genotyping של<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; על ידי ריבוזומלי Spacer PCR (RS-PCR)

סיכום

כאן, נעשה שימוש במרווח ריבוזומלי PCR (RS-PCR) יחד עם מערכת אלקטרופורזה ממוזערת כשיטה מהירה וברזולוציה גבוהה לגנוטיפ S. aureus בעלויות מתונות המאפשרות תפוקה גבוהה.

תקציר

המרווח הריבוזומלי PCR (RS-PCR) היא שיטת גנוטיפ חזקה ובעלת רזולוציה גבוהה עבור S. aureus המאפשרת תפוקה גבוהה בעלויות מתונות ולכן מתאימה לשימוש למטרות שגרתיות. לרזולוציה הטובה ביותר, הערכת נתונים וניהול נתונים, נדרשת מערכת אלקטרופורזה ממוזערת. יחד עם מערכת אלקטרופורזה כזו והתוכנה שפותחה בבית (זמינה כאן באופן חופשי), הקצאת תבנית הלהקות לגנוטיפ היא סטנדרטית וישירה. מיצוי ה-DNA הוא פשוט (הכנה לרתיחה), הגדרת התגובות קלה וניתן להריץ אותן בכל מכונת PCR סטנדרטית. רכיבה על PCR נפוצה למעט זמני התארכות והתארכות ממושכים. בהשוואה להקלדת ספא והקלדת רצף Multi Locus (MLST), RS-PCR אינו דורש ריצוף DNA מה שמפשט את הניתוח במידה ניכרת ומאפשר תפוקה גבוהה. יתר על כן, הרזולוציה של זני בקר של S. aureus טובה לפחות כמו הקלדת ספא וטובה יותר מ-MLST או אלקטרופורזה של ג'ל בשדה דופק (PFGE). בסיס הנתונים RS-PCR כולל כיום בסך הכל 141 גנוטיפים ווריאנטים. השיטה קשורה מאוד לדפוס הגן האלימות, להדבקה ולפתוגניות של זני S. aureus המעורבים בדלקת שד בקר. גנוטיפ B של S. aureus (GTB) מדבק וגורם לבעיות עדר הגורמות לעלויות גבוהות בשוויץ ובמדינות אחרות באירופה. כל שאר הגנוטיפים שנצפו בשווייץ מדביקים פרות ורבעים בודדים. גנוטיפ על ידי RS-PCR מאפשר חיזוי אמין של הפוטנציאל האפידמיולוגי והפתוגני של S. aureus המעורב בזיהום תוך-שדי של בקר (IMI), שני גורמי מפתח לרפואה וטרינרית קלינית. בגלל התכונות המועילות הללו יחד עם עלויות מתונות ותפוקת מדגם גבוהה, מטרת פרסום זה היא לתת פרוטוקול מפורט, שלב אחר שלב, להקמה והפעלה קלה של RS-PCR לגנוטיפ S. aureus במעבדות אחרות.

מבוא

סטפילוקוקוס (S. aureus) ידוע בתור הפתוגן החשוב ביותר בעולם האחראי לזיהום intramammary (תעש) בבקר ^1. מחקרם של פורנייה et al. ² הפגינו פרות השוויצרי לבין מחקרים על ידי Cosandey et al. ³ ו בוס et al. ⁴ בפרות של 12 מדינות אירופה כי ס aureus מבודד שור תעש היא קבוצה הטרוגנית גנטית. על ידי PCR הגברה של אזור spacer 16S-23S rRNA גניים (RS-PCR), סך של 17 גנוטיפים בתחילה התגלו 101 אפידמיולוגיה עצמאית מבודדים ^2. גנוטיפ B ו- C גנוטיפ (GTC) היו הנפוצים ביותר (80%), לעומת 15 גנוטיפים אחרים (GTS) התרחשו לעתים רחוקות, כל מה שהופך 1 עד 4% מכלל הבידודים. ברמה ³ האירופי, GTB, GTC, GTF, GTI, ו GTR היו גנוטיפים החשובים ביותר המהווים 76% מכלל זני ניתח (n = 456). GTB היה ממוקם במרכז אירופה whereas גנוטיפים אחרים הופצו באופן נרחב. 24% הנותרים של הזנים כללו 41 גנוטיפים, רבים מהם, עם זאת, נצפו רק פעם אחת.

