הקלטות תיקון מהדק subcellular מן האחוזה Somatodendritic של נוירונים Nigral דופמין

סיכום

הקלטות מהדק טלאי תת-תאיות מציעות את האפשרות לחקור את התכונות הפונקציונליות של דנדריטים. עם זאת, מבנים עדינים אלה אינם נגישים בקלות בשל קוטרם הקטן. הפרוטוקול המתואר כאן נועד להקל על איסוף הקלטות יציבות ואמינות מהדנדריטים של נוירוני דופמין בפרוסות במבחנה.

תקציר

דנדריטים של נוירונים דופאמינרגיים לקבל ולהעביר קלט סינפטי, פוטנציאל פעולה תמיכה לאחור-לריבוי שחרור הנוירוטרנסמיטר. הבנת פונקציות בסיסיות אלה ישפכו אור על העברת מידע בנוירונים אלה. קלטות תיקון- clamp דנדריטים לספק את האפשרות לבחון את התכונות החשמליות ישירות של דנדריטים תעלות יוני מתח מגודר בסיסיות. עם זאת, מבנים בסדר אלה אינם נגישים בקלות טפטפות תיקון בגלל הקוטר הקטן שלהם. דו"ח זה מתאר צעד אחר צעד הליך כדי לאסוף הקלטות יציבות ואמינות מן דנדריטים של נוירונים דופאמינרגיים פרוסים חריף. מדידות אלקטרו משולבות עם התאוששות פוסט הוק של מורפולוגיה תא. ניסויים מוצלחים להסתמך על הכנת שיפור של פרוסות, פתרונות טפטפות, התאמה נאותה של אופטיקה והיציבות של פיפטה במגע עם המבנה המוקלט. עקרונות תקן של סוםהקלטת תיקון- clamp atic מוחלת דנדריטים אבל עם גישה מתונה יותר של פיפטה. טכניקות צדדיות אלו יכולות להיות מיושמות על מנת לענות על שאלות שונות לגבי הנכסים להתרגש של דנדריטים.

מבוא

נוירונים לקבל מידע הסינפטי בעיקר על הדנדריטים שלהם. מעורר אותות הסינפטי מעכבים להפיץ מהאתר שלהם של דור לאתר האינטגרציה שבו פוטנציאל פעולה (APS) הם עוררו את אות המוצא. בדרכם, פוטנציאלים הסינפטי מושפעים הוא מבחינת המבנה של דנדריטים האינטראקציה בין תכונות הממברנה פסיביות ואקטיביות. השילוב של פרמטרים משתנים מאוד אלה מרחיב את כוח החישוב של נוירונים ^1,2. עם זאת, הקוטר הקטן של דנדריטים מעכבים אולם המחקר של התכונות החשמליות שלהם. הפיתוח המתמיד של טכניקת תיקון- clamp ^3, אופטיקה ⁴ והעידון של שיטות להכנת פרוסה ⁵ במהלך העשורים האחרונים אפשרו הקלטות מן דק מאוד (0.7 - 3 מיקרומטר O) דנדריטים ^6,7. שיטות אלה היו, והם, עדיין במידה רבה להשתמש כדי לבחון את הרגישות של דנדריטים במגוון of נוירונים ^8. קלטות הדנדריטים ישירות חיוניות כדי לקבוע את החלוקה ^9-19 ו הבדלים בתכונות הפונקציונליות ^20-22 של תעלות יונים בתאים עצביים ברורים. נתונים אלו הם משלימים ההכרחיים של הפצות ערוץ יון מזוהות עם אימונוהיסטוכימיה בשילוב מיקרוסקופ אור האלקטרונים ^23,24. קלטות somatodendritic Dual יושמו לחקור את התפשטות פוטנציאל פעולה ^{9,13-15,21,22,25-27} והפצת פוטנציאלים הסינפטי ^13,16,18 לאורך תחום somatodendritic של נוירונים, להשיג דגמי כבל פסיביים מפורטים ^{28. 30} ולחקור ההחלטה הזמנית של אינטגרציה עצבית ^31.

Nigra substantia (SN) הוא אזור הממוקם במוח התיכון מעורב בכמה פונקציות כגון שליטה על תנועה, הקידוד של גמול והתנהגויות רגילות. הירידה של דופמין עקב אל הפרטאובדן דופאמין (DA) נוירונים SN קשור הפרעות המוטוריות אצל חולים הסובלים ממחלת פרקינסון ^32. מעגל nigral מורכב משני סוגי תאים עיקריים: נוירונים דופאמינרגיים GABAergic. מעניין, הנוירונים האלה יש כמה תכונות ספציפיות המבדילות אותם נוירונים אחרים. האקסון של חלק גדול של נוירונים DA וכמה נוירונים GABA מקורו מאתר הדנדריטים המציין כי סוכת הדנדריטים היא הטרוגנית (האקסון נושאות דנדריטים-חסר האקסון) ^25,26,33. המורפולוגיה של נוירונים אלה ניגודים ולכן עם בארגון טיפוסי של נוירונים שבו העברת מידע בהתאם לחוק של קיטוב דינמי הנפלטת קחאל: החל דנדריטים, כדי סומה ולבסוף האקסון ^34. נוירונים DA ידועים גם לשחרר דופמין מן הדנדריטים שלהם ^35, ליצור פעילות התפוצצות ³⁶ הפלסטיות NMDA קולטן ^37. dissection של תופעות אלה הוא חמקמק ללא הקלטות ישירות מהאתר שבו הם יזמו. כדי לקבל תובנה לתוך הקשר בין המיקום המדויק תכונות פעילות של תעלות יונים ותפקידם העברת הרגישות ומידע הדנדריטים בנוירונים nigral, קלטות הדנדריטים ישירות הן את שיטת בחירה.

דו"ח זה מתאר הליך מפורט, שניתן להשתמש בם כדי להשיג הקלטות יחידות כפולות תיקון- clamp מ דנדריטים של נוירונים nigral ואת תיוג biocytin פוסט הוק המקביל. העקרונות הבסיסיים עבור תיקון והגופני ואת קרום הדנדריטים הם מאוד דומים. למעשה זאת, הקלטות מאתרים הדנדריטים דורשות אופטימיזציה ספציפית בהשוואה להקלטות סומטיים. קלטות הדנדריטים מוצלחות לסמוך על האיכות של הפרוסות, התאמה אופטימלית של אופטיקה, גישה עדינה של פיפטה את התיקון והיציבות של ההקלטות.

פרוטוקול

כל הפרוצדורות המתוארות כאן עומדות בכללים מוסדיים ולאומיים, בהוראות איחוד האירופיות להגנה על בעלי חיים ואת ההנחיות של הפדרציה של אגודה למדעי בעלי חי מעבדה אירופאית.

1. הכנה של פתרונות

1. הנוזל השדרתי מלאכותי רגיל (ACSF; טבלה 1)
   1. השתמש מלחים גבוה טוהר ³⁸ כוסות זכוכית נקיה שטופים בעבר עם מים מזוקקי פעמים להכין פתרון טרי. השתמש במים באיכות גבוהה פעמיים מזוקקים להכנת כל פתרונות חוּץ ו תאיים.
   2. קח כוס L 2 לפזר NaHCO ₃ ב 500 מיליליטר מים אחר כדי לפזר את המלחים האחרים על מנת למנוע משקעים של יוני divalent ³⁹ לפי טבלת 1. יש לנקות את המרית שיטתית עם מי פעמים המזוקקות ולייבשו לפני לקיחת מלח . השתמש בוחש מגנטי homogenize dissolution. מוסיף את הפתרונים משני הכוסות אל בקבוק מדידה מתאים ומביא הנפח המתאים.
   3. ודא כי הפתרון התאי הסופי הוא שקוף לחלוטין ובלי שום זכר של משקעים.
   4. החל תערובת גז מורכב 95% O ₂ ו -5% CO ₂ (גז carbogen) עם נר Microfilter זכוכית (Ø 13 מ"מ) 20 - 30 דקות לפני המרוססת פרוסות ^38,40. בזהירות לשלוט osmolarity (2 - 3 מדידות רצופות) של ACSF עם osmometer (טווח אופטימלי: 314 - 325 mOsmol / L). אחסן את הפתרון הנותרים לאחר הכנה על 4 מעלות צלזיוס ולהשתמש בו בתוך 3 ימים.
2. פתרון חיתוך (סוכרוז-ACSF; טבלה 2) ^5,13
   1. כן 3 ליטר של פתרון טרי. השתמש 1 L להכין פרוסות המוח מפני חיה אחת. אחסן את הפתרון הנותרים ב 4 ° C ולהשתמש בו בתוך 3 ימים.
      הערה: Mg גבוהה ²⁺ ונמוך Ca ^{2 +} ריכוזים משמשים דבשידור סינפטי ecrease ואת ההחלפה של כמה NaCl עם סוכרוז לשמר את הרקמה ^5,40.
3. פתרונות תאיים
   1. הכן מראש 100 מ"ל פתרון להקלטות כל תא כפול (לוח 3).
   2. כלול methylsulfate ^13,15,21 להשיג התאוששות טובה של מורפולוגיה התא. להוסיף biocytin (0.1 - 0.4%) לבחון בהמשך את המורפולוגיה של הנוירון. כלול צבע פלואורסצנטי (למשל, Alexa 594 או Sulforhodamine 101 ⁴¹⁾ לבצע את הארכת דנדריטים במהלך ההקלטה (לא חובה).
   3. הכן מראש 100 פתרון אלקטרודה מיליליטר להקלטות מצורף תא (לוח 4). במקרה זה הפתרון הפנימי הוא פתרון high-k ⁺ נועד לבודד את זרם קטיון מקרוסקופית מופעל hyperpolarization (אני _ח) ומכיל חוסמים עבור תעלות יונים האחרות מגודר מתח.
   4. תוך חנותפתרונות הסלולר 2 aliquots מ"ל ב -20 ° C. השתמש aliquot חדש עבור כל פגישת הקלטה חדשה. בדוק את osmolarity של כל aliquot מופשר בזהירות עם osmometer. קחו aliquot חדש אם osmolarity אינו תואם לערך הראשוני.
   5. מעבירים את הפתרון מן aliquot לתוך מזרק 3 מ"ל על גבי אשר מסנן מזרק סטרילי 0.22 מיקרומטר מושם. שמור את המזרק על הקרח במהלך ההקלטות להגביל השפלה של ותרכובותיו (ATP, GTP או phosphocreatine).

