מאמר שיטה

כריך נייר מסנן מתחת למים במשך לטווח ארוך אקס אובו זמן לשגות הדמיה של מוקדם צ'יק עובר

24.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54636

⸱

28 בדצמבר 2016

 ,  , 
1Department of Orthopaedic Surgery, VU University Medical Center Amsterdam, MOVE Research Institute Amsterdam, 2Department of Anatomy, Embryology & Physiology, Academic Medical Center Amsterdam

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים טכניקה חדשה לתרבית עוברי אפרוחים ex ovo להדמיית זמן-lapse באמצעות אור מועבר ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית. כריך נייר הסינון השקוע הוא גרסה של טכניקת נושא נייר הסינוןהמבוססת 1 המאפשרת גידול של עוברי אפרוחים שקועים במלואם במדיום תרבית נוזלי.

תקציר

בשל זמינותו, בעלות נמוכה, גיאומטריה שטוחה, ושקיפות, לשעבר אובו עובר אפרוח הפכה מודל בעלי חיים בעלי חוליות גדול לחקר אירועי המוךפו"גנטי שהולכים, כגון gastrulation 2, neurulation 3 - 5, somitogenesis 6, לב כיפוף 7, היווצרות 8, והמוח 9 - 13, במהלך העובר מוקדם. מפתח להבנת תהליכים המוךפו"גנטי שהולך הוא לעקוב אחריהם באופן דינמי על ידי זמן לשגות הדמיה. רכישת זמן לשגות סרטים של אובו לשעבר חומוס העובר הוגבלה או חלונות זמן קצרות או על הצורך באינקובטור לשלוט בטמפרטורה ולחה סביב העובר 14. כאן, אנו מציגים טכניקה חדשה כדי חומוס התרבות עוברת אובו לשעבר הדמיה ברזולוציה גבוהה זמן לשגות באמצעות מיקרוסקופ אור מועבר. כריך נייר פילטר השקוע הנו נגזר של techn נייר המוביל והמבוסס המסנןique (תרבות EC) 1 ומאפשר של עוברים חומוס ללא צורך בתא האקלים. העובר הוא דחוק בין שתי נושאות בנייר זהה מסנן והוא כל זמן שקוע לחלוטין בתווך פשוט, בקרת טמפרטורה מכוסית בשכבה של שמן מינרלי אור. החל משלב פס פרימיטיבי (המבורגר, המילטון בשלב 5, HH5) 15 עד לפחות בשלב 28-somite (HH16) 15, עוברים יכול להיות מתורבת עם עד משני הצדדים הגחון או הגב שלהם. זה מאפשר רכישת זמן לשגות סרטים ומכסים כ 30 שעות של התפתחות עוברית. מסגרות זמן לשגות סרטים נציג מוצגים. עובר מושווים מורפולוגית לעובר בתרבית EC-התרבות הסטנדרטית.

כריך נייר פילטר השקוע מספק סביבה יציבה ללמוד הגבו מוקדם ותהליכים המוךפו"גנטי שהולכים גחון. זה גם מאפשר דימות פלואורסצנטי חיים micromanipulations, כגון המיקרו-כירורגיה, שד חרוזlantation, microinjection, להשתקת גנים, ואת electroporation, ויש לו פוטנציאל חזק כדי להיות משולב עם מטרות טבילה הדמיה מבוססי לייזר (כולל מיקרוסקופ אור גיליון).

מבוא

העובר בשלב ריתק אדם מאז תחילת ההיסטוריה. איך המבנה והמורפולוגיה של עובר להתפתח בצורה של זמן ומרחב מוגדר היטב כל כך? העובר החומוס הפך לאחד הדגמים בעלי החיים בעלי חוליות הקלסיים עבור עובר מכמה סיבות: זה זמין בקלות, זול, שקוף בשלביה הראשונים, ונגיש מניפולציות ניסיון, כפי שהוא מתפתח מחוץ אמא. יתר על כן, יש לו גיאומטריה שטוחה כמעט במהלך אירועי המוךפו"גנטי שהולכים מוקדם, כגון לב היווצרות המוח, gastrulation, neurulation, ו somitogenesis 15.

ניתן להבין בצורה הטובה ביותר תהליכים המוךפו"גנטי שהולכים אם הם נלמדים באופן דינמי, כגון באמצעות רכישת זמן לשגות תמונות. העובר חומוס ניתן דמיינו ב אובו 16 אבל עם נגישות נמוכה מניפולציות ניסיוני וראות מוגבלת הדמיה מיקרוסקופ אור ההולכה. לכן, לנתקטכניקות אל הוצעו על מנת אובו לשעבר חומוס עוברים תרבות, גם במערכות תרבות חלמון כולה 13,17 - 19 או תרבויות explant 1,20 - 23. במערכות תרבות חלמון כולו, העובר נשאר על גבי החלמון שלם, ואת התוכן כולו של הביצה מועברת למיכל אחר לאינקובטורים. מיכל זה יכול להיות מעטפת ביצית פונדקאית 17, בצלחת פטרי 19, או ערסל עשוי בניילון נצמד 13,18. עוברים בתרבויות חלמון כולו באופן אידיאלי יכול להיות מתורבת עד הבקיעה והם נגישים micromanipulations. שיטות אלה יעילות במיוחד ללימוד פיתוח של עוברים לאחר תחילתו של מחזור הדם (דבר המגדיל את הניגוד), בעוד עוברי הצעיר להישאר קשה לדמיין. עוברי מוקדם אלה יכולים להיות צילמו הכי טוב אם הם נכרת מן החלמון מתורבת כמו explants במבחנה. Explants הם נגישים בקלות עבור הניסוימניפולציות אל ודורשים פחות מקום עבור culturing. במשך שנים רבות, טכניקת החלוץ ידי דניס החדש ב -1955 הווריאציות שלה היו סטנדרטי זהב של שיטות תרבות explant עבור עבר חומוס, ובכך להפוך את העובר נגיש עבור מיקרוסקופיה זמן לשגות והתערבויות microsurgical 20,21. למרות ההצלחה הגדולה שלו, הטכניקה החדשה היא יחסית תובענית זמן רב. Blastoderm לעתים קרובות מנתק כאשר קרום vitelline, נושאת את blastoderm, נמתח סביב טבעת זכוכית כדי להשיג את המתח הנכון 1. יתר על כן, העובר יכול להיות מתורבת רק עם למעלה בצד הגחון שלה. הנציבות האירופיות התרבות (מוקדם צ'יק), טכניקה חדשה יותר פותחה על ידי צ'פמן Collignon 1, עוקפת את המתיחה של קרום vitelline באמצעות הספק נייר פילטר עם צמצם מרכזי. העיתון המסנן מייחס את קרום vitelline, ובכך שמירת המתח הטבעי שלה, והיא מקיפה את העובר כמו מסגרת תמונה 1.הם עוברים בתרבית על התחתונה אגרה-חלבון, בדרך כלל עם למעלה בצד הגחון שלהם. Culturing כלפי מעלה הגבי נראה אפשרי רק עבור העוברים HH8 15 ומעלה. קבוצות רבות יש להתאים את הספק נייר סינון לצרכים שלהם, כגון על ידי החלפת התחתונה אגר-חלבון עם תמיכה מסיבים תפר כירורגי 24 או קולגן מצופה קרום 25. לעתים קרובות, עוברים תרבותי עם הטכניקה החדשה או עם תרבות EC נחשפים, עם הגב שלהם או משטח הגחון לאוויר כדי להקל דיפוזיה חמצן 1,20. יש תרבויות explant אלה כדי להישמר באווירה humidified כדי למנוע אידוי של המדיום וכדי למנוע את העובר מפני התייבשות. זו מושגת על ידי דוגר את המנה עם תרבות explant בצלחת פטרי גדולה המכילה רקמות לחלחו נייר 1. רכישת זמן לשגות תמונות של עוברים אלה דורש גם את השימוש של חממה אקלים מבוקר סביב המיקרוסקופ כולו או מזגature שבשליטת מיכל עם מכסה מחומם כדי למנוע התעבות של נתיב האור 14. עם זאת, עוברים חומוס יכול גם לפתח לשעבר אובו שקוע לחלוטין במדיום תרבות כמו תרבויות נייר פילטר 25, בסנדוויץ 'בין שכבה של שמן מינרלי כבד חלבון ב adaptions של הטכניקה החדשה 2,21, או כמו explants blastoderm מקופל "קורניש בצקי תרבות "23,26, ללא מגע ישיר עם האוויר.

