישר סיינטיפיק352340
צינורות ציטומטריה זרימהפלקון3520525 מ"ל פוליסטירן צינור עגול תחתון
צינורות צנטריפוגהקורנינג centristar430791
אמבט מיםMemmert GmbH + Co. KGWNE 737 & #176; C
תמיסת קיבוע/פרמביליזציה או מאגר פרמביליזציה/שטיפהBD Biosciences554714
Rompum (קסילזין)באייראו שווה ערך
קטלר (קטמין)פייזראו תמיסת מלח מאוזנת שווה ערך
של הנקסSigma-AldrichH8264-500ML
תמיסת מלחבראון
622415 Anti-CD45 (שיבוט: OX-1) APC-Cy7Biolegend202216מדולל 1:100
Anti-CD68 (שיבוט: ED1) FITCBio-RADMCA341Fמדולל 35:1,000
אנטי-CD86 (שיבוט: 24F) PEBiolegend200307מדולל 35:1,000
אנטי-CD163 (שיבוט: ED2) Alexa Fluor 647Bio-RADMCA342Rמדולל 4:100
כתם חי/מת בדיקות מולקולריותL34955מדולל 3:1,000

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gansevoort, R. T., et al. Chronic kidney disease and cardiovascular risk: epidemiology, mechanisms, and prevention. Lancet. 382, 339-352 (2013).
  2. Kon, V., Linton, M. F., Fazio, S. Atherosclerosis in chronic kidney disease: the role of macrophages. Nat. Rev. Nephrol. 7, 45-54 (2011).
  3. Kim, J. H., et al. Macrophage depletion ameliorates glycerol-induced acute kidney injury in mice. Nephron Exp. Nephrol. 128, 21-29 (2014).
  4. Belliere, J., et al. Specific macrophage subtypes influence the progression of rhabdomyolysis-induced kidney injury. J. Am. Soc. Nephrol. 26, 1363-1377 (2015).
  5. Kinsey, G. R. Macrophage dynamics in AKI to CKD progression. J. Am. Soc. Nephrol. 25, 209-211 (2014).
  6. Lech, M., et al. Macrophage phenotype controls long-term AKI outcomes--kidney regeneration versus atrophy. J. Am. Soc. Nephrol. 25, 292-304 (2014).
  7. Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41, 14-20 (2014).
  8. Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).
  9. Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat. Rev. Immunol. 8, 958-969 (2008).
  10. Ortiz, A., et al. Translational value of animal models of kidney failure. Eur. J. Pharmacol. 759, 205-220 (2015).
  11. Martina, M. N., Bandapalle, S., Rabb, H., Hamad, A. R. Isolation of double negative alphabeta T cells from the. J. Vis. Exp. , (2014).
  12. Martin-Fernandez, B., et al. Aldosterone Induces Renal Fibrosis and Inflammatory M1-Macrophage Subtype via Mineralocorticoid Receptor in Rats. PLoS. One. 11, e0145946(2016).
  13. Layoun, A., Samba, M., Santos, M. M. Isolation of murine peritoneal macrophages to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation. J. Vis. Exp. (e52749), (2015).
  14. Komohara, Y., et al. Macrophage infiltration and its prognostic relevance in clear cell renal cell carcinoma. Cancer Sci. 102, 1424-1431 (2011).
  15. Han, Y., Ma, F. Y., Tesch, G. H., Manthey, C. L., Nikolic-Paterson, D. J. Role of macrophages in the fibrotic phase of rat crescentic glomerulonephritis. Am. J. Physiol Renal Physiol. 304, F1043-F1053 (2013).
  16. Ndisang, J. F. Role of the heme oxygenase-adiponectin-atrial natriuretic peptide axis in renal function. Curr. Pharm. Des. 21, 4380-4391 (2015).
  17. Blackbeard, J., et al. Quantification of the rat spinal microglial response to peripheral nerve injury as revealed by immunohistochemical image analysis and flow cytometry. J. Neurosci. Methods. 164, 207-217 (2007).
  18. Strobl, H., Scheinecker, C., Csmarits, B., Majdic, O., Knapp, W. Flow cytometric analysis of intracellular CD68 molecule expression in normal and malignant haemopoiesis. Br. J. Haematol. 90, 774-782 (1995).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

CD45 CD68CD86 CD163M1 M2

מאמרים קשורים