2. ייצור ומילוי תיקון פיפטה

1. משיכת
   1. השתמש חולץ אלקטרודה אופק צינורות זכוכית בורוסיליקט עבה חומה. עבור כל תא והקלטות המצורפת התא, להשתמש קוטר פנימי קוטר חיצוני 2 מ"מ / 1 מ"מ. ודא כי צינורות זכוכית הוא נקי לחלוטין ^38.
   2. אם זה אינו המקרה, לטבול נימי זכוכית ממסה אורגני (למשל, אתנולהראשון) ולאחר מכן במים מזוקקים פעמיים. בקצרה לחמם סופים נימי עם מבער בונזן. לחלופין, צינורות זכוכית כדי שטף מחומם ישירות מהיצרן (ראה רשימת חומרים).
   3. עבור קלטות somatodendritic כפולות, להבטיח כי התנגדות פיפטה סומטי היא בין 6 ל -10 MΩ ^6,11 ו בין 8 ל 19 MΩ עבור טפטפות הדנדריטים כאשר התמלאו פתרון תאי (לוח 3). פיפטה התנגדות סטנדרטיזציה להקלטות מצורפות תא התנגדות של 10 MΩ להשיג תוצאות דומות לאורך תחום somatodendritic של הנוירון ^16,18,42,43.
   4. כן טפטפות טרי לפני כל פגישת הקלטה (כל יום) או מייד לפני התיקון ולהשתמש בם 5 - 8 שעות לאחר הייצור שלהם ^39. טפטפות חנות במיכל זכוכית מכוסה כדי להגן עליהם מפני אבק חסימה של קצה.
2. מֵרוּט
   1. בדוק ו heat-פולני בכל קצה פיפטה עם microforge להשיג חותמות טובות עם הקרום. לפני שימוש microforge, להמס חתיכה זעירה של זכוכית על נימת חימום פלטינה. חלף ציפוי זכוכית זה על נימת הפלטינה יומית עבור קביעות (פיטר ג'ונס, תקשורת אישית).
      הערה: פיפטות המשמש להקלטות מצורפות תא יכול להיות מצופה לפני הצעד לליטוש החום להפחית רעשי רקע. ציפוי ניתן להשיג עם סוכן בידוד כגון שעוות שיניים מותכת ^22,44 או אלסטומר סיליקון ^39.

3. הכנת פרוסות המוח

1. השתמש חולדות Wistar בריאות בגילאי 16 - בן 19 ימים. אין להשתמש בבעלי חיים לא בריאים או חיות סובלים מהיפותרמיה או התייבשות. לפני שמתחילים בהכנת פרוסות לשמור על בעלי החיים במקום בטוח ושקט. להימנע מהצורך כל חיה אחרת בחדר בעת הכנת חיה. מניפולציות חיות בעדינות.
2. יוצקים סוכרוז- ACSF לשני 400פוליפרופילן מ"ל (PP) כוסות ומניחים אותם מקפיא -80 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות. מערבב את הפתרון כדי לקבל בתמיסה נוזלית הומוגנית קרח קרה / קפוא ומקום הכוסות על קרח. לספק את הפתרון סוכרוז-ACSF עם גז carbogen באמצעות נר Microfilter (Ø 13 מ"מ) בכל מבחנה PP.
3. הכן את מבצעה ובית הנבחרים מילואים
   1. השתמש מבצעה רקמה באיכות גבוהה עם תנודות אנכיות נמוכות מאוד ^5,38 למזער ניזק בשכבות השטחיות של פרוסות ככל האפשר. תקן סכין גילוח טרי כולו על מבצעה.
   2. השתמש סכין גילוח חדש עבור כל פגישת חיתוך. הימנע כיפוף של סכין הגילוח. אל תסיר את סרט השומן על פני השטח של סכין הגילוח (יוסף Bischofberger, תקשורת אישית).
   3. אם זמין, לבדוק את הרטט האנכי עם vibroprobe שסיפק היצרן. לחלופין, להשתמש vibroprobe מחוייט ^5. מנמיך את התנודות האנכיות של ים הלהבo כמו להיות קרובה ככל האפשר ל -0 מיקרומטר.
   4. הכינו תא מילואים 150 מ"ל ^45,46 עבור פרוסות, כפי שהוא מתואר על p. 201 נ"צ. ^39. יוצקים ACSF סטנדרטי לתוך תא מילואים ולמקם אותו באמבט מים. לספק את הפתרון קאמרי מילואים עם carbogen באמצעות נר Microfilter (Ø 6 מ"מ). ודא כי בועות carbogen הן זעירות ככל האפשר.
      הערה: בניית תא עתודה חדשה כל 2 - 3 חודשים כדי לשמור על מתמדת איכות פרוסה.
4. פרוסות Cut
   1. בתוך חדר שותק שבו הנסיין אינו מופרע או לחוץ, לערוף את החיה עם מספרי ניתוח (מ"מ אורך 150) ברמה של לשד צוואר הרחם.
   2. חותכים את העור בחלק העליון של ראשו של בעל החיים בתוך האף לכיוון הזנב עם אזמל ולהסיר אותו רוחבית. חותכים את החלק העליון של הגולגולת מן הזנב לחלק האף של הראש עם מספריים בסדר ולהסיר שני חלקי הגולגולת רוחבית. הסר את bגשם עם מרית דקה ושחרר אותו בזהירות לתוך מבחנה PP המכיל קר כקרח (0 - 4 מעלות צלזיוס) סוכרוז- ACSF equilibrated עם carbogen ^38.
      הערה: רצף זה של צעדים שצריך לעשות מהר ככל האפשר, אך גם בקפדנות (<< 1 דקות, בערך 40 שניות).
   3. שמור את המוח בפתרון של כוס PP עבור ~ 2 עד 5 דקות. התאם את הלחץ carbogen כדי למנוע תנועות של המוח. החלף את נר Microfilter אם בועות carbogen הן גדולות מדי עם אחד טרי.
   4. מניחים את המוח על צלחת 9 ס"מ פטרי שבה התחתון בפנים מכוסה ~ 0.5 ס"מ עובי Sylgard שכבה ^38. כן צלחת פטרי זה מראש.
   5. המקיפים את המוח עם-ACSF סוכרוז קר כקרח. ודא כי חלק שלב נוזלי של פתרון ACSF סוכרוז טובלות המוח. עבור פרוסות עטרה, לנתק את החלק הקדמי של המוח במישור העטרה עם אזמל או סכין גילוח. הסר את המוח הקטן עם חתך העטרה.
   6. החל cyanoדבק acrylate על הדגימה מגש (אזור ~ 1 ס"מ ^2). הדבק את בלוק המוח כזה שהחלק חזיתית פונה בשלב החיתוך. בזהירות לטפטף סוכרוז- ACSF על החלק העליון של המוח הודבק באמצעות פתח גדול של פיפטה זכוכית פסטר ובהמשך לאט להטביע את תא חיתוך של מבצעה. לתמרן במגש הדגימה כך משטח החיתוך (כלומר, הרקמה הראשונה שכבשה את הלהב) הוא משטח הגחון של המוח ^40.
   7. החל carbogen עם נר Microfilter זכוכית bended (Ø 6 מ"מ) לתא חיתוך (אופציונלי).
   8. התאם את סכין הגילוח בזווית של ~ 15 ° תוך התייחסות במישור האופקי ^5. חותכים פרוסות המוח העטרה של ~ 500 מיקרומטר הזנב לכיוון האף לפני שהגיע nigra substantia. להקטין את העובי לחתוך 300 - 350 מיקרומטר פרוסות עבות המכילות את האזור של עניין.
   9. פרוסות נפרדות מהגוש רקמה עם מחט זלוף מאוד דק המחוברמזרק במקביל לקצה של סכין גילוח. כופף את המחט, כדי שיהיה בזווית של 90 מעלות בין מחט המזרק. ודא שאף לחץ מוחל על סכין הגילוח תוך הסרת הפרוסה מגוש הרקמות.
5. פרוסות חנות
   1. מעבירים את פרוסות באמצעות החריץ הגדול ביותר של פיפטה פסטר זכוכית (מחוברת הנורה) לתוך תא מילואים. ברגע שכל הפרוסות מועברות לתא המילואים (כריסטוף שמידט-Hieber, תקשורת אישית) להביא את הטמפרטורה של המים באמבטיה עד 34 ° C 0.5 - 1 ח.
   2. לאחר תקופה זו לכבות את האמבטיה במים ולשמור את הפרוסות בטמפרטורת חדר. התאם את הלחץ carbogen כדי למנוע תנועות של פרוסות בתא מילואים. שמור את הפרוסות במשך 10 עד 20 דקות אחרות לפני תחילת הקלטות.
   3. נקו את הציוד ואת נרות Microfilter בקפידה עדיין ביסודיות עם מים מזוקקים פעמיים בסוף של SLIcing ההליך.

