כתב יד זה מספק תיאור של המתודולוגיה המשמשת להקמת מודלים של עכברי התמרה-השתלה. ניתן תיאור מפורט של טעויות טכניות שיש להימנע מהן בעת ביצוע השתלות מח עצם. יש להשיג הבנה ברורה של החשיבות של טיטר ויראלי גבוה, טרנספקציה/התמרה והקרנה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
התמר-השתלה במודל עכבר של מחלה מיילופרוליפרטיבית
במאמר זה
סיכום
תקציר
השתלת טרנסדוקציה היא דרך מהירה ויעילה לדגמן ממאירויות המטולוגיות אנושיות בעכברים. טכניקה זו מביאה לביטוי של הגן המעניין בתאים המטופויאטיים וניתן להשתמש בה כדי לחקור את תפקיד הגן בהמטופואיזיס נורמלי ו/או ממאיר. פרוטוקול זה מספק תיאור מפורט כיצד לבצע השתלת טרנסדוקציה באמצעות מוטציות קלרטיקולין (CALR) שזוהו לאחרונה בניאופלזמה מיאלופרוליפרטיבית (MPN) כדוגמה. בפרוטוקול זה, תאי מח עצם שלמים מעכברים תורמים שטופלו ב-5-flurouracil (5-FU) מועברים עם רטרו-וירוס המקודד CALR מוטנטי ומושתלים במארחים סינגניים מוקרנים קטלניים. תאי תורם המבטאים CALR מוטנטי מסומנים בחלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP). עכברים מושתלים מפתחים פנוטיפ MPN הכולל טסיות גבוהות בדם ההיקפי, התרחבות של מגקריוציטים במח העצם ופיברוזיס במח העצם. אנו מספקים תיאור שלב אחר שלב כיצד ליצור רטרו-וירוס, לחשב טיטר נגיפי, להמיר תאי מח עצם שלמים ולהשתיל בעכברים מושתלים מוקרנים.
מבוא
התמר-השתלה היא שיטה שימושית מודל ממאירויות המטולוגיות בעכברים. טכניקה זו כבר יקר במיוחד ללימוד ממאירויות מיאלואידית שראשיתה ההפגנה הראשונה כי ביטוי אקטופי של BCR-ABL1 יכול בנאמנות לשחזר לוקמיה מיאלואידית כרונית בעכברים 1. טכניקה זו לאחר מכן יש להקל את המחקר המקיף של JAK2 V617F ו MPL W515K / L מוטצית מחלה מיילופרוליפרטיבית (MPN).
MPN הוא קבוצה של ממאירויות המטולוגיות המאופיינת היתר של תאים מיאלואידית בוגרים סיסטיק מח עצם. מחלות אלה נובעים בדרך כלל מהרחבת המשובטים של תא גזע hematopoietic כי רכשה מוטציה סומטיים או Jak2, MPL, או CA....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
מחקר זה אושר ובוצע בהתאם להמלצות של ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש באוניברסיטת קליפורניה, אירווין. כל הנהלים בוצעו בהרדמה isoflurane וכל המאמצים שנעשו כדי למזער את הסבל.
1. דור של רטרו-וירוס Ecotropic
- כן פלסמידים באיכות גבוהה עם ריכוז של לפחות 1 מיקרוגרם / μl או באמצעות טיהור כלוריד מסחרית maxi-prep ערכה או צזיום.