כריך נייר פילטר השקוע הוא גרסה חדשה של הטכניקה המובילה נייר סינון. על ידי שילוב של ידע מוקדם על culturing עובר חומוס אובו לשעבר, זה הופך את חממת האקלים מבוקרת ואת המכסה המחומם אפשר לוותר עליהן. העובר הוא דחוק בין שתי נושאות נייר סינון זהה (בחיתוך ליזר) 24 ותרבותי שקוע לחלוטין בתוך מדיום תרבות פשוטה (Pannett-קומפטון מלוח 27,28 ו חלבון רזה לייחס 3: 2) ב בטמפרטורה המבוקרת מכיליםאה. שכבת שמן מינרלי אור צף על גבי המדיום מונעת 2,21 אידוי וממזער אובדן חום לסביבה. תחתית המכל יש חלון זכוכית, ואת ההתקנה כולה מתבצעת על מיקרוסקופ זום מרחק עבודה ארוכה זקוף. התקנה זו מאפשרת רכישת סרטים זמן לשגות brightfield ו darkfield ברזולוציה גבוהה של כ -30 שעות של ההתפתחות העוברית, החל משלב פס פרימיטיבי מוקדם לשלב 28-somite (שווה ערך ל המבורגר המילטון בשלבים 5 עד 16, HH5-16 15). עוברים יכול להיות מתורבת באותה מידה עם למעלה בצד הגחון או הגב שלהם. לכן, עוברים נגישים תצפית ומניפולציה של הגחון (למשל, לב מוקדם 7,8 ו somitogenesis 6) ו הגבי (למשל, בסוף gastrulation 2, סגירת הצינור העצבי 3 - 5, ובתחילת המוח 9 - 13) פיתוח. את p כריך נייר סינון שקועrovides סביבה פשוטה ויציבה עבור המיקרו-כירורגיה, השתלת חרוז, microinjection, להשתקת גנים, ומחקרים electroporation. פוטנציאל הדמיה שלה יכול להיות דחף הרבה יותר על ידי שימוש הדמיה מבוססי לייזר (כולל מיקרוסקופ אור גליון) ויעדים טבילה.

פרוטוקול

כל הפרוצדורות בוצעו בהתאם ניסויי הולנד על בעלי חי חוק.

הערה: שיטת כריך נייר הסינון השקועה היא שונה מ -1.

1. הכנת מסנן שקוע סנדוויץ נייר

  1. Pannett-קומפטון (PC) -saline 27,28
    1. להכין פתרונות מניות (1 ליטר של ultrapure H 2 O, 121 גרם של NaCl, 15.5 גרם של KCl, 10.42 גר 'CaCl 2 · H 2 O, ו -12.7 גרם של MgCl 2 · 6H 2 O) ו- B (1 ליטר של ultrapure H 2 O, 2.365 גרם של Na 2 HPO 4 · 2H 2 O, ו 0.188 גרם של 2 לאא PO 4 · 2H 2 O) בבקבוקים 1-L נקי. ולאחסן אותם ב 4 ° C.
    2. הכן 1 ליטר של מלוחים PC ידי ערבוב 900 מ"ל של ultrapure H 2 O עם 40 מ"ל של פתרון המניות ו -60 מ"ל של B פתרון המניות (לפי סדר זה, כדי למנוע משקעים). כן fr PC-מלוח הטריפתרונות המניות אום א 'וב' כל שבוע.
      הערה: פתרונות מניות יכולים להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס במשך כמה חודשים. מעוקר ו / או הוספת אנטיביוטיקה או antimycotics אינה נחוצה.
  2. דגירה של ביצי תרנגולת מופרות
    1. חממה humidified, מטילים את הביצים בצד שלהם דגירה אותם על 37.5 מעלות צלזיוס עד שהם מגיעים לגיל הרצוי.
      הערה: חנות ללא ביצים יותר משבועיים (רצוי 12 - 15 ° C) לפני הניסוי, כמו hatchability יקטן באופן משמעותי
  3. ספקי נייר סינון (מותאם מ 1)
    1. אם זמין, להשתמש במכונת חיתוך ליזר לחתוך ספקי נייר פילטר בצורת שעון חול מנייר סינון עבה (28 מ"מ x 22 מ"מ). להתחדד רוחב באמצע מ -22 מ"מ עד 10.4 מ"מ. לגזור צמצם אליפטי מרכזי (10.6 מ"מ x 5.5 מ"מ), עם הציר כבר המקבילי חוקי האליפסה לצד הגדול של מוביל נייר סינון (איור 1-M).
      1. לחלופין, להכין שבלונה מקרטון עם הממדים הנכונים ולהעביר מתאר שלה וכי של הצמצם המרכזי נייר סינון עבה בעפרון. לגזור מוביל נייר סינון באמצעות מספריים בסדר.
    2. חותך שתי נושאות נייר סינון זהות עבור כל עובר להיות explanted. כן ספקי נייר סינון נוספים כגיבוי למקרה עובר הולך לאיבוד במהלך explanting.
  4. אמבטית בקרת טמפרטורת שמן (ביום של הניסוי)
    1. מניח את כוס בקרת הטמפרטורה במרכז של XY-הבמה הממונע של המיקרוסקופ זום זקוף ולחבר את הכוס אל בקר הטמפרטורה שלה.
    2. שים ארבע טבעות נירוסטה גדול (30 מ"מ קוטר חיצוני, 4 מ"מ גובה, 1.5 עובי דופן מ"מ) לתוך צלחת 6 ס"מ פטרי לפעול כמו משקולות במקום צלחת באמצע כוס בקרת טמפרטורה.
      הערה: צלחת פטרי זה רק משמש כמציין מיקום להתאים את leve שמןl.
    3. מלאו את כוס בקרת טמפרטורה עם 130 מ"ל של שמן מינרלי אור. התאם את מפלס השמן במידת הצורך, כך שהוא יסתיים כ -3 מ"מ מתחת לקצה העליון של המנה 6 ס"מ פטרי.
    4. מוציאים את המאפה 6 ס"מ פטרי מקנקן בקרת טמפרטורה ולהגדיר את הטמפרטורה ל 40 מעלות צלזיוס.