4. Dual סומטיים Somatodendric הקלטות Nigral נוירונים ותיוק Biocytin

1. בצע תיאורים על ההרכבה של התקנת תיקון- clamp עבור פרוסות נתון האקסון מדריך שופטים. ^39,40,47. מידע בדבר היבטים בסיסיים יותר של תיקון הוא נ"צ. ^48.
2. הכן תא ההקלטה
   1. מניחים 1 - 2 מ"ל פעמיים מזוקקים מים בחדר ההקלטה. ודא שזה לא דולף. הנח את תא הקלטת על שולחן XY ההסטה.
   2. עדכונים סטנדרטי ACSF באמצעות מערכת צינורות טפטוף חמצן-חדיר (polytetrafluoroethylene) לתא ההקלטה. לייצב את זרימת זלוף בתא בשיעור של 4 - 5 מ"ל דקות ^-1. אל תשכח את האורך של צינור הצטרפות המבחנה המכילה ACSF ובית נבחרי הקלטה קצר ככל האפשר (1 מ ').
   3. בחר פרוסת מוח מאולם המילואים ולהעביר אותו לתוךלתא הקלטה באמצעות החריץ הגדול ביותר של פיפטה פסטר זכוכית. מכסה את הפרוסה עם טבעת פלטינה לעגן אותו בחלק התחתון של חדר ההקלטה, כפי שהוא מתואר על p. 201 נ"צ. ^39. השתמש טבעת פלטינה שטוחה (Ø 1.5 סנטימטרים) ודבק חוטי ניילון במקביל (ריווח> 2 מ"מ) על זה.
3. התאם לייעל את אופטיקה
   1. דמיינו את הפרוסות באמצעות אינפרא אדום (IR) וידאו מיקרוסקופיה ^4,47,49,50. התאם את התאורה קוהלר ⁵¹ לייעל התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC) ⁵¹ אופטיקה או תאורה עקיפה (בניגוד Gradient Dodt - DGC) ^52,53. פרטים נוספים על הליך זה מקבלים שופטים. ^40,49.
   2. בדוק את האיכות של הפרוסה. רק לשמור פרוסות עם משטחים חלקים ואפילו שאינם מדי בניגוד בחום ויש לי רק מכתשים קטנים, מפוזרים.
   3. מלאו 2 טפטפות תיקון טריות בשימוש עם פתרון תאי ( לוח 3). השתמש צינור 0.5 מ"ל המכיל את פתרון פיפטה למלא את קצה פיפטה ידי פעולה קפילריות. כדי להאיץ את מילוי קצה טפטפות בלי נימה, להפעיל לחץ שלילי עד סוף פיפטה באמצעות צינורות מצורף מזרק.
4. מקם את טפטפות מעל פני השטח של הפרוסה
   1. בדוק את הנוכחות של ציפוי כלוריד על חוטי כסף (אלקטרודה השוואתית אמבטיה האלקטרודה תיקון, לפרטים ראה מדריך אקסון ואת השופטים ^39,54.).
   2. הכנס את ברצף טפטפות לתוך מחזיקי פיפטה ולהפעיל לחץ חיובי (~ 70 mbar) באמצעות מעגל צינורות חיבור למחזיק פיפטה, ברז משולש ו מנומטר ^40. מנמיכים את פיפטה לתוך האמבטיה של חדר ההקלטה.
   3. בדוק שהערך לחץ על מד הלחץ הוא קבוע עבור ~ 1 - 2 דק '. אם הלחץ יורד, לבדוק את הצינורות או טבעות אטם האיטום בתוך מחזיק פיפטה.
   4. הניחו את קצה פיפטה באמצע צג וידאו ולוודא שהיא אינה מוסתרת. ודא קצה פיפטה אינו זז בעת החלה או שחרור לחץ פיפטה.
   5. בדקו להיסחף ותנודות של קצה פיפטה ידי ציור צלב קטן במרכז של המסך בדיוק במיקום של קצה פיפטה ולבחון עבור 5 תנועות דקות אפשריות של הקצה.
   6. החל צעד מתח (5 mV) כדי לפקח על ההתנגדות פיפטה על אוסילוסקופ. הגדר את פוטנציאל החזקת מגבר תיקון- clamp 0 mV. לבטל פיפטה לקזז פוטנציאל כזה שהזרם פיפטה DC קורא יתאפסו על מגבר מטר ^39,51.
   7. הזז את טפטפות עד הפרוסה ולשמור אותם מעל פני השטח.
5. בחר תיקון נוירון עם דנדריטים הארוך
   1. בתוך nigra substantia לבחור נוירון בריא עם דנדריטים הארוך שניתן בעקבותיו לאורך מרחק גדול בערך באותה plAne (1A ו -1 B איור) באמצעות ניגודיות IR-Dodt Gradient (IR-DGC). בחר גוף תא חלקה הומוגנית. הימנע שני התאים בניגוד בחום על פני השטח של הפרוסה (איור 1 ג ו 1D), משום שקשה לפרוץ פנימה כדי לשמר תנאי הקלטה יציבים לאורך זמן (התנגדות טורית יציבה). בחר נוירונים שיש soma 10 שלהם - 30 מיקרומטר מתחת לפני השטח הפרוס.
   2. הזז את האלקטרודה סומטיים קרוב סומה (40 - 50 מיקרומטר משם) ואת קרוב אלקטרודה הדנדריטים בדרכם אל הדנדריט שנמצא באותו מרחק. השתמש הגדלת 2X (מחליף פי ארבעה) כדי לבחור תיקון חלק של דנדריט. השג בצג הגדלה מוחלטת של 2,100X ללא גדלה (1X) ושל 5,500X עם גדלת 2X.
   3. מעט לשחרר את הלחץ של פיפטה סומטיים ב -10 mbar. במידת הצורך, לווסת את לחץ פיפטה הדנדריטים סומטיים למנוע את עקירתם של גell מבנה (סומה דנדריט) בתוך הפרוסה.
   4. מקם את פיפטה הדנדריטים קרובה הממברנה כדי לראות מנקדים קטנים. שחרר את הלחץ על קצה פיפטה תיקון דנדריט תוך שליטה על התנגדות פיפטה. בתנאים אידיאליים, רק יניקה מאוד קטנה מספיקה כדי להשיג חותם טוב.
   5. שמור פיפטה הדנדריטים במצב מצורף התא. הזז את קרוב פיפטה סומטיים קרום סומטיים תיקון קרום סומטיים. ודא כי התנגדות חותמת גבוהה מתקבלת לפני פקיעת קרום התא (> 1 GΩ) ^39. מעט חוזר בי הן טפטפות מן הקרום על ידי כמה מיקרומטר כדי למנוע עיוות של גוף התא דנדריט.
   6. עבור טפטפות הן, להפחית ככל האפשר את המשרעת של הארעיים קיבול פיפטה על גבי השלב הנוכחי באמצעות דופק מתח עם רווח גבוה וסינון מעט ⁵¹ ואת אוסצילוסקופ. היכנסו לתוך wi במצב כל תאה פיפטה הדנדריטים ובהמשך עם פיפטה סומטיים.
   7. לחסל את הארעיים קיבול כל תא ולפצות על התנגדות הסדרה. צג ולתעד את התנגדות הגישה בתחילה, ובאופן קבוע במהלך הניסוי. אם התנגדות סדרה היא גבוהה מדי (> 50 MΩ), שוב עם פיפטה אחרת.
   8. לאסוף תמונות IR-DGC (איור 1A ו -1 B) עם מדפסת גרפית וידאו ^25, בלוכד או מצלמה דיגיטלית בהגדלות גבוהות ונמוכות.
      הערה: נפיחות של נוירונים במהלך ההקלטה (איור 1E ו 1F) הוא ציין באופן ספורדי, אבל רק לעתים נדירות כאשר osmolarity ו- pH של פתרונות מותאם כראוי ^39.
   9. להשיג הקלטות כפולות סומטיים כל תא (סומה - סומה) עם אותו ההליך (איור 2 א).
6. החל ארוך (כמה מאות מילי-שניות) הגדלת depolarizing השלבים הנוכחיים ברצףעם פיפטה סומטיים הדנדריטים לעורר נקודות גישה (איורים 2B, 3C ו 3D). רשמו את הפוטנציאל הנובע בבית הדנדריטים פיפטה סומטיים זמנית.
7. בדוק את ההתפשטות של פוטנציאלים סינפתטי מלאכותיים (aEPSPs) בנוירונים דופאמינרגיים
   1. צור זרם סינפתטי (EPSC) waveform להזריק כציווי הנוכחי במהלך ההקלטות הנוכחי מהדק כפול (איורים 4 א ו -4). לשם כך, לבנות פונקציה מעריכית כפולה עם ערכי המשרעת והזמן כמובן מתאימים לערכים אמיתיים נמדדים עבור EPSCs הנוירון של עניין ^55. בזהירות לשלוט שיעורי דגימה של EPSC נבנה של צורת הגל EPSC מוזרק לשמר את מהלך הזמן המקורי.
      הערה: לפני החלת waveform ב נוירון אמיתי, לבדוק אותו באמצעות תא מודל.
   2. ברצף להזריק את צורת הגל באמצעות הדנדריטיםפיפטה סומטיים ולהקליט וכתוצאה הפוטנציאלים הן טפטפות סומטיים הדנדריטים במקביל. בדוק באופן סדיר את הסחף אפשרי של טפטפות.
8. סיום ההקלטה מתוך תא עצב
   1. קח תמונה IR-DGC בהגדלה נמוכה (אובייקטיבי: 5X או 10X) לתעד את המיקום של נוירון בתוך פרוסה האלקטרודות.
   2. לאט ובעדינות למשוך את הדנדריטים ואת טפטפות סומטיים מן ברצף הקרום העצבי כדי ליצור טלאים-אאוט מחוץ בשני טפטפות. הסר את פיפטה באמצעות רצף של תנועות לרוחב-מעלה ^38. אלה צריכים להיות קצרים בתחילה ולאחר מכן להגדיל בהדרגה באורך. תצורת הקלטה זה מעדיפה הסגירה התקינה של קרום התא.
   3. לפקח על הירידה של זרמי קיבולים (עליית התנגדות הגישה) בתגובה דופקת מתח 5 mV ב-מהדק מתח תוך הוצאת פיפטה.
   4. לאחר הקרום הוא יםהוביל סביב קצה פיפטה, לקחת את זה לגמרי מחוץ לתא ההקלטה. הסר את המטרה מהאמבטיה. שמור את הפרוסה לתא ההקלטה במשך 15 - 20 דקות ברמת ACSF כדי לאפשר איזון של biocytin (מהפתרון התאי) הנוירון המוקלט.
   5. בעדינות להעביר את הפרוסה באמצעות פתח גדול של פיפטה פסטר לתוך בקבוק מ"ל רחב 25 הפה ענבר (חום) זכוכית המכיל ACSF סטנדרטי. סגור את הבקבוק עם כובע. ראה סעיף 6 עבור צעד הקיבעון.

