מאמר שיטה

מיון תא מופעל קרינה עבור טיהור של תאי דנדריטים Plasmacytoid ממח עצם העכבר

DOI:

10.3791/54641

⸱

4 בנובמבר 2016

 ,  , 
1Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine, Virginia Polytechnic Institute and State University, 2Flow Cytometry Laboratory, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine, Virginia Polytechnic Institute and State University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מדווחים פרוטוקול באמצעות תא קרינת מיון מופעל לבודד תאי דנדריטים plasmacytoid (PDC) עם טוהר גבוה ממח העצם של עכברי זאבת נוטה ללימודי תפקודיים של PDC.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיון תאים מופעל פלואורסצנטי (FACS) היא טכניקה לטיהור אוכלוסיות תאים ספציפיות על סמך פנוטיפים שזוהו על ידי ציטומטריית זרימה. שיטה זו מאפשרת לחוקרים להבין טוב יותר את המאפיינים של אוכלוסיית תאים בודדים ללא השפעה של תאים אחרים. בהשוואה לשיטות אחרות להעשרת תאים, כגון מיון תאים מופעל מגנטי (MCS), FACS גמיש ומדויק יותר להפרדת תאים בשל היכולת לזהות פנוטיפ על ידי ציטומטריית זרימה. בנוסף, FACS מסוגל בדרך כלל להפריד אוכלוסיות תאים מרובות בו זמנית, מה שמשפר את היעילות והגיוון של הניסויים. למרות של-FACS יש כמה מגבלות, הוא שימש באופן נרחב לטיהור תאים למחקרים פונקציונליים הן במבחנה והן ב-vivo. כאן אנו מדווחים על פרוטוקול המשתמש במיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות כדי לבודד אוכלוסייה נדירה מאוד של תאים חיסוניים, תאים דנדריטיים פלסמציטואידים (pDC), עם טוהר גבוה ממח העצם של עכברים המועדים לזאבת למחקרים פונקציונליים במבחנה של pDC.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרדה יעילה של אוכלוסיית תאים לבחירה מתאים אחרים מאפשרת מחקרים על האוכלוסייה שאולי לא היו אפשריים אחרת. מיון תאים מופעל פלואורסצנטי (FACS) הוא שיטה להעשרת אוכלוסיית תאים מעניינת בטוהר גבוה. 1,2 סוגי תאים שונים מבטאים בדרך כלל מולקולות ייחודיות, או שילוב ייחודי של מספר מולקולות, על קרום הפלזמה שיכול להבחין בין אוכלוסיית תאים אחת לאחרת. עם קשירה של מולקולות פני התא הללו על ידי נוגדנים מצומדים פלואורסצנטיים ספציפיים, מכונת זיהוי הנקראת ציטומטר/ממיין זרימה מסוגלת לעורר ולזהות את אותות האור של צבעים פלואורסצנטיים שונים המייצגים סמני מולקולות שונים על התאים ברמת התא הבודד. המידע המשולב המורכב מנוכחות של אות אור (המייצג ביטוי חיובי של מולקולת פני השטח המתאימה) או היעדר אות אור (המייצג ביטוי שלילי של מולקולה) מגדיר את הפנוטיפ של התא. לאחר המעבר דרך הגלאי, תאים עם אותו פנוטיפ מעניין מופנים לעבר צינור איסוף ייעודי המבוסס על מטען חשמלי.