2. הפקת סנדוויץ נייר סינון שקוע

  1. בינוני תרבות (ביום של הניסוי)
    1. יוצקים 30 מ"ל של תמיסת מלח PC (כפי שהוכנו בצעדים 1.1.1 1.1.2) לתוך צינור צנטריפוגות 50 מ"ל. הכן צינור צנטריפוגות אחד 50 מ"ל מלא 30 מ"ל של תמיסת מלח מחשב לכל שני עוברים להיות explanted.
    2. בזהירות לפצח ביצה הלא מודגרות לתוך צלחת 10 ס"מ פטרי.
    3. קציר חלבון רזה על ידי העברת פיפטה העברת פלסטיק לאורך הקירות של צלחת פטרי ולהכניס פנימה את החלבון דק. אסוף 30 מ"ל חלבון רזה צינור צנטריפוגות 50 מ"ל לכל שני עוברים להיות explanted. הקפד לקבל רק את tין חלבון.
      הערה: בדרך כלל 3 - 4 ביצים לאפשר את המסיק של כ -30 מ"ל של חלבון רזה.
    4. יוצקים 20 מ"ל של חלבון רזה לתוך כל-מלוחים PC מלא 50 מ"ל צינור צנטריפוגות (כפי מוכן בשלב 2.1.1).
    5. מערבבים את-מלוחים PC עם חלבון רזה על ידי היפוך בעדינות את הצינורות מספר פעמים. תן לו להתיישב במשך כמה דקות ולבדוק אם התערובת, שנקראה בינוני תרבות מכאן ואילך, ברורה. אם מדיום התרבות אינו ברור, להכין PC-מלוח טרי מפתרון המניות ולמסוק חלבון רזה טרי.
  2. מניח שתי טבעות נירוסטה קטנות (20 מ"מ קוטר חיצוני, 4 מ"מ גובה, עובי דופן 1.5 מ"מ, 6.5 פער מ"מ הטבעת) רחוק ככל האפשר בצלחת פטרי 6 סנטימטרי פלסטיק טריה ולמלא אותו עם 22 מיליליטר של תרבות בינוני (כפי שהוכנו בצעדים 1.4.1 כדי 1.4.4) בעזרת פיפטה פלסטיק 25 מ"ל (איור 1-H). ודא כי הפסולת שהצטברו על גבי המדיום נשאר בצינור צנטריפוגות.
  3. הסר o פסולתr בועות מהמדיום בעזרת פיפטה העברת פלסטיק.
  4. למלא צלחת 10 ס"מ פטרי עם 75 מ"ל של תמיסת מלח PC (לשמש בשלב 2.15).
  5. הסר ביצה מן החממה ולתת לו לנוח על הספסל על צידו דקות 1 לתת העובר לבוא העליון של החלמון.
  6. בזהירות לסדוק את הביצה לתוך צלחת פטרי (איור 1-A). משרה את הקצה של פיסת נייר טישו משובח החלבון העבה ומרכז את blastoderm ידי משייכת, במידת צורך.
  7. הסר ביותר של החלבון הדק בעובי מצלחת פטרי בעזרת פיפטה פלסטיק העברה (עם הקצה לחתוך כדי להקל על הספיגה של החלבון העבה).
  8. צור חלון החלבון העבה סביב העובר על ידי מוחה את החלבון העבה בעדינות עם פיסת נייר טישו, מתרחק מהמרכז (איור 1-B). למנוע את נייר האריזה מן נלוות קרום vitelline.
  9. בעזרת פינצטה, בזהירות למקם נשאית נייר סינון על Viteקרום lline סביב העובר, עם ציר כבר המקבילי הצמצם אליפטי לציר האחורי-הקדמי של העובר (איור 1-C).
  10. לצבוט קצה אחד של מספריים לציפורניים דרך הממברנה vitelline הקרובה למוביל נייר הסינון לחתוך במהירות ברחבי מוביל נייר סינון כולה (איור 1-D).
  11. בעזרת פינצטה, הרם את המוביל נייר סינון מן החלמון הקבלה בכיוון אלכסוני לציר הקדמי, האחורי של העובר (איור 1-E).
  12. סובבו את הספק נייר סינון סביב להיות בצד הגחון של העובר על גבי להשקיע אותה-מלוחים PC. לטבול מוביל נייר הסינון לאורך הציר הקדמי, אחורי של העובר בכיוון אלכסוני.
  13. היפטר כל החלמון עדיין מחוברת הממברנה vitelline ואת blastoderm ידי שטיפתו בעדינות עם מי מלח מחשב מפני פיפטה פלסטיק העברה. שמור את המכלול המוביל נייר סינון שקוע בכלפעמים LL (איור 1-F).
  14. סר המוביל נייר סינון מן-המלוח PC לאורך הציר הקדמי, אחורי של העובר בכיוון אלכסוני ו להיפטר הנוזל העודף בטופחו הקצה המוביל נייר הסינון על ממחטת נייר.
  15. החזק את נייר הסינון אופקי, עם הצד הגחוני של העובר פונה כלפי מעלה, ומניח אחר המובילים נייר פילטר על גבי הראשון, באמצעות זוג נוסף של פינצטה. הפתחים שלהם צריכים להתאים בדיוק, ובכך רבדה העובר בין שתי השכבות של נייר סינון (איור 1-G).
  16. מייד להטביע את הכריך המוביל נייר סינון לתוך מדיום התרבות בכיוון אלכסוני לאורך ציר ה- הקדמי, האחורי של העובר. מניח אותו באזור מחלק את המרחב בין שתי טבעות הפלדה (איור 1-H).
  17. תקן את כריך נייר פילטר על ידי הצבת שתי טבעות פלדה יותר על גבי שני אחרים, ולוודא כי הצמצם עם הדוארmbryo השרידים שנתגלו לחלוטין (איור 1-I).
  18. בדוק את הרמה הבינונית לוודא כי spacer העליון רק הוא שקוע בתוך המדיום. במידת הצורך, להוסיף או להסיר כמויות קטנות של המדיום.
  19. בזהירות במקום צלחת פטרי במרכז באמבטיה שמן בקרת טמפרטורה ולייצב את המנה רוחבית על ידי הצבת שלוש טבעות נירוסטה גדול (30 מ"מ קוטר חיצוני, 4 מ"מ גובה, 1.5 עובי דופן מ"מ) לצד המנה בשמן . ודא כי טבעות פלדה לגעת בדפנות של המנה (איור 1-J).
  20. לאט פיפטה כ -6 מ"ל של שמן מינרלי אור על גבי המדיום עם טפטפת העברת פלסטיק, כך המדיום מכוסה שכבה רציפה של שמן מינרלי (איור 1-K).
  21. הגדר את רכישת זמן לשגות.
    הערה: הדמיה העוברים כמו פנורמות אופקיות של חמש תמונות תת חופפים (אריחים) מאפשרת הדמיה מפורטת (אובייקטיבית 5X), עם overvi כלליEW של מורפולוגיה 29-30. במרווחי הדמיה בין 3 ל 10 דק 'לאפשר המעקב המפורט של מורפולוגיים משנה 31, ורכישת Z- ערימות קטנות (חמישה עד שבעה מטוסים שונים, תוך שמירת מרחק של 30 מיקרומטר) מפצים על הרבה של עיבוי המפנה של העובר 30 . ניתן לבחור Z-מטוסים עם הניגוד הגבוה ביותר לפני עיבוד נוסף 32 של מסגרות יחידה לתוך סרטי הזמן לשגות (ראה סעיף נציג תוצאות לקבלת מידע מפורט על רכישת תמונה).

figure-protocol-1
איור 1: הגדרת סנדוויץ נייר סינון השקוע. (א) ביצה סדוקה לתוך צלחת פטרי. (ב) רוב החלבון באש ובמים יוסרו צלחת פטרי עם טפטף פלסטיק העברה (לא מוצג). לאחר מכן, חלון החלבון העבה הוא יצרסביב העובר על ידי מוחה את החלבון העבה בעדינות עם נייר טישו. (C) מנשא נייר הסינון ממוקם סביב blastoderm על גבי החלמון. (ד) המוביל נייר המסנן להתנתק מן הקרום vitelline שמסביב (E) הוסרו מהחלק העליון של החלמון. (ו) חלמון הנותרים הוא נשטף בזהירות באמבט PC-מלוח. (ז) עובר הוא דחוק עם מנשא נייר סינון זהה שני. (ע) כריך נייר פילטר טבול בתוך המדיום ואת מיקומו על שתי טבעות נירוסטה מתכת פלדה (הגבי פונה העובר או בצד הגחון למעלה). (אני) שתי טבעות לייצב את הכריך מלמעלה. (י) את צלחת פטרי שמכילה את העובר מועבר אמבט שמנים עם בקרת טמפרטורה. טבעות פלדת אל-חלד לייצב את צלחת פטרי רוחבית. (יא) בינוני התרבות מכוסה בשכבה של שמן מינרלי.(L) סכמטי של הכריך המסנן השקוע. (M) מידות של ספקי נייר פילטר המשמשים את כריך נייר פילטר השקוע. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