5. הקלטות ניידות מצורפת

1. בחר נוירון עם דנדריט המשתרעת על פני מרחק רב באותו המטוס. ודא כי דנדריט של עניין ניתן בעקבות אל סומה מוגדרת היטב.
2. מלאו את פיפטה תיקון עם פתרון אלקטרודה (לוח 4). עיצוב הפתרון להקליט את הריבית הנוכחית בתצורה מצורפת התא על ידי כולל סוכנים תרופתיים ספציפיים לחסום צ'ה יון אחרnnels.
3. תיקון דנדריט במצב מצורף התא
   1. דמיינו חלק דנדריט ומתקרבים פיפטה recoding באמצעות מניפולטור. התאם את הלחץ על קצה פיפטה על ידי בדיקת מד לחץ (70 - 80 mbar) כדי למנוע תזוזה של דנדריט. תיקון דנדריט כמתואר 4.5.4.
   2. קלט כמה תמונות IR-DGC (איור 5 א). נסה להשיג התנגדות חותמת גדולה ככל האפשר (> 1 GΩ ^39), במקרה הטוב בין 3 - 10 GΩ להקלטות מצורפי תא ¹⁸ (איור 5). לחזור בו פיפטה מן הקרום על ידי כמה מיקרומטר כדי למנוע עיוות של דנדריט.
   3. שים זרמי פעולה במצב התא מצורף המשקף פוטנציאל פעולה ספונטני של הנוירונים nigral. להשלים את ACSF עם Ca ^{2 +} ו חוסמי תעלות Na ⁺ (CdCl ₂ ו TTX, בהתאמה) לדכא זרמים פעולה.
   4. למרוח ד"ה 2צעד oltage של -90 mV מן הפוטנציאל אחזקה של 0 mV למדבקה לעורר אני _ח (5C איור). זכור כי פוטנציאל פיפטה ואת פוטנציאל הממברנה מנוחה הוא בסדרה בתצורה מצורפת התא ^56. לפרטים נוספים, ראה מדריך אקסון ו Ref. ^39.
   5. בדוק באופן סדיר את הסחף אפשרי של פיפטה.
   6. בסוף ההקלטה, קרע את התיקון ללכת במצב כל התא ומייד לקחת הודעה של פוטנציאל הממברנה. לחזור בו פיפטה כמפורט בסעיפים 4.8.2 ו 4.8.3 להשיג תיקון מחוץ-אאוט.
4. שיא מ סומה המקביל במצב כל תא
   1. תראו לאורך דנדריט ולאתר סומה המקביל. השתמש פיפטה גבוהה התנגדות (5 - 10 MΩ) ^6,14,57 מלא K ⁺ פתרון תאי מבוסס (לוח 3). החלת יניקה קצרה (לחץ שלילי) אלקצה פיפטה כדי לקרוע את הקרום כדי להיכנס במצב כל התא.
   2. בדוק את זהותו של נוירון הנוכחי מהדק ידי החלת פיגמנטציית-יתר ארוך depolarizing השלבים הנוכחיים (5D איור) ולאפשר biocytin מפוזר לאורך דנדריטים. החל השלבים הנוכחיים depolarizing קצר כדי להמחיש את מהלך הזמן AP.
   3. לאחר ≤10 דקות, למשוך את פיפטה להשיג תיקון מחוץ-אאוט כמפורט בסעיפים 4.8.2 - 4.8.3. בעדינות להעביר את הפרוסה באמצעות פתח גדול של פיפטה פסטר לתוך בקבוק זכוכית ענבר 25 מ"ל המכיל ACSF סטנדרטי. סגור את הבקבוק עם כובע.
   4. לחלופין, הראשון לקבל כל תא סומטי עם פתרון פיפטה המכיל גם צבע פלואורסצנטי. אפשר דיפוזיה של צבע ובחר מנה של דנדריט ^26. עם טפטפת שני, תיקון דנדריט במצב מצורף התא. שימוש במיקרוסקופ confocal אם זמין כדי לשפר את להדמיה של התווית fluorescentlyed דנדריט ^14,22.
   5. לבצע קלטות הדנדריטים בתצורה מחוץ-אאוט, לחלופין או בנוסף להקלטות מצורפות התא ^10,22. ראה דוגמא של זרמים מגודרי מתח רשמו רטייה מחוץ-אאוט באיור 5E ו 5F.