FACS מיושם באופן נרחב במחקרים שונים כל עוד האוכלוסייה להעשרה מסומנת בפלואורסצנטיות. 3-7 הוא שימש להפרדת חיידקים מצופים אימונוגלובולין (Ig)A מחיידקים שאינם מצופים IgA במיקרוביוטה של המעי 8 ולמיון אוכלוסיות תאים מהונדסות גנטית המבטאות חלבונים פלואורסצנטיים. 9 חשוב לציין, יש לו את היכולת להפריד יותר מאוכלוסייה אחת בו זמנית, מה שלא רק חוסך זמן וריאגנטים אלא גם מאפשר עיצובי מחקר מתוחכמים יותר. 10 עם זאת, ל-FACS יש גם מגבלות. אם אוכלוסייה מעניינת נדירה מאוד (פחות מ-1%), יעילות המיון עלולה להיות מופחתת, ולגרום לאובדן תאים משמעותי. בנוסף, קשירת נוגדנים מסוימת עשויה להפעיל העברת אותות תוך תאית הגורמת לשינויים תפקודיים של אוכלוסיית התאים הממוינים. 11 לכן, יש לבחור בקפידה את הפנוטיפ המשמש למיון.

קיימות שיטות אחרות מלבד FACS המבוססות גם הן על סמני פני התא להעשרה של אוכלוסיות תאים ספציפיות, כגון מיון תאים מופעל מגנטית (MCS). 12 בדומה ל-FACS, נוגדנים מצומדים לחרוזים מגנטיים יכולים לכוון למולקולות ספציפיות על פני התא. באינטראקציה של נוגדן-אנטיגן, ניתן להפריד תאים מצופים חרוזים מגנטיים מתאים שאינם מצופים לאחר שעברו דרך שדה מגנטי. עם זאת, ניתן למקד רק מספר מוגבל של מולקולות ב-MCS, מכיוון שחרוזים מגנטיים, בניגוד לצבעים פלואורסצנטיים שונים ב-FACS, אינם ניתנים להבחנה. לכן קשה ל-MCS להגדיר פנוטיפ תא עם שילוב מסובך של סמני פני השטח. 13,14 בנוסף, MCS מסוגל גם לגרום להפעלה לא מכוונת של תאי מטרה.

במחקר שלנו על מודל עכבר של זאבת אדמנתית מערכתית (SLE), 15 התכוונו לטהר תאים דנדריטיים של פלסמציטואיד (pDC) כדי לחקור את השינויים התפקודיים שלהם עם התקדמות המחלה. השתמשנו לראשונה ב-MCS כדי להעשיר pDC ממח העצם על ידי התמקדות ב-PDCA-1, מולקולה המתבטאת באופן גבוה וייחודי ב-pDC של עכברים במצב יציב. 16 עם זאת, טוהר התאים היה נמוך באופן בלתי צפוי, ככל הנראה בשל הוויסות המוגבר של PDCA-1 על אוכלוסיות תאים אחרות בסביבה דלקתית כמו זאבת. 16 בסופו של דבר, השתמשנו ב-FACS עם שילוב של ארבעה סמני משטח (CD11c, CD11b, B220 ו-PDCA-1) כדי להפריד pDC בטוהר גבוה כאוכלוסיית CD11c+CD11b-B220+PDCA-1+. לעכברים pDC יש סמן משטח ספציפי נוסף: Siglec-H. החלטנו לא להשתמש ב-Siglec-H, מכיוון שקשירת נוגדנים של מולקולה זו מדכאת את התפקוד של pDC לייצר IFNα. 11

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: MRL / MP-פאס LPR (MRL / LPR) עכברים נוטה זאבת גידלו ומתוחזק מתקן הפתוגן ללא הספציפיים הבאים בדרישות של טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש (IACUC) וירג'יניה טק (מספר אבטחת צער בעלי חיים: A3208-01). מחקר זה בוצע בהתאם קפדן עם המלצות המדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה של המכון הלאומי לבריאות בארה"ב. כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו תחת פרוטוקול IACUC # 12-062.