תוצאות

figure-results-1
איור 2: השוואת מורפולוגי בין העוברים EC תרבות 1 ובתרבות סנדוויץ מסנן נייר שקוע. מסגרות זמן לשגות נבחרים להראות את העוברים על 3 במרווחים hr. מסגרות תשתנינה לתת סקירה של מורפולוגיה עובר מלאה. העוברים היו גיל בהתאמה לשלב 7-somite (HH9) 15. hr 0 מציין את תחילת כל ניסוי. Anterior היא תמיד שמאלה. תמונות נרכשו באמצעות תאורה darkfield. (א) העובר בתרבות EC 1, בצד גחון בתרבית עד על-חלבון אגר 1,33 תחתון. תמונות באיכות גבוהה ניתן לרכוש, כמו העובר כלוא בתוך-בכיוון z. (B ו- C) שני עובר בתרבית כריך נייר פילטר השקוע: (ב) בצד גחון עד ו- (ג) הגבה פונה כלפי מעלה.עוברים את הכריך נייר פילטר להתפתח ללא הבדלים איכותיים עבור שעה 27 לפחות. הם מפתחים את זרימת דם פונקציונלית כפפו גולגולת צוואר רחם ולהפוך בהצלחה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

רכישת זמן לשגות תלויה במערכת מיקרוסקופ זמינה. במחקר זה, מרחק עבודה ארוך, מיקרוסקופ זום הזקוף היה בשימוש. גורם זום נקבע 5X. בשילוב עם הגדלה 16X של העינית, זה הביא 80x הגדלה מוחלטת, עם רזולוציה תיאורטי של 1.3 מיקרומטר / פיקסל (כאמור התוכנה מיקרוסקופ) 30. כדי להגדיל את השדה של נוף, עובר הם צלמו כמו פנורמות אופקיות של חמש תמונות משנה (אריחים). לכן, אזור אריח, מורכבת מחמישה אריחים חופפים, הוגדר 29. באזור אריח זההוצב כך שיכסה את הצמצם אליפטי מלא של מוביל נייר הסינון בתוסף האופקי שלה (איור 2 ב - 0 hr). היה כל אריח בגודל של 2,048 x 2,048 פיקסלים, המשתרע על שדה של נוף של כ -2.7 מ"מ, ואריחים נרכשו עם חפיפה של 10%, וכתוצאה מכך בתחום של נוף כולל של כ 12 מ"מ x 2.7 מ"מ עבור הפנורמה. XY-הבמה הממונעת עברה ביחס המטרה עם מהירות של כ 1.75 מ"מ / sec בין רכישת האריחים הנפרדים 29. תמונת חיים התמקדה mesoderm presomitic הקדמי ואת somites ביותר הקים לאחרונה (מוקד המחקר של הקבוצה שלנו). כדי לפצות על העיבוי והמסתלסל של העוברים-בכיוון z, Z- ערימות קטנות (חמישה עד שבעה מטוסים שונים, תוך שמירת מרחק של 30 מיקרומטר) נרכשו בכל נקודת זמן 30. אלה נבחרו ברחבי מישור המוקד של הקצה הקדמי של mesoderm presomitic. משך ACQ זמן לשגותuisition נקבע ל -50 שעות, ומרווחי הדמיה של 3, 4, או 10 דקות נבחרו 31. איכות רכישת הזמן לשגות עשויה להשתפר באמצעות refocusing כל 5 - hr 10 ו מגדיר מחדש את Z- המחסנית סביב מטוס המוקד האופטימלי החדש. בסוף הניסוי, כל הזמן-הסדרה נערכה באופן ידני, וקבוצות משנה של תמונות המכילות את Z- מטוס עם המוקד הטוב ביותר נוצרה והצילה לתיקייה נפרדת 32. תת אלה של התמונות היו פעם תפורות ליצור זמן-סדרה שלמה של תמונות עם פוקוס אופטימלי. האריחים של כל תמונה של סדרת-במשרה מלאה זה נתפרו התמזגו יחד ללא צורך בתיקון הצללה 30, ומסגרות זמן לשגות יוצאו כמו JPEG-תמונות של 100% בגודל 95% דחיסה 32. מסגרות זמן לשגות יובאו כרצף תמונה לתוך תוכנת עריכת וידאו מקצועית. מתקרב 100% המפורטים התייצבו, והניגוד הכולל הותאם לטעמו שלנו. The-נסיגות בפעם האחרונה היו לקודדד עם codec H.264 וייצא במיכלים MPEG-4. סרטים מוצגים בקצב מסגרת של 15 מסגרות / שנייה (fps) ו רזולוציה של 1,920 x 1,080 פיקסלים.

איור 2 מציג השוואה בין עובר בתרבות 1 EC (איור 2 א) ושני עוברים בתרבות כריך נייר הסינון השקוע, להיות אחד בצד גחון בתרבית עד (תרשים 2B) ואת הצד אחד הגבה האחר עד (איור 2 ג). כל העוברים היו גיל בהתאמה לשבעה שלב somite (HH9) 15 צלם עם רזולוציה זמנית של 4 דקות (איור 2 א 'וב') או 10 דקות (איור 2 ג). מסגרות נבחרות של 3 במרווחים hr מתוארים. תרבות EC (האיור 2 א) מותר הדמיה יציבה מאוד בשל העובר נח על אגר-חלבון יציב 1,33 תחתון. העובר כולו נשאר במישור אחד מוקדי ברחבי tהוא זמן לשגות כולו. זה יכול להיות מועיל עבור ניסויים קצרים (כמה שעות) ועובר מאוד מוקדם, אבל זה מגיע עם כליאה חזקה של העובר-בכיוון z, ואולי פוגע פיתוח תלת הממדים המוצלח שלה בטווח הארוך. בהתחלה, כליאת ביאה רק השטחה לרוחב קלה של הראש של העובר לעומת עובר בתרבית כריך נייר פילטר השקוע עם צד הגחון שלה עד (השווה איור 2 א ו -2 ב 0 hr). מאוחר יותר, התנועה הסיבובית של ראש נפגמה (איור 2 א - 21 שעות) ואת פעימות הלב האט. זרימת הדם כמעט הפסיק. ראה משלימים סרט 1 בפעם לשגות המלאה של העובר בתרבות EC. הפנל העליון בסרט הזה מציג סקירה מלאה של העובר, בעוד הפנל על השמאלית התחתונה מדמיין את התפתחות הלב ברזולוציה מלאה. פילוח של mesoderm presomitic לתוך somites יכול להיות seen בפירוט בצד הימני התחתון.