6. תיוג Biocytin של Nigral נוירונים

1. קיבוע של הרקמה
   1. במידת האפשר, להשתמש בחדרים נפרדים עבור פרוסת הקלטה / histochemical עיבוד ^38.
   2. תקן את פרוסות על ידי החלפת ACSF עם paraformaldehyde 4% ב 0.1 M חיץ מלוחים פוספט (PBS, pH = 7.4) עם פיפטה פסטר. השתמש תמיד מוכן טרי פתרון מקבע (<< 1 שבוע ישן).
      זהירות: כפפות יד מתאימות השתמשו במנדף כימי להציב מעבדת היסטולוגיה לתמרן paraformaldehyde בגלל רעילותו. קראו את גיליון נתוני בטיחות של המוצר המסוכן הזה לפני השימוש גלעזאזל הבטיחות הכימית בדבר תקנות (הוראת חומרים מסוכנים (67/548 / EEC) מן המועצה האירופית) כאבקה זה נחשבת לגרום לסרטן. פרטים נוספים נמצאים Ref. ^58.
   3. מניחים את פרוסות על לילה 4 ° C.. למנוע זיהום של ההתקנה תיקון- clamp או כל ציוד המשמש אלקטרופיזיולוגיה ידי paraformaldehyde.
   4. לאחר קיבוע, להחליף את הפתרון מקבע עם PBS. השתמש טפטפות פסטר שונה להסרת הפתרון מקבע וליישם את PBS. פרוסות חנות PBS ב 4 ° C לפני עיבוד נוסף (1 - 2 שבועות). במקרה זה, להחליף PBS פעמיים בשבוע. השתמש תמיד מוכן טרי PBS (<< 1 שבוע הישן).
2. הכתמה של הרקמה
   1. הכינו צלחת תרבית תאים 24 גם על הצעדים מכתים. השתמש בציוד נקי להעביר פרוסות. שוטף את הפרוסות 3 x 5 דקות באמצעות PBS הטרי.
   2. החל והעמסת avidin DCS (avidin D, כיתה סדרן התא; 1 פלורסנט μLcein / מ"ל ​​טריטון X-100) ו -0.3% Triton X-100 ב PBS ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. הגן על הפרוסות מן האור ברחבי המכתים. כחלופת קרינה, נוירונים תווית דרך 3,3'-diaminobenzidine עבור אור או אלקטרוני ניתוח מיקרוסקופי ^21,58.
      זהירות: Triton X-100 הוא מסוכן. קרא גיליון נתוני בטיחות והוראות נציבות האיחוד האירופי לפני השימוש בחומר זה.
   3. יש לשטוף 3 x 30 דקות עם PBS ולאחר מכן עם PB (חיץ פוספט, כדי למנוע היווצרות של גבישי על פני השטח של הפרוסה).
3. הר הפרוס בשקופיות זכוכית רגילות. מכסה את הפרוסות בקפידה עם מדיום הטבעה. למנוע בועות אוויר במדיום ההטבעה. שים את coverslip בעדינות כדי לכסות לחלוטין את הפרוסה. אוויר יבש השקופיות לילה לפני לתצוגה ברורה עם מיקרוסקופ.
4. אחסן את פרוסות שכותרתו ב 4 מעלות צלזיוס לאחר להדמיה. טריקים שימושיים על נהלי histochemical הם שופטים. ^58,59.
5. נקו את הציוד המשמש היסטולוגיה אלקטרופיזיולוגיה בנפרד. אין לערבב היסטולוגיה וציוד אלקטרופיזיולוגיה יחד.

ויזואליזציה Hoc ההודעה 7. של נוירונים מלאי Biocytin

1. שימוש במיקרוסקופ confocal לדמיין את המורפולוגיה של נוירונים התאושש.
   1. בערך לאתר הנוירון שכותרתו fluorescently של הפרוסה עם epifluorescence. בדוק את סוכת הדנדריטים של נוירונים ולאתר את האקסון בועה אקסונלית (2 - Ø מיקרומטר 4) באמצעות המטרה 10x או 20x. לתעד את מהלך האקסון.
   2. Switch to המיקרוסקופ confocal ובחר את דיודת לייזר 488 ננומטר כדי להלהיב את והעמסת הכלול הנוירון שכותרתו. בצע את הארכת האקסון דנדריטים של ציר z.
   3. להקליט תמונות רצופות כדי לקבל Z- מחסנית עבור התא כולו. כוון את הרזולוציה של Z- ציר (המרחק בין תמונות עוקבות) 0.5 - 1 מיקרומטר. איסוף תמונות confocal של usin התאg נמוכה (אובייקטיבי 10X) וגבוהה (אובייקטיבית 60X, טבילת שמן) גדלה.
   4. פתח את קובץ התמונה של הנוירון שהושג עם מיקרוסקופ confocal עם תוכנת הדמיה (ImageJ) ^60. השווה את התמונה Z- הקרנת עם תמונה IR-DGC לפי העין כדי לאתר את המיקום המדויק של טפטפות תיקון במהלך הקלטה אלקטרו (איורים 1, 2 א, 3 א, 4 א, 5 א ו 5E).
   5. לקבוע morphometries של נוירונים שכותרתו: למדוד את האקסון - המרחק סומה, המרחקים בין טפטפות הקלטה לאורך תחום somatodendritic ובין פיפטה הדנדריטים האקסון באמצעות הפונקציה "מדוד" ImageJ.
   6. לשחזר כמה נוירונים עם NeuronJ (ImageJ), Imaris ²⁹ או Neuromantic ^61.

8. ניתוח של אלקטרו נתונים

1. השתמש בחבילת התוכנה נלווית עם המגבר גס כדי לנתח את הנתונים (למשל, Clampfit) או ישירותתוכנות אחרות לניתוח נתונים כגון Stimfit, תוכנת קוד פתוחה ^62,63 כמו בפרסום האחרון שלנו ¹³ או למשל WinWCP.

תוצאות

הפרוטוקול המתואר לעיל מתכוון להקל את איסוף הנתונים באמצעות הקלטות תיקון- clamp הדנדריטים. טכניקה זו, בשילוב עם פוסט הוק היסטוכימיה, עוזר לקבל תובנות לתוך המנגנונים של אותות חשמליים רבים שמקורם או להפיץ אותם דנדריטים. גישה ישירה דנדריטים עם טפטפות תיקון קשה, אבל תשומת לב מיוחדת להיבטים מתודולוגיים כמה ישפר את שיעור ההצלחה של ההקלטות. נסיין המנוסה דיו בהקלטה סומטיים יציבה יכול לצפות להשיג עמידות גבוהה (GΩ) חותמות וניסויים מוחלטים על רוב הניסיונות. אחת ל שתי קלטות הדנדריטים באיכות גבוהה ניתן לאסוף לכל לנתיחה.

הזמינות של פרוסות המוח איכותיים המכילים somata בריא דנדריטים היא תנאי הכרחי לגישה מבנים בסדר אלה (איור 1). criteria עבור בחירת נוירונים אלה הם משטח חלק ואחיד בכל רחבי התא לבין סומה דנדריטים עם ניגודיות נמוכה כאשר ציין עם אופטיקה מותאם אופטימלית (איור 1A ו -1 B). נוירונים בחירת בתוקף גם בניגוד מוביל בדרך כלל להקלטות לא יציבות (איור 1 ג ו 1C). יש להימנע לכן נוירונים כאלה.

בהשוואה לתאי עצב אחרים, נוירונים DA nigral להציג מאפיינים מורפולוגיים אלקטרו ספציפיים. תכונות אלה בדרך כלל העריכו עם טפטפת סומטיים יחיד יכולות להיות גם ציינו סומטיים כפולים (איור 2) והקלטות somatodendritic (איור 3). זריקות נוכחיות ארוכות hyperpolarizing לגרום תיקון פוטנציאל הממברנה שנקרא 'סאג' (2B דמויות 5D). האקסון מקורו, ברוב המקרים, על אתר הדנדריטים כפי שזוהו^13,25,26 באמצעות קריטריונים משלימים, המציין כי תא הדנדריטים בנוירונים אלה היא הטרוגנית (איור 3 א - 3B). כתוצאה מכך, התא שבו AP הוא ציין ראשון מקביל לתא שבו האקסון עולה (איור 3 ג - 3D) ^13,25,26. האקסון הוא הופסק בדרך כלל על ידי בועה אקסונלית נגרמת על ידי חיתוך של האקסון במהלך חיתוך ^64, אבל המבנה הזה הוא לא זוהה באופן שיטתי.

לשקוע מבוטא שנצפתה נוירונים nigral DA ברציפות ההפעלה של אני _ח מצביע על רמה גבוהה של יחידות משנה HCN. כדי לקבוע את ההשפעה של אני _ח על השילוב של אותות הסינפטי, נוכחי דמוי הסינפטי (EPSC) גל נוצר והזריק באמצעות אלקטרודה ההקלטה הדנדריטים במהלך הקלטות כפולות somatodendritic ⁵⁵ ( איור 4). קינטיקה של EPSCs המדומה אלה התבססו על קבועי העלייה וריקבון זמן של EPSCs הספונטנית האמיתית. וכתוצאה מכך aEPSP נרשמה עם האלקטרודה סומטיים. יישום אמבט של ZD חוסם אני _ח 7288 הגדיל את משך aEPSP, המציין את התרומה אני _ח אל מהלך הזמן של אותות הסינפטי (איור 4B). גם ZD 7288 ביטל את תיקון פוטנציאל הממברנה המאשר כי תוצאות לשקוע מהפעלת אני _ח (איור 4C). התוצאות שהושגו עם EPSPs המדומה עשויות להיות מתואמות ניסויים באמצעות EPSPs עורר חשמלי ^65. כדי למפות את ההתפלגות המדויקת של הערוץ בתחום somatodendritic של נוירונים DA, קלטות מצורפות תא יושמו (איור 5). גושפנקא גבוהה התנגדות (>> 1 GΩ) היא צורך מוחלט להקלטות מצורפות תא (איור 5 ב strong>). דנדריטים של נוירונים DA, אני _ח מפעיל לאט בצעדי מתח hyperpolarizing ארוכים ואת המושגת יציבה הנוכחית לאחר מאה מילים-שניות (איור 5 ג), כמו בעבר הראה ^66. תצפית זו מצביעה על כך ערוצי HCN לידי ביטוי דנדריטים של נוירונים DA יש יחידות משנה שונות בהשוואה לאלה עצב פירמידליים או סוגי תאים אחרים ^10,16,66. כמו ההפצה של הערוץ עלולה להיות הומוגניות בתא הדנדריטים וככל תא הדנדריטים הוא עצמו הטרוגנית, את זהותו של דנדריט (האקסון נושאות או nonaxon הנושאות דנדריט) מתגלה על ידי השוואת תמונת IR-DGC עם תמונת confocal לאחר מכתים biocytin (איור 3 א 'וב'). שחזור של מורפולוגיה תא לכן, יש לשני קלטות somatodendritic כפולות להקלטות מצורפות תא באמצעות הקלטות כל תא סומטי שלאחר מכן.