המחקרים ידי פורנייה et al. ^2, Cosandey et al. ^3, ו גרבר et al. ⁵ הפגינו עוד כי גנוטיפים היו קשורים מאוד עם דפוס הגנים הארסיים שלהם, כמו גם על שוויצרי ברמה האירופית. המחקרים נוספים חשף הבדלים מסיביים בשכיחות תעש בין ס aureus GTB, GTC ואת גנוטיפים אחרים ^2,5: בהתחשב GTB, עד 87% של פרות בעדר נדבקו גנוטיפ זה. במקרה של GTC ושל גנוטיפים אחרים, לעומת זאת, תעש נמצא רק 1 עד 2 פרות של עדר.

תעש הנגרם על ידי S. aureus, בדרך כלל תוצאות דלקת של בלוטות החלב המקבילות וגידול של תאים דלקתיים בחלב. כתוצאה מכך, שיתוף תא סומטיunts בחלב (SCC), מחוון המפתח של איכות חלב ברוב מדינות העולם, הוא גדל מוביל מחיר חלב ירד או להפסיק בלידה אפילו.

מלבד RS-PCR של פורנייה et al. ^2, שיטות הקלדה אחרות תוארו עבור תת-סוגי זני שור של ס aureus ^8-11. שני נפוצים כוללים הקלדת ספא ¹² ו Multi לוקוס רצף הקלדה (MLST) ^13. האחד לשעבר מבוסס על DNA רצף באזור spacer משתנה של הגן המקודד ספא staphylococcal לחלבון A, ואילו אחד הדרישות המאוחרות רצף של 7 גנים משק. משמעות הדבר היא כי אחד ¹² ושבעה PCRs ^13, בהתאמה, צריכה להתבצע, ואחריו טיהור amplicon, תגובת סידור וניתוח באמצעות ציוד ספציפי. לעומת RS-PCR, השיטות האלה דורשות מאמץ נוסף ניכר במעבדה וכתוצאה מכך תפוקת מדגם נמוכה ומחירים גבוהים. ההתפוקה נמוכה במיוחד עבור PFGE. בהתחשב ברזולוציה של שיטות אלה זני שור של ס aureus, RS-PCR הוא טוב לפחות כמו ספא הקלדת ⁴ וטוב יותר מאשר MLST ⁴ או PFGE ^15.

כל השיטות הללו כוללים הקלדה בינארי ¹³ הפגינו יעילותם בהשגת תובנה נוספת לתוך בפתוגנזה של שור תעש הנגרמת על ידי S. aureus, אבל בגלל המגבלות שהוזכרו הם פחות מתאימים חקירות קליניות גדולות. בנוסף, גנוטיפ ידי RS-PCR כפי שתואר על ידי פורנייה et al. ² מאפשר חיזוי אמין של אפידמיולוגיים והפוטנציאל פתוגניים של ס aureus מעורב שור תעש, שני ערכים מרכזיים ברפואת וטרינרית קלינית.

פרוטוקול

1. Staphylococcus aureus מבודד

1. מורחים 10 μl של ס תרבות מניות aureus או מושבה אחד גדלה על מצע סלקטיבי על צלחות אגרו קולומביה המכילות דם כבשים 5% (BA).
2. דגירה אירובית על 37 מעלות צלזיוס למשך 18 שעות עד 24 שעות.

2. DNA הפקה

1. הכן חיץ טל המכיל 10 mM Tris-HCl ו -10 מ"מ Na ₂ EDTA, pH 8.5. כן aliquots חיטוי ב 121 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
2. אסוף 1 מושבת מבני עקיבא באמצעות לולאת פלסטיק סטרילית או מכוש שן עץ סטרילית גלולה ב 100 TEL μl. השתמש 1.5 מ"ל צינורות עם פקקי הברגה.
3. לדגור על 95 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. לאחר מכן, מניח את הדגימות מייד על קרח רטוב.
4. לדלל את דגימות 1: 100 ב H ₂ O מתאים PCR (= DNA תבנית עבור ה- PCR). הדגימות הלא מדולל למניה והרווח המדולל נשמרות ב -20 ° C עבור 1 חודש.

3. RS-PCR

1. עבור כל פיפטה מדגם לתוך צינור PCR 1.5 μl H ₂ O, 12.5 μl תקי מיקס מאסטר, 2 μl פריימר G1 10 מיקרומטר, 2 μl פריימר L1 10 מיקרומטר, ו -7 μl של תבנית ה- DNA המתאים לכ -30 ננוגרם של טהור DNA ^2.
2. הפעל את תכנית האופניים הבא בתוך Cycler PCR תקן: 15 דקות 95 מעלות צלזיוס, ואחריו 27 מחזורים המהווים 94 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות, ואחריו רמפת חישול 2 דקות ב 55 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות. לאחר רמפה 2 דקות נוספות, ישתרע על 72 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. לסיים PCR על ידי רחבה סופית על 72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ואחריו הרגעות עד 4 מעלות צלזיוס.
   הערה: מוצרי PCR יכולים להיות מאוחסנים ב -20 מעלות צלזיוס למשך 5 ימים.
3. עבור כל מחזור של RS-PCR לכלול שליטה חיובית, כלומר, מדגם עם גנוטיפ ידוע (בדרך כלל GTB), וכן שליטה שלילית (H ₂ O).