עוברים את הכריך נייר פילטר שקוע, מצד שני, היו מוגבלים התרחבות תלת ממדי שלהם רק על ידי המתח הטבעי של הקרומים המקיפים אותם. הם יכולים להיות מתורבתים גם עם הגחון שלהם (התרשים 2B) או הגבה כלפי מעלה (איור 2 ג). כך או כך, את העוברים הראו somitogenesis הרציפה, וראשיהם פנו. הם פתחו כפפו גולגולת צוואר רחם ואת זרימת דם פונקציונלית. שניהם עוברים את כריך נייר פילטר הם צלמו עם התמקדות mesoderm הסגמנטציה, כך חלקים של הראש נע בהדרגה מחוץ לפוקוס כמו העוברים גדלו, מעובים, ומחלים לפנות, ואילו חלק הפילוח של mesoderm נשאר בפוקוס (השווה איור 2B ו 2C ב 21 שעות ל -27 שעות). סרט משלימה 2 מציג את הסרט זמן לשגות מלאה של העובר מתוארבאיור 2B. מרווח ההדמיה היה 4 דקות. הפנל העליון של הסרט הזה מציג סקירה מלאה של העובר. ההתפתחות של העובר הייתה צלמה ברציפות מעל 46 שעות, אך לאחר כ -30 שעות, התמקדות mesoderm הפילוח לאיבוד בשל העיבוי הכולל המפנה של הרקמה העוברית. הפנל השמאלי התחתון מציג את ההתפתחות המוקדמת של הלב ברזולוציה מלאה של מסגרות הזמן לשגות רכש. באמצעות היתוך של primordia הלב לזווג משני צידי קו האמצע, מבנה צינורי ישר כמעט נוצר, אשר לאחר מכן הוא מתחיל להכות וכיפוף ימינה. הפנל הימני התחתון מראה את somites ולאחרונה בנוי והקצה הקדמי של mesoderm presomitic ברזולוציה מלאה ועוקב היווצרות somites החדש לאורך זמן. סרט משלימה 3 מראה אחר העובר תרבותי צילמו בצד הגחון למעלה כריך נייר סינון שקוע. מרווח ההדמיה היה 4 דקות. סרט מכסה הפיתוח הדואר של העובר משלב HH5-6 לכ שלב 15 HH14, על כ 27 שעות של זמן ותרבות. הראש לקפל צורות ומתקדמות בדיעבד. צורות הלב מן primordia הדו-הצדדי, מתחילה לפעום, ומתכופפות ימינה. את somites שלושה כדי ארבעת הראשונים ליצור בו זמנית. somites נוסף יוצא מגוף ברצף מהקצה הקדמי של mesoderm presomitic. הפנל התחתון מראה את אזור הראש של העובר ברזולוציה מלאה, המאפשר התצפית של קפל ראש היווצרות לב מוקדם פירוט גבוה. בשל השקיפות של העובר, סגירת הצינור העצבי ניתן להבחין באזור הראש בעתיד. סרט 4 היווצרות somite מציג משלימה באותה העובר ברזולוציה מלאה לאורך זמן הדמיה מלאה הפאנל התחתון. סרט משלימה 5 מראה את זמן לשגות מלאה של למעלה בצד תרבותי הגבי העובר (איור 2 ג). מרווח ההדמיה היה 10 דקות. בעוד uppאה לוח מציג את התפתחות העובר משבע הבמה somite (HH9) לכ הבמה HH16-17, הפאנל התחתון חתוכה להצגת שינויים מורפולוגיים במוח מוקדם בשלב זה ברזולוציה מלאה. הנפיחות המקומית של הצינור העצבי ניתן לצפות, המוביל אל הממד האזורי של המוח הקדמי, המוח התיכון, ו למוח האחורי, אשר יחלק לחמש אזורי המשנה של המוח העוברי ב בשלבים מאוחרים יותר 13. בנוסף, הצמיחה של השלפוחית ​​האופטית ניתן לראות בבירור. לאחר כ 30 שעות בתרבות, העובר גוסס.

כדי להציג את התאימות של כריך נייר פילטר השקוע עם מניפולציות מייקרו, כמה microbeads פוליסטירן (~ 40 מיקרומטר קוטר) הושתלו לתוך או בקרבת והמזודרם presomitic של עובר עוף בתרבות כריך נייר השקוע המסננת. Microbeads נשטפו PBS להסיר חיץ אחסון implanטד לפני המכסה את מדיום התרבות עם שכבת שמן מינרלי אור (השווה לשלב 2.18 של סעיף הפרוטוקול). פיפטה זכוכית פסטר שמשה להעברת החרוזים אל פני השטח העוברים, בהשגחת הדרך העינית של המיקרוסקופ. חמישה חורים שנוצרו endoderm ידי גירוד אותו בעדינות עם מחט דיקור. כלי מחוייט בצורת J, נוצרו על ידי מתיחה וכיפוף פיפטה פסטר זכוכית בתוך להבה, שמש כדי לתפעל את החרוזים ולדחוף אותם בזהירות לתוך החורים עד שהם הפכו נייחים. שלושה חורים היו מלאים חרוז אחד אחד (איור 3 א - 0 שעה ו 3B *) ושני חורים עם שני חרוזים כל אחת (איור 3 א - 0 hr). מופעים איור 3 א, ב שנבחר מסגרות זמן לשגות, התפתחות העובר חומוס לאחר ההשתלה microsurgical של חרוזים. שלושה חרוזים שולבו בהצלחה לתוך הרקמה במקום הרצוי, ותנועתם הייתה צלמה עלבמהלך הניסוי בפירוט גבוה (איור 3 ב). ההתפתחות של העובר לא נראה כי הוא פגום על ידי מניפולציה או נוכחות של חרוזים. ראה משלימה סרט 6 עבור הסרט זמן לשגות מלא. מרווח ההדמיה היה 4 דקות.

figure-results-2
איור 3: זמן לשגות הדמיה לאחר Microbead השרשה. הוכחה של עיקרון ניסוי מראה את התאימות של כריך נייר פילטר השקוע עם השתלת microbead. ראש העובר נמצא בצד השמאל, אבל זה לא היה צלם במהלך הניסוי הזה. תמונות נרכשו באמצעות תאורה darkfield. (א) נבחר זמן לשגות מסגרות מראה העובר מניפולציות על 3 במרווחים שעות לאחר ההשתלה של שבעה microbeads (~ 40 מיקרומטר קוטר). העובר מוארך ברציפות נוצר somit נוסףes. שלושה חרוזים נראים חובר כראוי ועברו מדיאלית עם זרם הרקמות מעל 18 שעות של התרבות. חרוזי הארבעה אחרים יצאו מחוריהם בין 6 ל 9 שעות של תרבות ונסחפו בדיעבד. (ב) תצוגה מפורטת של שלושת החרוזים היחידים (B1 כדי B3) מושתל לתוך mesoderm presomitic לתחילת הניסוי (0 hr, B *) ואחרי 12 שעות של דגירה (B **). המספר של somites רק יוצרי מותווה (S9 ב * B ו- S18 ב B **). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-3
משלימה סרט 1: EC-תרבות הגחון כלפי מעלה. העובר בתרבות 1 EC, בצד הגחון בתרבית עד, משבע הבמה somite (HH9) 15 ואילך על botto אגר-חלבוןמ 1,33. מרווח ההדמיה היה 4 דקות. השעה ביחס מוצגת בפינה השמאלית העליונה. תמונות באיכות גבוהה יכולות להירכש, כמו העובר היה כלוא בתוך-בכיוון z. אחרי 21 שעות, את פעימות הלב ואת זרימת הדם נעצרו כמעט ואת העובר התחיל להתפורר. הפאנל העליון מציגה סקירה בגודל שונה של העובר, ואילו הפנלים התחתונים לדמיין פיתוח הלב (פאנל משמאל) ופילוח של mesoderm presomitic (פאנל מימין) ברזולוציה מלאה (100% זום). (קליק ימני להוריד).

figure-results-4
סרט משלימה 2: למעלה בצד הגחון סנדוויץ נייר סינון שקוע. העובר בתרבית כריך נייר השקוע משבע במת somite (HH9) 15 ואילך, sid הגחוןדואר פונה כלפי מעלה. מרווח ההדמיה היה 4 דקות. השעה ביחס מוצגת בפינה השמאלית העליונה ב שעה ו דקות, הפעלה מחדש לאחר 24 שעות. הפאנל העליון מציגה סקירה בגודל שונה של התפתחות העובר מעל 46 שעות, בזו אחר זו. הפנל השמאלי התחתון מדמיין פיתוח לב מוקדם במהלך רכישת תמונה 10 השעות של הראשונות ברזולוציה מלאה (100% זום). הפנל הימני התחתון המתארות פילוח mesoderm פני כ 30 שעות של פיתוח ברזולוציה מלאה (100% זום) עד המיקוד הולך לאיבוד בשל עיבוי כולל מפנה של רקמה עוברית. (קליק ימני להוריד).

figure-results-5
סרט משלימה 3: גיבוש מקפלים ראש. עובר תרבותי גחון כלפי מעלה ב כריך נייר פילטר השקוע מן הואאד-תהליך / ראש-פי שלב (HH5-6) 15 לכ בשלב 22-somite (HH14) 15 על בערך 27 שעות של זמן ותרבות. מרווח ההדמיה היה 4 דקות. השעה ביחס מוצגת בפינה השמאלית העליונה H ו דקות, הפעלה מחדש לאחר 24 שעות. הפאנל העליון מציגה סקירה בגודל שונה של התפתחות העובר. הפאנל התחתון מציג את אזור הראש של העובר ברזולוציה מלאה (100% זום). ההיווצרות של קפל הראש והלב מוקדם סגירת הצינור העצבי ניתן לצפות. (קליק ימני להוריד).