יפ-together.within-page = "1">
איור 1. לדמיין את סומה הפרוקסימלי דנדריטים של Nigral דופאמין נוירונים באמצעות אינפרא אדום Videomicroscopy. (א) IR-DGC תמונה של תא עצב DA nigral מראה את סומה דנדריט הפרוקסימלי ושניהם טפטפות סומטיים הדנדריטים. הקלטת somatodendritic כפולה בוצעה בהצלחה על נוירון בריא זה. שים את ניגודיות נמוכה ואת משטח חלק בכל רחבי תחום somatodendritic של התא. (ב) דוגמה נוספת של נוירון DA בריא. (C) נוירון DA עם משטח מחוספס יותר, אחיד ניגוד חזק. בעוד הקלטה כפולה התקבלה, ליציבות הייתה הכי מוצלחת, ואת משך ההקלטה היה קצר (~ 15 דקות) בשל עלייה הדרגתית של התנגדות הגישה בשניית טפטפות. (ד) הדוגמא שנייה של נוירון DA מראה בניגוד בחום סומה דנדריט הפרוקסימלי. במקרה זה, עלייה חזקה של התנגדות הגישה נצפתה זמן קצר אחרי ההפסקה במצב כל התא. ניסיון להקטין את התנגדות הגישה על ידי לחץ שלילי לא הצליח. נוירונים בלוח C ו- D עשויים ניזוקו במהלך הליך החיתוך יש להימנע לניסויים. (E) הקלטה סומטיים כפולה סימולטני נוירון DA בריא בתחילת ההקלטה. (F) נוירון הזהה בלוח E עם גוף תא נפוח לאחר דקות 17 ~. הערת העדר המלא לעומת זאת, את המראה כמו הכדור של סומה ואת הנוכחות של הגרעין הגדול שאינו ברור מאליה בנוירונים בריאים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2. סימולטני זוגי סומטיים ההקלטה מתוך Neuron DA. (א) IR-DGC תמונה במהלך הקלטה סומטיים כפולה מן נוירון DA. (ב) hyperpolarizing ו depolarizing זריקות הנוכחיות הארוכות של 1 (-160 עד 80 PA, להגדיל 80 PA) שינויי מתח מקבילים רשמו בו זמנית עם שני טפטפות התיקון. הערת הנוכחות של סאג ב עקבות המתח עם הצעד הנוכחי hyperpolarizing הארוך ואת הגדול לאחר-hyperpolarization לאחר AP במהלך הדופק הנוכחי depolarizing. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3. הקלטה omatodendritic S כפול בתוך Neuron DA. (א) התמונה IR-DGC של נוירון DA. המרחק בין הדנדריטים סומהפיפטה טיק הוא 29 מיקרומטר. (ב) Confocal תמונה Z- הקרנת של הנוירון בפאנל שכותרתו עם avidin מצומדות כדי isothiocyanate והעמסת (FITC). הנוירון התמלא biocytin במהלך ההקלטה. האקסון שמקורה דנדריט הפרוקסימלי קרוב סומה כפי המצוין על ידי החץ. (C) הקלטה מתח כל תא somatodendritic כפול סימולטני מן הנוירון ב AP א לוח שנרשמה סומה (עקבות מתח שחור) דנדריט (מתח אדום עקבות) בתגובת צעד ההזרקה הנוכחית הארוך של 1 באמצעות סומטיים (משמאל; עקבות נוכחיות שחורות) ו פיפטה הדנדריטים לחלופין (מימין; עקבות נוכחיות אדומות) (D) סומטיים ו AP הדנדריטים מופיעים בצד ציר זמן התרחב.. עם סומטיים או או הזרקה נוכחית הדנדריטים, סוכנות ידיעות AP סומטי (השחורה) שקדמו AP הדנדריטים (אדום). העיכוב בין נקודות גישה נוירון זה היה 120 מיקרו-שניות ו 210 מיקרו-שניות עם סומטיים הזרקת הנוכחי הדנדריטים, בהתאמה. עיכוביםנמדדו משרעת חצי מקסימלי AP בשלב העולה של AP. ה- AP נצפתה לראשונה בתא הקרוב שבו האקסון עולה, המאשר תצפיות קודמות ^25,26. במקרה זה, ההקלטה הדנדריטים מורכב מ דנדריט האקסון חסר. דוגמה של הקלטה מתוך דנדריט האקסון נושאות הוא נ"צ. ¹³ (באיור שלהם. 1). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

רביית איור 4. מלאכותי EPSPs לאורך ציר Somatodendritic של נוירונים DA. (א) התמונה IR-DGC של נוירון DA. המרחק בין דנדריטים פיפטה סומטי הוא 45 מיקרומטר. שניהם טפטפות התיקון נמצאות במצב ההקלטה נוכחי מהדק כל תא. (ב) זרמוהקליט עם פיפטה הדנדריטים מהדק הנוכחי השתמשו כדי ליצור את EPSP מלאכותית (למעלה). הזרם מתקבל על ידי ההזרקה של EPSC דמוי צורת גל (τ _העלייה = 0.6 ms; τ _{הריקבון} = 3 ms; משרעת = 100 PA) באמצעות פיפטה ההקלטה הדנדריטים ^55. בתחתית, מופצות aEPSPs נרשם סומה בתנאים מלא (שחור) ואחרי יישום האמבטיה של ZD7288 חוסם אני _ח (30 מיקרומטר; זכר אדום). כל זכר מתח הוא ממוצע של 40 מטאטא יחיד. הקפד על העלייה הגדולה משך EPSP בנוכחות ZD7288 המציין את התרומה אני _ח אל מהלך הזמן של EPSPs. (C) מתח עקבות רשמו סומה בתנאים מלאים (שחור) לאחר היישום של 30 מיקרומטר ZD 7288 ( אדום) בתגובה ארוכה (30 רשות; 1 ים) צעד נוכחי hyperpolarizing. הערת העדר תיקון פוטנציאל הממברנה (SAG) לאחר הסתימה של I _{h. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.}

נוכחות איור 5. אני _ח ב דנדריטים של DA Neuron. (א) IR-DGC תמונה של תא עצב DA ו פיפטה על דנדריט הפרוקסימלי. (ב) זרמי קיבולים ו דליפה במהלך פקודת המתח 5 mV בתצורה מצורף תא. ההתנגדות החותמת הייתה 5 GΩ בדוגמא זו (C) צעד מתח hyperpolarizing. (90 mV; למעלה) מתוך פוטנציאל הממברנה של 0 mV מושרה _ע"ה ואני הפעלתי לאט. העקב הנוכחי היה הפוך ותאים עם פונקציה מעריכית יחיד מתן קבוע זמן של τ = 632 ms. (ד) מתחתגובות של סומה רשמה כל התא (פנל) כדי פיגמנטציית-יתר s 1 וקטניות נוכחיות depolarizing (-160 עד 120 PA, 40 תוספת PA). הקלטת כל תא סומטי בוצעה לאחר ההקלטה מצורפת התא. הערת ההעדר של APS בשל היישום התאי של TTX ו- CD ²⁺ לדכא ירי ספונטני במהלך הקלטת תא מצורף. המתח מגודר אלה Na ⁺ ו- Ca ^{2 +} חוסמים נוכחיים נוספו לדכא זרמי פעולה. לוחות A - D הם מאותו נוירון (E) IR-DIC תמונה של אחר נוירון DA ו פיפטה הדנדריטים (F) מתח תלוי זרמים מופעלים על ידי דופק בדיקת 0 mV מתוך prepulse 50 מילישניות ב -120 mV.. ב רטייה מחוץ-אאוט נכרת מן דנדריט הפרוקסימלי של הנוירון בלוח א Holding הפוטנציאל -80 mV. שים לב האיון תלוי הזמן של הזרם. אנא לחץ כאן כדי להציג גדולגרסה של נתון זה.