1. תא תרבות בינונית הצפת המיון

  1. כן בינוני תרבית תאים מלא (C10) באמצעות RPMI 1640 בתוספת 10% בסרום שור עוברי, פירובט סודיום 1 מ"מ, 1% 100 ממ חומצות אמינו לא חיוניים, 10 HEPES מ"מ, 55 מיקרומטר 2-mercaptoethanol, 2 מ"מ L- גלוטמין ו 100 U / ml פניצילין, סטרפטומיצין.
  2. הכן חיץ מיון (HBSS-מלא) באמצעות תמיסת מלח מאוזן של 1x האנק (HBSS) השלימו עם 10 HEPES מ"מ, 2.5 מ"ג / מ"ל ​​אלבומין בסרום שור,0.05 מ"מ MgCl 2 ו 0.2 U / ml I. DNase

2. עכבר Dissection

  1. הכינו שתי מנות בקוטר 6 ס"מ המכיל 4 מ"ל C10. מניחים את הכלים על קרח.
  2. להרדים את העכבר משאיפת CO 2.
  3. קציר את הטחול ולשמור אותו בצלחת עם C10 על הקרח.
    1. הצמד את העכבר למטה עם הבטן כלפי מעלה על הצלחת הניתוח. לעקר את הגוף על ידי ריסוס אתנול 70%.
    2. חותך את העור להפריד את העור מקיר השריר מתחת לאורך קו אמצע הגחון מן מאחת הערווה עד הצוואר.
    3. חותך את העור לאורך הגפיים האחוריים מן החתך הראשון עד הקרסול.
    4. הצמד את העור לאחור בצדדים וחתך את קיר השרירים בצדי מהמקום החתך הראשון ממברנות.
    5. הצמד את קיר שרירי הגב בצד ימין של הראש.
    6. אתר את הטחול בצד הימני של העכבר מתחת המעי הדק ליד הקיבה. תרים קצה אחד של הטחול הדואר ולהפריד אותו מהבטן.
  4. חותכים שתי הגפיים האחוריות החוצה, כולל עצם הירך לבין השוקה, ולהסיר את כל השרירים ככל האפשר.
    1. חותך את השרירים לאורך הגפיים האחוריים מהג'וינט האגן / הירך עד הקרסול עם מספריים חדים, מנסה להימנע כלי דם.
    2. הפרד את הגפיים האחוריים בגזירה במפרק האגן / ירך מפרק קרסול / רגל ללא חשיפת תוכן מח עצם.
    3. שרירים הנותרים נקיים על העצמות על ידי גירוד עם סכין גילוח שוב ושוב וחיתוך השרירים בנקודות המשותפות.
  5. שמור את עצמות בצלחת 6 ס"מ המכיל 4 C10 מ"ל על הקרח. המשך ביתור העכבר הבא.

3. בידוד Splenocyte

  1. Homogenize הטחול בעדינות עם בוכנת מזרק נגד מסננת תא 70 מיקרומטר על גבי הצלחת ובה C10 4 מיליליטר עד שלא חתיכות אדומות נראות.
  2. להוסיף C10 נוסף 6 מ"ל לתוך צלחת דרך מסננתnd מכן להעביר את ההשעיה תא הכולל 10 מ"ל צינור חרוטי 15 מ"ל.
  3. צנטריפוגה צינור החרוטים ב 800 XG במשך 5 דקות, 4 ° C.
  4. לאחר צנטריפוגה, לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה ב 2 מ"ל 1 x תאי דם אדומים (RBC) חיץ תמוגה. לדגור על RT במשך 5 דקות.
  5. לאחר דגירה, צנטריפוגות צינור החרוטים ב 800 XG במשך 5 דקות, 4 ° C.
  6. לאחר צנטריפוגה, לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה ב 1 C10 מ"ל. לבטל את כל גושים גדולים (תאים מתים) ולשמור את הצינור על קרח למשך מאוחר יותר.
    הערה: אם יש הרבה גושים קטנים, להשתמש מסננת תא 70 מיקרומטר לסנן את ההשעיה תא פעם.
  7. לספור את המספר הסלולרי עם trypan הכחול באמצעות דלפק תא אוטומטי.