figure-results-6
סרט משלימה 4: somitogenesis. עובר תרבותי גחון כלפי מעלה ב כריך נייר פילטר השקוע המשלב חזיתית התהליך / הראש-פי (HH5-6) 15כ בשלב 22-somite (HH14) 15 על בערך 27 שעות של זמן ותרבות. מרווח ההדמיה היה 4 דקות. השעה ביחס מוצגת בפינה השמאלית העליונה H ו דקות, הפעלה מחדש לאחר 24 שעות. הפאנל העליון מציגה סקירה בגודל שונה של התפתחות העובר. הפאנל התחתון מתאר את המזודרם הפרקסיאלית פילוח ברזולוציה מלאה (100% זום). (קליק ימני להוריד).

figure-results-7
סרט משלימה 5: למעלה בצד הגבה סנדוויץ נייר סינון שקוע. עובר הגבה תרבותי כלפי מעלה ב כריך נייר פילטר השקוע משבע במת somite (HH9) 15 לכ במת HH16-17 15. מרווח ההדמיה היה 10 דקות. השעה ביחס מוצגתבפינה השמאלית העליונה ב שעה ו דקות, הפעלה מחדש לאחר 24 שעות. הפאנל העליון מציגה סקירה בגודל שונה של התפתחות העובר. הפאנל התחתון מתאר שינויים מורפולוגיים במוח מוקדם ברזולוציה גבוהה יותר (100% זום). העובר מת לאחר כ -30 שעות בתרבות. (קליק ימני להוריד).

figure-results-8
משלימה סרט 6: microbeads מושתלים. העובר בצד הגחון בתרבית בתוך כריך נייר פילטר מתחת למים במשך כ -19 שעות, החל מהשעה תשע הבמה somite (HH9-10) 15. מרווח ההדמיה היה 4 דקות. השעה ביחס מוצגת בפינה השמאלית העליונה H ו דקות. הפנל העליון מציג סקירה בגודל שונה של אזור הזנב עם שבעה microbeads מושתל לתוך יחסי הציבורmesoderm esomitic. הפאנל התחתון מראה את האזור עם microbeads מושתל ברזולוציה גבוהה יותר (100% זום). (קליק ימני להוריד).

דיון

כתוצאת גרסה חדשה של תרבות 1 והמבוססת EC, כריך נייר פילטר השקוע מקל על רכישת סרטי brightfield ו הזמן לשגות darkfield לטווח ארוך של האקס עובר אפרוח מוקדם אובו ידי ביצוע חממה בטמפרטורה ו-לחות מבוקרות סביב המיקרוסקופ אפשר לוותר עליהן. במקום להיות מתורבת על התחתונה חצי מוצקה אגר-חלבון, העוברים מוחזקים שקועים לחלוטין בתוך מדיום תרבות פשוט המורכבת-מלוח PC ו חלבון רזה. אידוי איבוד חום הם מזעריים על ידי שכבה של שמן מינרלים צפה על גבי המדיום לתרבות. עובר יכול להיות מתורבת בקלות, או הגבו או למעלה בצד גחון, ללא הבדלים גלויים באיכות. כפי שניתן לראות כאן, עוברים את הכריך נייר פילטר שקוע נגישים להתערבויות מיקרו, כמו יישום של חרוזים ספוג מורפוגן. יישומים עתידיים כוללים דימות פלואורסצנטי חיים, microinjections ו electroporation, ואת גן השתקה לאמאnipulate וללמוד מגוון רחב של אירועים המוךפו"גנטי שהולכים במהלך הגחון (למשל, לב somitogenesis מוקדם) ועל גב (למשל, gastrulation מאוחר, סגירת צינור עצבית, והמוח מוקדם) פיתוח. טיפול תרופתי תלוי זמן אינו ריאלי אם צלחת פטרי המכילה את כריך נייר פילטר מוחלפת בתא זלוף, המאפשר החלפת בינוני התרבות מתחת לשכבת שמן מינרלים. כריך נייר פילטר השקוע יפתח פוטנציאל ההדמיה המלא שלה בשילוב עם הדמיה מבוססת ליזר (כוללים מיקרוסקופ אור גיליון) ויעדי טבילה.

כמה קשיים עם הכנת כריך נייר פילטר השקוע יטופלו בפסקאות הבאות. למרות שזה דורש כמות של אימון מתונה בלבד להעביר עובר מן החלמון לתוך כריך נייר פילטר, כמה צעדים עדיין יכולים להשפיע על האיכות עובר באופן משמעותי בתרבות. לפני מוביל נייר סינון הואהניח על החלמון, קרום vitelline סביב העובר צריך להיות משוחרר מכל חלבון עבה. רק אז יהיה הקשר בין נייר הסינון ואת קרום vitelline להיות חזק מספיק כדי לעמוד הכביסה ב-מלוח PC. העיתון המסנן נושא את העובר צריך לחצות את הממשק הנוזל / אוויר כמה שפחות כדי למזער את המתח על ממברנות. לאחר שהובא אל-מלוח PC לשטיפה, המוביל נייר הסינון כולה צריך להישאר שקוע לחלוטין בכל העת. השעה באמבטית PC-מלוח חייבת להיות מוגבלת לכ 30 - 60 שניות, כמו קרום vitelline יתחיל שחרור מעיתון הסינון. ובכל זאת, ניקוי של העובר צריך להיות מוצא להורג באופן יסודי ביותר, כמו שאריות חלמון יהיה מאוחר לטשטש את התצוגה של העובר. במהלך הכביסה, לא להצביע הנחל מן פיפטה העברת ישירות על העובר, אבל תמיד רדיאלית ממנו. לאחר הסרת העובר מן-המלוח PC, הקפד להחזיק את נייר הסינון אופקי כדי למזערמתח על ממברנות העובריים. לאחר מכן, לייצב את העובר עם מוביל נייר הסינון השני. ברגע מוביל נייר הסינון השני מושם, להימנע מיצירת מתח לרוחב, אשר יכול להעביר את נושאי נייר סינון ביחס לזה ולקרוע את הקרומים העובריים. כאשר כריך נייר הסינון מובא לתוך מדיום התרבות, הוא צריך גם לחצות את ממשק האוויר / נוזל רק פעם אחת כדי למזער מתח על ממברנות. הזוג השני של טבעות נירוסטה המשמשות לייצב את כריך נייר פילטר מלמעלה צריך להיות ממוקם מאוד לאט לאט ובלי שום לחץ לצמצם דחיסה של הקרומים העובריים. קרעים קטנים של האזור opaca של העובר בדרך כלל לרפא במהלך השעה הראשונה של תרבות, אבל עובר פגום יכול ותמיד צריך להיות מוחלף על ידי מדגם חדש לפני שכבת שמן הוא pipetted על גבי המדיום לתרבות.

כדי לקלוט תמונה של עובר כולו או דגימות מרובות עבור ברזולוציה גבוהה זמן לשגות סרטים, המיקרופוןroscope חייב להיות מצויד XY-הבמה ממונע, שבשליטת תוכנת מיקרוסקופ. זה הוא בעל חשיבות מכרעת כדי לקבל את מהלך XY הבמה עם מהירות מינימאלית, כדי למנוע פגיעה את העוברים ואת המערבולות במדיום התרבות והשמן, אשר יקטינו את איכות התמונה. לרכישה בסרטי הזמן לשגות שהוצגו כאן, xy-הבמה הממונע עבר עם מהירות של כ 1.75 מ"מ / sec. בעתיד, הדמיה יכולה להשתפר עוד יותר על ידי ההעברה הראשונה בשלב למיקום הרצוי והרכישה את התמונה לאחר תקופת מנוחה קצרה לתת תנודות מערבולות להתפוגג.