חומר	g / mol	ריכוז	עבור 1 ליטר
NaCl	58.443	125 מ"מ	7.305 גרם
NaHCO 3	84.007	25 מ"מ	2.100 גרם
KCl	74.551	2.5 מ"מ	0.186 גרם
לאא 2 PO 4	137.99	1.25 מ"מ	0.172 גרם
גלוקוז	198.17	25 מ"מ	4.95 גרם
MgCl 2	1 M (פתרון)	1 מ"מ	1 מ"ל
CaCl 2	1 M (פתרון)	2 מ"מ	2 מ"ל
Osmolarity: ~ 310 mOsmol / L (טווח אופטימלי: 314 - 325 mOsmol / L), pH = 7.4

טבלה 1: מלאכותי הנוזל השדרתי (ACSF).

חומר	g / mol	ריכוז	עבור 1 ליטר
NaCl	58.443	87 מ"מ	5.084 גרם
NaHCO 3	84.007	25 מ"מ	2.1001 גרם
KCl	7.551	2.5 מ"מ	0.18637 גרם
לאא 2 PO 4	137.99	1.25 מ"מ	0.17248 גרם
MgCl 2	1 M (פתרון)	7 מ"מ	7 מ"ל
גלוקוז	198.17	10 מ"מ	1.9817 גרם
סוכרוז	342.29	75 מ"מ	25.672 גרם
CaCl 2	1 M (פתרון)	0.5 מ"מ	0.5 מ"ל
Osmolarity: ~ 326 mOsmol / L, pH = 7.4

טבלה 2: סוכרוז-ACSF להכין פרוסות.

חומר	g / mol	ריכוז	עבור 100 מ"ל
KMeSO 4	150.2	120 מ"מ	1.8024 גרם
KCl	74.56	20 מ"מ	0.14912 גרם
MgCl 2	1 M (פתרון)	2 מ"מ	200 μl
Na 2 ATP	551.1	2 מ"מ	0.1102 גרם
Na 2 GTP	523.2	0.5 מ"מ	0.02661 גרם
Na 2 -Phosphocreatine	255.1	5 מ"מ	0.1275 גרם
EGTA	380.4	0.1 מ"מ	3.803 מ"ג
Hepes	238.31	10 מ"מ	0.23831 גרם
Biocytin	1 מ"ג / מ"ל		0.1 גרם
Osmolarity: ~ 302 mOsmol / L, pH = 7.2 מותאם עם KOH

טבלה 3: פתרון תאי עבור הקלטות כפולות.

חומר	g / mol	ריכוז	עבור 100מ"ל
KCl	74.56	120 מ"מ	0.8947 גרם
CaCl 2	1 M (פתרון)	2 מ"מ	200 μl
MgCl 2	1 M (פתרון)	1 מ"מ	100 μl
Hepes	238.31	10 מ"מ	.23831
TEA-Cl	165.7	20 מ"מ	0.3314 גרם
4-AP	94.11	5 מ"מ	0.04705 גרם
BaCl 2	244.26	1 מ"מ	0.02443 גרם
CdCl 2	183.32	0.02 מ"מ	0.3666 מ"ג
TTX	1 מ"מ	200 ננומטר	20 μl
Osmolarity: ~ 290 mOsmol / L, מותאם עם D- גלוקוז (אסמכתא 16.); pH = 7.4

טבלה 4: פתרון אלקטרודה להקלטות מצורפות תא.

דיון

דו"ח זה מתאר פרוטוקול צעד אחר צעד ליישם קלטות somatodendritic כל תא כפולות וקלטות הדנדריטים מקומיות. זה שימושי לקביעת ההשפעה של תעלות יונים (כלומר, אני _ח) על מהלך הזמן של הפוטנציאלים postsynaptic ומיפוי חלוקת ערוץ יון (אני _ח) לאורך תחום somatodendritic של נוירונים DA nigral, בהתאמה. כתוצאה מדידות אלקטרו משולבים כדי לפרסם הוק היסטוכימיה להתאושש מורפולוגיה התא. ההליך הועסק לחקור נוירונים DA ממוקמים nigra substantia, אבל ניתן להכליל עבור נוירונים GABA nigral שכנות, נוירונים DA הטגמנטום הגחוני או נוירונים מוח תיכונים אחרים. כל השלבים ניתן בעקבות לבחון גם תעלות יונים אחרים הביעו דנדריטים של נוירונים nigral בלי שינויים חשובים. הוק הודעה להדמיה הוא רלוונטי במיוחד עבור נוירונים עם נושאות האקסוןדנדריטים, כגון נוירונים nigral ^25,26, interneurons oriens-alveus בהיפוקמפוס ²¹ או כמה עצב פירמידליים CA1 ^67. מעניין לציין, כי נוירונים שיתוף תכונה זו נראה יותר נפוץ ממה שמקובל לחשוב ^67. ניתוח מורפולוגי חושף גם את המיקום המדויק של האלקטרודות האקסון. הגילוי של זה האחרון עשוי להיות מותאם על ידי התיוג של חלבונים הביעו במגזר הראשוני האקסון (ערוצי Na ⁺ מתח מגודר או Ankyrin G) באמצעות אימונוהיסטוכימיה ^68,69.

מהימנותם של נתונים שנאספו עם קלטות הדנדריטים וסימון עצבי עוקב תמיד תלויה באיכות הפרוסה. מאמץ מקסימאלי צריך אפוא להיות מיושם כדי לשמר את הכדאיות של תאים בתוך הרקמה. זו מושגת באמצעות טיפול עדין של בעלי חיים בריאים, כלים איכותיים ריאגנטים, חמצון מספיק של טמפרטורות הרקמות קרות כקרח לאורך כל הכנת פרוסות. תנאי הקלטה יציבים להסתמך על הבחירה של נוירונים בריאים. במצב כל התא, התנגדות סדרה צריכה תחילה להיות נמוכה ככל האפשר ומתוחזק קבועה לאורך כל הניסוי. היציבות של הקלטות היא עוד תלויה מניפולטורים באיכות גבוהה נטול להיסחף ותנודות. ניתן להפחית הפרעות אלו על ידי אופטימיזציה של יציבות פיפטה: בדיקת החיבור לבעל פיפטה וכדי headstage, שליטה שכבלי micromanipulator מופשלים, הימנעות שינויים פתאומיים בטמפרטורה או תנועה הבמה לבדיקת המנגנון של המניפולטור. עבור הקלטות כפולות, methylsulfate ^13,15,21 נכלל הפתרון התאי, אבל גלוקונאט ^9,14,25 יכול להיות מועסק לסירוגין. עם זאת, האניון העיקרי עשוי לשנות את קרום פוטנציאל ^70,71 וכמה זרמים תלויי מתח ^72. פתרון תאי ניתן להשלים עם ATP, GTP ו phosphocreatine לשמר את physioloפונקציות gical של נוירונים. בנוסף, הוספת צבע פלואורסצנטי בפתרון פיפטה (למשל, Alexa 594 או Sulforhodamine 101 ⁴¹⁾ כדי להמחיש את דנדריטים במהלך ההקלטה סומטיים יכול להיות שימושי למשל להציב יישום הלחץ (איור 7 נ"צ. ⁴¹⁾ או מגרה חשמל פִּיפֵּטָה. הפתרון פיפטה להקלטות מצורפות תא מכיל ריכוז גבוה K ⁺ ואין Na ⁺ להקליט _ח ט גדול. ראוי לציון יחס ריכוז Na ⁺ / K ⁺ משפיע על משרעת הנוכחית ^10, פוטנציאל ההיפוך של ¹¹ הנוכחי ואת gating של אני _ח ^73. לחלופין, אני _ח יכול גם להקליט באמצעות מחוץ-outs ^10. בתצורת הקלטה זו אולם, המילייה התאי הקרבה של הערוצים עשוי להיות מוטרד. כתוצאה מכך, הבדלים הפעלה תלוי המתח של לי _{h הוא ציין כאשר זרמי השוואה שהושגו באמצעות טלאים מצורפי תא ומחוץ-outs ^10. נפיחות של נוירונים הוא נתקל מדי פעם במהלך ההקלטה תיקון- clamp, ולעתים קרובות מתעוררת מגורמים ברורים, כגון איכות נמוכה של מים, חוסר איזון חזקה osmolarity או pH בין התוך ואת הפתרונות תאיים ³⁹ או טעויות בהרכב של פתרונות. איכות הקלטות אלקטרו יש שכיחות ישירה על איכות המורפולוגיה של נוירונים התאושש. טפטפות סומטיים עמידות גבוהה משמשות להקלטות כפולות (6 - 10 MΩ, כמו שופטים ^6,11.) ו להקלטות סומטיים אחת אחרי הקלטות מצורפות תא כדי למזער את הדילול של המילייה התאית ^14. ההקלטה סומטיים כל התא בעקבות הקלטת התא מצורף ולכן הוא כל זמן קצר (<10 דקה '). בחוץ-אאוט תיקונים משני טפטפות סומטיים הדנדריטים חיוניים סגירה תקינה של גell קרום וההתאוששות הבאה של מורפולוגיה התא. בנוסף של מבנה התא, התוכן הנוירוכימיים עשוי להיקבע על נוירונים רשמו ^59,74. למשל, hydroxylase החלבון טירוזין תאיים ניתן immunolabeled לזיהוי חד-משמעי של נוירונים DA ^13.}