אלקטרופורזה 4.

1. השתמש ערכת אלקטרופורזה מסחרי מיניאטורי עבור DNA (ערכת MED) יחדעם bioanalyzer מחובר למחשב ואת התוכנות המותקנות. ללמוד את החוברות המקבילות של היצרן בקפידה.
2. הגדר את התחנה יחול שבב ולהתאים את קליפ המזרק פי הוראות היצרן.
3. מכינים את תערובת ג'ל צבע בהתאם למדריך של היצרן.
4. טעינת תערובת ג'ל צבע (על פי הוראות היצרן).
   1. לאזן את תמהיל ג'ל לצבוע RT למשך 30 דקות לפני השימוש.
   2. שים שבב דנ"א חדש בתחנת השבב יחול. פיפטה 9 μl של צבעי ג'ל ג מסומן היטב
   3. ודא כי הבוכנה ממוקמת 1 מ"ל ולאחר מכן לסגור את תחנת השבב יחול. בוכנה לחץ על עד הוא מוחזק על ידי קליפ המזרק. חכה בדיוק למשך 30 שניות ולאחר מכן שחררו את הקליפ המזרק.
   4. מתן 5 שניות. לאט לאט למשוך בחזרה הבוכנה 1 מ"ל עמדה.
   5. תחנה יחולו שבב פתח פיפטה 9 μl של ג'ל צבע בשתי הבארות מסומנות "G".
5. טעינת Marker
   1. פיפטה 5 μl של הסמן בכל 12 בארות מדגם ב הסולם היטב. אין להשאיר לכל אחת מ -13 אלה בארות ריקות.
6. טעינת הסולם ואת הדוגמות.
   1. פיפטה 1 μl של סולם ה- DNA אל מסומן היטב עם סימן הסולם.
   2. μl של מדגם 1 פיפטה (בארות בשימוש) או 1 μl של מים ללא יונים (בארות ללא שימוש).
   3. שים את השבב אופקי מתאם מערבולת דקות 1 ב -2,400 סל"ד.
   4. הפעל שבב bioanalyzer תוך 5 דקות.
7. הרצת ניתוח
   1. הפעל את bioanalyzer והמחשב מחובר. פתח את התוכנה.
   2. פתח את המכסה של bioanalyzer ומניח השבב לתוך החזיק השבב (השבב מתאים רק כיוון אחד). סגור את המכסה בזהירות.
   3. בהקשר Instrument של התוכנה לבחור "אלקטרופורזה"> "dsDNA"> "DNA 7500". קבל את קידומת הקובץ הנוכחית של התוכנה או לשנות אותה.
   4. לחץ על כפתור התחל הנוכחי בתוכנה. הזן את שמות מדגם בתוכנה. כאשר לרוץ השבב הוא סיים (לאחר כ -30 דקות) בסוף הודעת ההפעלה מופיע תוכנת bioanalyzer.
   5. הסר את השבב ולנקות את האלקטרודות של bioanalyzer בהתאם להוראות היצרן.