כהגבלה, משתמשים פוטנציאליים צריכים להיות מודעים של מרחק העבודה הארוך יחסית (כ 1 סנטימטר) דרושי שיטת התרבות הזאת אם מיקרוסקופ זקוף ללא מטרות טבילה משמש. תוצאות מרחק עבודה זו מהשכבה של בינוניות של שמן מינרלי על גבי העובר. בצלחת 6 ס"מ פטרי, שכבת שמן יש thicknesים של כ 1 - 1.5 מ"מ, ואת העובר הוא שקוע כ 4 מ"מ עמוק בתוך המדיום לתרבות. תלוי בקוטר של המטרה, בקצה העליון של המנה 6 ס"מ פטרי יכול גם להגביל את הגישה העובר. זה אפשר לעקוף באמצעות מנה גדולה יותר.

מרחק העבודה מלמעלה יכול להיות מופחת מעט על ידי מזעור העוביים של השכבות הנוזלות. בנוסף, מרחק העבודה מלמטה יכול להיות ממוזער על ידי הביא את העובר בהמשך לחלק התחתון של צלחת פטרי הקטנת העובי של חלון הזכוכית של הכוס המחוממת. בעוד פרוטוקול מותאם לעבודה עם מיקרוסקופ זום מרחק עבודה ארוך, זקוף, זה יכול להיות מצויד מיקרוסקופ הפוכה גם כן. משתמשים עתידיים צריכים לזכור כי השריית העובר עמוקה מדי במדיום התרבות עלולה להוביל O 2 -diffusion בעיות, למרות מציעים ניסויים ראשוניים כי דיפוזיה מוגבלת לא נראית להיות probלם, כל עוד העובר מוקף מאגר מספיק גדול של מדיום תרבות נייר הסינון הדחוק לא נלחץ אל החלק התחתון של צלחת פטרי.

מגבלה נוספת היא בקרת הטמפרטורה. על ידי התאמת הטמפרטורה של הבקר עבור הכוס המחוממת ל -40 מעלות צלזיוס, הטמפרטורה בטווח הבינוני equilibrates 37.5 ° C ברחבי עובר כאשר המדיום מכוסה שמן מינרלים. זה מראה כי כמה אנרגיה הולכת לאיבוד בין החלק התחתון של הכוס, שבו גופי החימום ואת חיישן הטמפרטורה ממוקמות, ואת המיקום של העוברים. בקרת הטמפרטורה יכולה להיות מותאמת על ידי העברת חיישן הפיזור מחדש של גופי החימום.

גילויים

החוקרים אין לי מה לחשוף.

תודות

המחברים מודים תמיכה כספית ממענק ZonMW-Vici 918.11.635 (הולנד). המחברים מבקשים להודות חנות כלי של אמסטרדם Vrije Universiteit לעצות מעשיות שלהם לייצור הרכיבים להתקנה Jarno Voortman של Carl Zeiss הולנד עבור עצות מועילות על מיקרוסקופיה. Marjolein Blaauboer היה תמיכה גדולה עוד להתייחס באופן ביקורתי על מספר טיוטות של כתב היד.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מילי-Q  מערכת טיהור מים התייחסותMilliporeZ00QSV0WW 
דוראן  בקבוקי מעבדה, עם פקקים, 1 ליטרסיגמא-אולדריץ'/דוראןZ305200-10EA 
nameCompanyCatalog numberComments
>Solution A
NaClMerck Millipore1064041000
KClMerck Millipore1049361000
CaCl2· H2OMerck Millipore1023821000
MgCl2· 6H2OMerck/Sigma-Aldrich13152-1KG-D 
nameCompanyCatalog NumberComments
פתרון B
Na2HPO4· 2H2OMerck1065801000
NaH2PO4· 2H2OMerck1063420250
NameCompanyCatalog NumberComments
Whatman, Grade 595Sigma-Aldrich10311611
מכונת חיתוך לייזר MLS-90120-C130, CO2-laser, 130  W, אורך גל 10.6  ומיקרו; mMicro Lasersystems
Tork רקמות פנים רכות במיוחדTork140280
כפפות לטקססיגמא-אולדריץ'Z645613
EMDAMEDEMDA 300.131
פיפטות העברהסיגמא-אולדריץ'Z350613
VWRWITG5.480.003
Accu-jet pro פיפטה בקרBrandTech Scientific26332
פיפטות פלסטיק סרולוגיות, 25  מ"לסיגמא-אולדריץ'CLS4251
שרוולי
חממת ביצים - מוד חממה. Cip Cip 40Fiem
ביצי עוף מופרות (Gallus gallus)Drost BV (Loosdrecht, NL)
10 ס"מ כלי תרבית רקמותSigma-AldrichP5731
Greiner Bio-one664160
6 ס"מ צלחות פטריSigma-AldrichP5481
50 מ"ל צינורות צנטריפוגה, צינורות צנטריפוגה גריינר או צינורות Cellstarסיגמא-אולדריץ'T2318
גריינר ביו-אחד227261
<חזק>שם<חזק>חברה><חזק>מספר קטלוגי><חזק>הערות
<חזק>טבעות נירוסטה, בהתאמה אישית
טבעות גדולות, קוטר חיצוני 30 מ"מ, גובה 4 מ"מ, עובי
טבעות קטנות, קוטר חיצוני 20 מ"מ, גובה 4 מ"מ, עובי דופן 1.5 מ"מ, רווח 6.5 מ"מ בטבעת
מלקחיים מספריים
, Dumont #5, InoxFine Science Tools , FST11251-20
מספריים עדינים וחדים באמת לחיתוך נייר סינוןVWR21-102
M3516  שמן מינרלי Sigma-AldrichSigma-Aldrich  8042-47-5
NameCompanyCatalog NumberComments
>Agar bottoms for EC culture
AgaroseSigma-AldrichA9539  SIGMA
NaClSigma-AldrichS7653  SIGMA-ALDRICH
strong>שםCompany<>strong>Catalog NumberComments
>Microbead Implantation
Polybead Sampler Kit III (45 & נעשה שימוש בחרוזים m)Polysciences, Inc.16905-1
מחטי דיקור: סוג J, מס' 02, 0.12x30  מ"מסירין  סוג J, מס' 02, 0.12x30 מ"מ
PBS, pH 7.4תרמו פישר סיינטיפיק10010023 
<חזק>שם<חזק>חברה<חזק>מספר קטלוגי<חזק>הערות
<חזק>מבוקרת טמפרטורה
RTD חיישן טמפרטורה עם M4 הברגה דיור RTD-850MאומגהRTD-850M
אטום הרמטית RTD חיישנים HSRTD-3-100-A-3MאומגהHSRTD-3-100-A-1M
תרמיסטור וחוט מאריך RTD EXTT-3CU-26S-50אומגהEXTT-3CU-26S-50
מיני מחברים 3 פינים לצמדים תרמיים, 3 חוטים RTD ותרמיסטורים MTP-U-MאומגהMTP-U-M
Kapton (סרט פולימיד) תנורי חימום גמישים מבודדים KHLV-103/(10)-PאומגהKHLV-103/(10)-P
בקר טמפרטורה/תהליך CNi16D24-C4EIT-DCאומגהCNi16D24-C4EIT-DC
אלומיניום בהתאמה אישית, מבודדת עם פוליאצטל (שרטוטים ראה גיליון 2)
<חזק>שם<חזק>חברה<חזק>מספר קטלוגי<חזק>הערות
><חזק>הגדרת מיקרוסקופ
Axio Zoom.V16 עם ApoTome.2 ZENCarl Zeiss AG495010-0009-000
Objective PlanNeoFluar Z 1.0X/0.25 FWD 56  מ"מCarl Zeiss AG435281-9100-000
בקרה סיבובית ידנית MARCCarl Zeiss AG435604-0000-000
Transillumination top 450 motCarl Zeiss AG435500-9000-000
שלב מדידה ממונע S 150x100 mot; CAN (D)Carl Zeiss AG435465-9020-000
לוחית הכנסה S, זכוכית 237x157x3  מ"מ (D)Carl Zeiss AG435465-9053-000
בקר EMS 3Carl Zeiss AG435610-9010-000
לוח בקרת מערכת SYCOP 3Carl Zeiss AG435611-9010-000
Hamamatsu ORCA Flash 4.0 מצלמהHamamatsuC11440-22CU
מיקרוסקופיה תחנת עבודה מתקדמת Xeon ארבע ליבות רב-לשוניתCarl Zeiss AG490004-0025-000
חבילת שפה Windows 7 x64 אנגלית אולטימטיבית ארה"ב Carl Zeiss AG410373-0200-000
צג LCD TFT צג HP ZR2440w 24 אינץ'Carl Zeiss AG410350-2403-000אינו זמין עוד ZEN
pro 2012 מפתח רישיון חומרהCarl Zeiss AG410135-1002-120אינו זמין עוד
מנהל התקן תוכנה ZEN מצלמות Hamamatsu מפתח רישיון חומרהCarl Zeiss AG410136-1045-110
מודול ZEN מחסנית ZCarl Zeiss AG410136-0030-110
אריחים/מיקומים של מודול ZENCarl Zeiss AG410136-1025-110
מודול ZEN Time LapseCarl Zeiss AG410136-1031-110
מעצב ניסוי מודול ZEN CarlZeiss AG410136-1022-110
ZEN Desk 2012 מפתח רישיון חומרהCarl Zeiss AG410135-1004-120אינו זמין עוד
מסמך מפלסטיקדופן 1.5 מ"מלציפורניים מספר CAS של <