נוירונים DA מרוכזים בעיקר SN pars compacta, עם צפיפות נמוכה בהרבה נוכח SN pars reticulata, שם הם מתערבבים עם מספר גבוה יותר של נוירונים GABA ^75. בעוד גוף התא של הנוירונים DA הוא לעיתים קרובות גדול יותר מזה של נוירונים GABA, זיהוי חזותי של תאים אלה עם IR-videomicroscopy אינה ודאית הפריע חלקית את אטימות compacta pars. כדי לעקוף מגבלות אלו, הבחירה מראש של נוירונים DA ניתן להקל על ידי השימוש של עכברים מהונדסים המבטא בסמן פלורסנטי באוכלוסייה ספציפית של נוירונים (TH ⁶⁵ או DAT נוירונים DA, GADעבור נוירונים GABA) ואת התאורה epifluorescence. לחלופין, פלורסנט לצבוע עשוי להיכלל הפתרון של האלקטרודה סומטיים כדי להקל על ויזואליזציה של דנדריטים. רזולוציה מוגברת של התא פלורסנט מובא על ידי confocal דיסק מסתובב ניפקוב ^14,22,30 או שני הפוטונים מיקרוסקופיה ⁷ בשילוב IR-DGC ^6. כמה יתרונות קשורים DGC בהשוואת דסק"ש. ראשית, כפי מנסרות דסק"ש אינן נדרשות, תמונת IR-DGC ניתן ועליהן ^49,52,53,76 תמונת קרינה. שנית, DGC ניתן לשלב עם photostimulation ו optogenetics ^77.

חסרון של הכנת פרוסה הוא השמירה על השלמות של נוירונים. נוירונים DA להאריך הדנדריטים שלהם בשלושת המטוסים מרחבית ^78,79 ולכן עיצור של תא הדנדריטים לא ניתן להימנע לחלוטין פרוסות ^80. הבחירה של האורינטציה של פרוסות (עטרה, אופקי או פסקsagittal) היא trade-off. מקורו של העצבוב ואת תכנון הניסוי חייב להיחשב כדי לבחור את כיוון הזכות פרוסה.

תיקון הדנדריטים ישיר הוא הטכניקה המשמשת כדי למפות את התפלגות תעלות יונים פונקציונליות במדורים השונים של תאים. בנוסף, טכניקה זו מציעה לקבוע את השתנות תכונות פעילות של ערוצים ^20. כהשלמה המיקום וצפיפות של תעלות יונים ניתן לקביעה באמצעות אימונוהיסטוכימיה על מיקרוסקופ אור ואלקטרוניקה רמות ^17,23. גישה זו גם מציעה את האפשרות לקבוע את צפיפות הערוץ במבני קליבר קטנים אשר אינם נגישים טפטפות תיקון. עם זאת ערוצים אלה עשויים להיות במצב תפקודי ברור ²⁴ או אפילו פעילים בהשוואה לאלו אשר נרשמו באמצעות טכניקות תיקון- clamp. טכניקות שניהם לכן, יש לקבל תמונה מלאה על המיקום והמאפיינים שלתעלות יונים באזור תאי ספציפי ^17. עם התפתחותה של צבעים מתח רגיש, הדמיה מתח נעשה שימוש כדי לבחון את התפשטות של APS ו EPSPs בנוירונים במקומות מרובים ^81. כחלופה להקלטות תיקון- clamp כפולות, גישה זו ניתן ליישם גם עבור דנדריטים דק שאינם נגישים טפטפות תיקון אבל מחייבים כיול מדויק של האות ו המיצוע.

בעוד נוירונים DA ב SN ואזור tegmental גחון נחקרים נרחב באמצעות הקלטות סומטיים בהקשר הפיזיולוגי pathophysiological, את המאפיינים התפקודיים של הדנדריטים שלהם נותרים עלומים בעיקר בשני התנאים. תיקון מ דנדריטים יושם עבור נוירונים דופמין nigral על ידי מספר קבוצות עם הצלחה ^13,25,26 ונשאר שיטת הבחירה לנתח תכונות להתרגש מבני subcellular בסדר אלה ^8. הקלטות דנדריטים לספק opportu נוסףnity לבחון את היעילות ואת הפלסטיות של שידור הסינפטי פלסטיות של רגישות הדנדריטים ^82,83.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מים מזוקקים כפולים	Millipore	Super Q	Resistivity >14 MΩ ס"מ, אידיאלי 18.2 MΩ ס"מ ב-25  ° C, מסונן (0.22 ומיקרו; m), https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Super-Q-Plus-Water-Purification-System,MM_NF-C1760
נרות מיקרופילטר	Robu	נקבוביות 3, קוטר 6 מ"מ או 13 מ"מ
	ג'ילט	סופר סילבר
	בראון, Aesculap
תא			בהתאמה אישית
PP beckers	VWR	213-1725	400 מ"ל
מסנן מזרק	Merk Millipore	Millex - GV 0.22 µ m
דבק ציאנואקרילט	UHU	"Sekunden Kleber"	נוזלי
תא הקלטה	לואיגס & Neumann	Slice מיני תא
חולץ פיפטות אופקי	Sutter Instruments	חום-בוער P-97
פיפטות	הילגנברג	1807524	2 מ"מ OD/1 מ"מ תעודת זהות זכוכית, קצוות מלוטשים, שטוף
שעווה דנטלית	Coltè ne/Whaledent		רצועות שעווה של מגש אורתודונטי
רשת			לעיגון פרוסות בתא ההקלטה, בהתאמה אישית עם דיסק פלטינה
Microforge	Narishige	MF-830	לקצות פיפטה באש
אשלגן מתיל סולפט	MP Biomedicals	215481
מולקולריות	ביוציטין	B1592
מנומטר	GREISINGER אלקטרוני	GDH 13 AN
מיקרוסקופ	Zeiss	FS
Dodt שיפוע ניגודיות	Luigs & מניפולטורים נוימן
	לואיגס &	LN Mini 25
	מקור ההדמיה	מצלמת DFG/USB2pro
DAGE-MTI	NC-70
מעבה	Zeiss		צמצם מספרי גבוה עובד עם שמן
Objective	Zeiss	W Plan Apochromat 441470-9900 VIS-IR	63X הגדלה, למרחקים ארוכים, צמצם מספרי גבוה 1.0 טבילה במים המטרה
מחליף ארבעה	Luigs & נוימן		בין המצלמה למיקרוסקופ
צג וידאו בשחור-לבן	Sony	SSM-175CE	16 אינץ', 850 קווי טלוויזיה,
בקבוקי דגימה אנלוגיים, זכוכית ענבר, עם מכסה	VWR	215-2409	להעברת פרוסות מההתקנה לחדר ההיסטולוגיה
מדריך האקסון	ספר	התקנים
Stimfit	https://github.com/neurodroid/stimfit		ניתוח נתונים אלקטרופיזיולוגיים
Paraformaldehyde	Sigma	441244	ראה גיליון נתוני בטיחות והנחיית חומרים מסוכנים (EU) לפני השימוש
צלחת תרבית תאים באר	Greiner-Bio-One	662160	לצביעה של פרוסות קבועות
Triton X-100	Merk	108643	ראה גיליון נתוני בטיחות והנחיית חומרים מסוכנים (EU) לפני השימוש
עכבר אנטי-TH חד שבטי ראשוני	Immunostar	22941	ריכוז עבודה: 1/1,000
נוגדן משני נגד עכבר עזים - Alexa Fluor 568	Invitrogen - Thermo Fisher Scientific	A-11031	ריכוז עבודה: 1/500
סרום עיזים רגיל	Dako	X0907
ProLong Diamond Antifade	בדיקות מולקולריות - Thermo Fisher Scientific	P36961
Fluorescein Avidin DCS	Vector Lab	A-2011
מיקרוסקופ קונפוקלי	Olympus	FV1000
ImageJ	http://imagej.nih.gov/ij/
NeuronJ	http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/		plugin for ImageJ
Imaris	http://www.bitplane.com		שחזור נוירונים מלאים בביוציטין
נוירומנטי	http://www.reading.ac.uk/neuromantic/		שחזור נוירונים מלאים בביוציטין
WinWCP	http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm		ניתוח נתונים אלקטרופיזיולוגיים