5. הסקת גנוטיפ מן בפרופיל אלקטרופורזה

1. טען את תוכנת המאהל (תוכנה זמינה באופן חופשי מן המחברים).
2. נתוני התייחסות יבוא לתוך התוכנה מהאל: "קובץ"> "נתוני הפנית יבוא"
3. פתח את אלקטרופורזה לפעול בהקשר הנתונים של תוכנת bioanalyzer. בחר פרופיל אלקטרופורזה של דגימה אחת.
4. בדקו הפסגות הרלוונטיות.
   1. השתמש בתוכנת המאהל לבדוק פסגות הרלוונטיות: "כלים"> "Mean קרינה". הכנס לתוך תיבת "הקרינה"ערכי הקרינה הצביעו כיחידות קרינה (FU) כפי שהם יכולים להיות הקריא מתוך תוכנת bioanalyzer. הכנס את 4 (3) פסגות עם הקרינה הגבוהה ביותר בסדר עולה המופרדים בפסיק. דוגמה: 126,130,132,137.
      הערה: אם לא כל FU הפסגות האלה מסומנים על ידי תוכנת bioanalyzer, הם צריכים להיות מוערכים על ידי קריאה אותם החוצה מן העלילה.
5. לחץ על כפתור "חשב". פסגה רלוונטית אם הקרינה נצפתה עולה על הערך הנתון בתיבה "גובה שיא מינימאלי".
6. להסיק הגנוטיפ.
   1. הכנס לתיבת טקסט מאהל "פיקס הקלט (נ"ב)" שהגדלים נ"ב של כל הפסגה הרלוונטית בסדר עולה המופרדים בפסיק. דוגמה: 440.462.519.579.637.
      הערה: אם לא כל בגדלי שיא אלה מסומנים על ידי תוכנת bioanalyzer, הם צריכים להיות מוערכים על ידי קריאה אותם החוצה מן העלילה.
7. לחץ על כפתור "חשב".
8. ברשימהתיבה, לחפש את המרחק המינימאלי בריבוע Mahalanobis "d2m". אם ערך P המקביל זכות הוא ≥0.05 אז ההסתברות היא ≥5% שההשערה H ₀ null נדחה (H _0: והנצפה והפרופיל למספרים זהים) כלומר הפרופיל ציין מקובל להיות זהה פרופיל הפניה של גנוטיפ המצוין.
9. אם d2m הוא מינימלי אבל בתחום הערך P המקביל ריק, לדחות H ₀ בהסתברות <5%.
   הערה: משמעות הדבר היא כי פרופילים הם לא שווים אף d2m היא מינימלית. תוצאה כזו עשויה לנבוע תנאי אלקטרופורזה הלא ממוצע.
   1. כדי לתקן את חריגות אלו, הכנס לתוך תיבת הטקסט "ציין שיא (נ"ב)" הערך 395 ולחץ על כפתור "חשב". בדוק שוב עבור d2m מינימאלית וכן ≥0.05 ערך P מקביל. אם לא מצליח, נסה את הערכים 405, 415, ו -425.
      הערה: לפעמים צעדים קטנים הם אפילוהצביע. אם עדיין לא מוצלח, הפרופיל שנצפה הוא לא נוכח נתוני ההפניה, זה יכול להיות הגנוטיפ או גרסה חדשים.
10. פרופילים שונים
    1. חזור על שלבים 5.6 כדי 5.9 עבור כל פרופיל אלקטרופורזה בנפרד.

תוצאות

הגדרה של גנוטיפ גירסאותיה

פרופיל electrophoretic הנבדלים יותר להקה אחת מכל גנוטיפים המזוהה נחשב גנוטיפ חדש. גנוטיפים חדשים בשם והאריך פי פורנייה et al. ⁵ המוביל גנוטיפים GTA כדי GTZ, ואחריו גנוטיפים GTAA כדי GTAZ, ו GTBA כדי GTBZ, ו GTCA כדי GTCC כיום. וריאציה רק ​​להקה אחת נחשבת כווריאציה גנוטיפ. יצוין עם ספרות רומית העילית אחר...

דיון

השלב הקריטי ביותר של ההליך כולו הוא כאשר יש עודף של דנ"א RS-PCR (> 30 ng DNA / assay טהור) ^2. באופן כללי, ברזולוציה של פרופיל היא אופטימלית אם כל הפסגות שלה התחלה וסיום על קו הבסיס. אם שתי פסגות הם קרובים מדי זה לזה, ברזולוציה אינה שלמה. בתנאים אלה, תוכנת bioanalyzer עלולה להוביל לזיהוי שיא הולם כך זיהוי ידני נדרש.

כל הפסגות המופרדות בעליל ורלוונטיות המבוטאות נ"ב או FU כלולים עבור ניתוחים ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan	Merck	1.08382.0500	Mw = 121.14 גרם/מול
Titriplex III	Merck	1.08418.0250	Mw = 372.24 גרם/מול; Substance שווה ערך ל-Na2EDTA· 2H2O
חומצה הידרוכלורית 5 mol/L	Merck	1.09911.0001
אגר קולומביה + 5% bioM מדם כבשים	; rieux	43049
Agilent DNA7500 Kit	Agilent Technologies	5067-1504
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2940CA
Agilent 2100 מומחה sofware	Agilent Technologies
HotStarTaq master mix	Qiagen	203445
פריימר L1	Mycrosinth		5'CAA GGC ATC CAC CGT3'Primer
G1	Mycrosinth		5'GAA GTC GTA ACA AGG3'