מקורות

  1. Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier. Dev. Dyn. 220 (3), 284-289 (2001).
  2. Rozbicki, E., et al. Myosin-II-mediated cell shape changes and cell intercalation contribute to primitive streak formation. Nat. Cell Biol. 17 (4), 397-408 (2015).
  3. Smith, J. L., Schoenwolf, G. C. Neurulation: Coming to closure. Trends Neurosci. 20 (97), 510-517 (1997).
  4. Schoenwolf, G. C., Sheard, P. Shaping and bending of the avian neural plate as analysed with a fluorescent-histochemical marker. Development. 105 (1), 17-25 (1989).
  5. Colas, J. F., Schoenwolf, G. C. Towards a cellular and molecular understanding of neurulation. Dev. Dyn. 221 (2), 117-145 (2001).
  6. Pourquié, O. The chick embryo: a leading model in somitogenesis studies. Mech. Dev. 121 (9), 1069-1079 (2004).
  7. Maenner, J. Cardiac looping in the chick embryo: A morphological review with special reference to terminological and biomechanical aspects of the looping process. Anat. Rec. 259 (3), 248-262 (2000).
  8. Wittig, J. G., Münsterberg, A. The Early Stages of Heart Development Insights from Chicken Embryos. J. Cardiovasc. Dev. Dis. 3 (2), (2016).
  9. Layer, P. G., Alber, R. Patterning of chick brain vesicles as revealed by peanut agglutinin and cholinesterases. Development. 109 (3), 613-624 (1990).
  10. Nakamura, H., Nakano, K. E., Igawa, H. H., Takagi, S., Fujisawa, H. Plasticity and rigidity of differentiation of brain vesicles studied in quail-chick chimeras. Cell Differ. 19 (3), 187-193 (1986).
  11. Garcia-Lopez, R., Pombero, A., Martinez, S. Fate map of the chick embryo neural tube. Dev. Growth Differ. 51 (3), 145-165 (2009).
  12. Andermatt, I., Stoeckli, E. T. RNAi-based gene silencing in chicken brain development. Methods Mol. Biol. 1082, 253-266 (2014).
  13. Tufan, A. C., Akdogan, I., Adiguzel, E. Shell-less culture of the chick embryo as a model system in the study of developmental neurobiology. Neuroanatomy. 3 (1), 8-11 (2004).
  14. Endo, Y. Chick embryo culture and electroporation. Curr. Protoc. Cell Biol. , Unit 19.15(2012).
  15. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88 (1), 49-92 (1951).
  16. Kulesa, P. M., Bailey, C. M., Cooper, C., Fraser, S. E. In Ovo Live Imaging of Avian Embryos. Cold Spring Harb. Protoc. 2010 (6), (2010).
  17. Borwompinyo, S., Brake, J., Mozdziak, P. E., Petitte, J. N. Culture of chicken embryos in surrogate eggshells. Poult Sci. 84 (9), 1477-1482 (2005).
  18. Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications. J. Vis. Exp. (44), e2154(2010).
  19. Auerbach, R., Folkman, J. A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos. Dev. Biol. 41 (2), 391-394 (1974).
  20. New, D. A. T. A New Technique for the Cultivation of the Chick Embryo in vitro. J. Embryol. Exp. Morphol. 3 (4), 320-331 (1955).
  21. Stern, C. D., Bachvarova, R. Early chick embryos in vitro. Int. J. Dev. Biol. 41 (2), 379-387 (1997).
  22. Nagai, H., Lin, M. C., Sheng, G. A modified cornish pasty method for ex ovo culture of the chick embryo. Genesis. 49 (1), 46-52 (2011).
  23. Connolly, D., McNaugbton, L. A., Krumlauf, R., Cooke, J. Improved in vitro development of the chick embryo using roller-tube culture. Trends Genet. 11 (7), 259-260 (1995).
  24. Rupp, P. A., Rongish, B. J., Czirok, A., Little, C. D. Culturing of avian embryos for time-lapse imaging. Biotechniques. 34 (2), 274-278 (2003).
  25. Martins, G. G., Rifes, P., Amaândio, R., Rodrigues, G., Palmeirim, I., Thorsteinsdóttir, S. Dynamic 3D cell rearrangements guided by a fibronectin matrix underlie somitogenesis. PLoS One. 4 (10), e7429(2009).
  26. Nagai, H., Sezaki, M., Nakamura, H., Sheng, G. Extending the limits of avian embryo culture with the modified Cornish pasty and whole-embryo transplantation methods. Methods. 66 (3), 441-446 (2014).
  27. Pannett, C., Compton, A. The Cultivation of Tissues in Saline Embryonic Juice. Lancet. 203 (5243), 381-384 (1924).
  28. Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos. Nat. Protoc. 3 (3), 419-426 (2008).
  29. Carl Zeiss Microscopy. GmbH Software Guide ZEN 2 - The Tiles & Positions Module. , Available from: http://applications.zeiss.com/C125792900358A3F/0/9943124DA6FFBA5DC1257E9300412F8B/$FILE/ZEN2_Tiles_and_Positions_Module_Software_Guide.pdf (2015).
  30. Carl Zeiss Microscopy. GmbH ZEN 2 - (blue edition) - Software Guide. , V1.0 en, Available from: https://www.unige.ch/medecine/bioimaging/files/3914/3765/2064/ZEN_2_blue_edition_-_Software_Guide.pdf (2014).
  31. Carl Zeiss Microscopy. GmbH Quick Guide ZEN 2 - Acquiring multidimensional images. , Available from: http://applications.zeiss.com/C125792900358A3F/0/5D9162DBD5AF85DDC1257E35005A68A6/$FILE/ZEN_2-Acquiring_multidimensional_images.pdf (2014).
  32. Carl Zeiss Microscopy. GmbH Quick Guide ZEN 2 - Importing and exporting images. , Available from: http://applications.zeiss.com/C125792900358A3F/0/CF6F8A3FE82E5870C1257E35005AF3E9/$FILE/ZEN_2-Importing_and_exporting_images.pdf (2014).
  33. Darnell, D. K., Schoenwolf, G. C. Culture of Avian Embryos. Dev. Biol. Protoc. Vol. I. 135, 31-38 (2000).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

עוברי אפלוח Ex Ovoתרבית טבולהכיסוי בשמן מינרלימקלח בבקרה תרמיתמיקרוסקופיה של אוראירועים מורפוגנטייםגסטריולציהנורולציהסומיטוגנזההתפתחות הלב
כריך נייר מסנן מתחת למים במשך לטווח ארוך אקס אובו זמן לשגות הדמיה של מוקדם צ'יק עובר
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.