הערה: אלה כוללים וקטור השדרה MSCV קידוד הגן של עניין (במקרה זה CALR 7,8) ו סמן הבחירה (GFP, ניאו, וכו ') וכן פלסמיד אריזה ecotr....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הטכניקה התמר-השתלת תוצאת הכינון מחדש hematopoietic של עכברי הנמען עם תאים המבטאים את הגן של עניין. איור 1 מציג סקירה של מודל העכבר התמר-השתלת calreticulin מוטצית MPN. בקצרה, רטרו-וירוס להביע CALRwt או CALRdel52 משמש להדביק תאים BM מתוך עכבר התורם C57B / 6. תאי transduced מושתלים לתוך engraftment עכבר התא תורם למקבל C57B / 6 מוקרן מתרחש במשך החודש שלאחר ההשתלה הראשונה. עדות פנוטיפ המחלה הופכת 3 לכאורה חודשים לאחר ההשתלה שבו נמצאת תצ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פרוטוקול זה מספק תיאור מפורט של איך לבצע השתלות מח עצם בעכברים לשחזר מחל thrombocythemia דמוי חיונית עם התקדמות מיילופיברוזיס ראשונית עם מוטצית CALRdel52 כנהג מחלה. השתלה מוצלחת של תאי המבטאים תוצאות CALRdel52 במספר טסיות דם מוגברים, הרחבת megakaryocytes, סיסטיק מח עצם. השתלת מח עצם היא תהליך רב שלבי, חשוב להכיר שלבים שבהם ניתן להימנע טעות טכנית למנוע engraftment עניים של תאים המבטאים את הגן של עניין או אפילו מוות העכבר.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכת על ידי V Foundation Scholar (AGF) וקרן המחקר MPN (AGF).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <קווי תאים חזקים> | |||
| DMEM | קורנינג | MT-10-013-CV | |
| 293T תאי | ATCC | CRL-11268 | |
| 3T3 תאים | ATCC | CRL-1658 | |
| <חזק>פלסמידים | |||
| EcoPak, הידוע גם בשם pCL-Eco | Addgene | 12371 | ניתן להשתמש בקווי תאי אריזה רטרו-ויראליים, כגון EcoPack 2-293, במקום הפלסמיד EcoPak ותאי 293T סטנדרטיים. פלסמידים נוספים של מעטפת γ-רטרו-וירוס ואריזה זמינים מ-Addgene ואחרים. |
| MSCV-IRES-GFP (MIG) | Addgene | 20672 | פלסמידים נוספים של העברה רטרו-ויראלית &גמא;-זמינים מ-Addgene ואחרים. |
| <חזק>חומרים מתכלים | |||
| 27 גרם x 1/2 אינץ' מחטים | BD | 305620 | |
| סרום בקר עוברי | קורנינג | MT-35-010-CV | |
| פניצילין/סטרפטומיצין/L-גלוטמין | קורנינג | MT-30-009-CI | |
| טריפסין-EDTA (0.05%) | קורנינג | MT-25-052-CI | יכול להיות PBS תוצרת בית |
| קורנינג | MT-21-031-CV | ||
| 10 ס"מ כלים | פישר | 172931 | |
| 15 מ"ל צינורות חרוטיים | פישר | 12565268 | |
| 60 מ"מ פישר | 150288 | ||
| פוליברין | פישר | NC9840454 | |
| 5-FU | פישר | A13456-06 | |
| 100 µ מסננות תאים m | פישר | 22363549 | |
| צינורות חרוטיים 50 מ"ל | פישר | 12565270 | |
| צלחת 6 בארות | פישר | 130184 | |
| צינורות FACS | פישר | 14-959-5 | |
| 0.45 μ מסנני מזרק m | פישר | 0974061B | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | |
| מאגר ACK | Lonza | 10-548E | יכול להיות תוצרת בית |
| עכבר רקומביננטי IL-3 | Peprotech | 213-13 | |
| עכבר רקומביננטי IL-6 | Peprotech | 216-16 | |
| עכבר רקומביננטי SCF | Peprotech | 250-03 | |
| X-tremeGENE 9 | Roche | 6365809001 | מגיב טרנספקציה |
| 1.5 מ"ל צינורות צנטריפוגה | ארה"ב מדעי | 1615-5500 | |
| <חזק>ציוד | |||
| BD Accuri C6 | |||
| רנטגן |
מקורות
- Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome. Science(New York, N.Y.). 247 (4944), 824-830 (1990).
- Wernig, G., Mercher, T., Okabe, R., Levine, R. L., Lee, B. H., Gilliland, D. G.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