4. בידוד תא מח עצם

  1. מעבירים את העצמות עם 4 מ"ל C10 לתוך מרגמה ולהוסיף 6 C10 מ"ל לעשות נפח של 10 מ"ל C10 בסך הכל.
  2. לפצח את העצמות בעדינות המרגמה באמצעות apestle.
  3. מערבבים בעדינות עם העלי כדי לשחרר את מח העצם לתוך C10.
  4. מעבירים את C10 10 מ"ל המכיל מח עצם לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל על הקרח דרך מסננת תא 70 מיקרומטר. להוסיף C10 10 מ"ל טריים אל תוך המדוכה עדיין המכיל את העצמות.
    הערה: פיפטה הפתרון המכיל עד עצם מח ומטה מספר פעמים לפני שהם מעבירים דרך מסננים אם גושים אדומים גלויים.
  5. חזור על שלבי 4.2 עד 4.4 פעמים. לאחר לשטוף האחרון, העצמות אמורות להופיע לבן.
  6. צנטריפוגה צינור חרוטי 50 מ"ל ב 800 XG במשך 5 דקות, 4 ° C. בינתיים מכינים 5 מ"ל מוכן לשימוש בינוני שיפוע צפיפות בתוך שפופרת צנטריפוגות חרוטי 15 מ"ל ב RT.
  7. לאחר צנטריפוגה, לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה ב 10 C10 מ"ל.
  8. לאט שכבת השעית התא 10 מיליליטר על גבי מדיום שיפוע צפיפות 5 מיליליטר, שמירת ממשק ברור בין שני השלבים. ואז צנטריפוגות צינור חרוטי 15 מ"ל ב 1,363 גרם במשך 30 דקות בRT (20 מעלות צלזיוס) עם סט אץ כמו 9 האטה להגדיר כמו 0 (או הבלם OFF).
  9. לאחר צנטריפוגה, להסיר את הפתרון העליון 8 מ"ל בזהירות ולאסוף את המעיל 2 מ"ל באפי על הממשק (שכבה של תאים mononuclear) לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל חדש.
  10. להוסיף 12 C10 מ"ל קרח קר עד 15 מ"ל צינור חרוטי המכיל תאים mononuclear מח עצם, כובע ו להפוך כמה פעמים כדי לערבב היטב, אז צנטריפוגות צינור ב 800 XG במשך 10 דקות, 4 ° C.

5. מכתים פני התא עבור FACS

  1. מכתים לדוגמא
    1. כן פתרון נוגדן אנטי עכבר CD16 / 32 (1 דילול 100 HBSS-מלא, 5 מיקרוגרם / מיליליטר ריכוז סופי).
    2. לאחר צנטריפוגה בשלב 4.10, לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה ב 100 פתרון נוגדנים μl אנטי עכבר CD16 / 32 לחסום קולטני Fc על תאים mononuclear. דגירה על קרח למשך 10 דקות.
    3. הכן תערובת נוגדנים הקרינה מצומדות (נמלהi-עכבר CD11c-PE 01:40 דילול, אנטי עכבר CD11b-APC-Cy7 1:80 דילול, אנטי עכבר PDCA-1-FITC 1:40 דילול אנטי עכבר B220-V500 01:40 דילול HBSS- מלא כפי המומלץ על ידי היצרן ב 100 נפח סופי μl לדגימה).
      הערה: חשוב לכייל נוגדנים לפני השימוש.
    4. לאחר 10 דקות הדגירה בשלב 5.1.2, להוסיף 4 מ"ל קרח קר HBSS מלא צנטריפוגות ב 800 XG במשך 5 דקות, 4 ° C כדי להסיר מאוגד אנטי עכבר CD16 / 32.
    5. לאחר צנטריפוגה, לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה ב 100 תערובת נוגדנים μl הקרינה מצומדות. דגירה על קרח למשך 15 דקות בחושך.
    6. לאחר 15 דקות דגירה, להוסיף 4 מיליליטר קרח קר HBSS מלא צנטריפוגות ב 800 XG במשך 5 דקות, 4 ° C כדי להסיר נוגדני קרינת מצומדות מאוגדים.
    7. כן פתרון טעינת FACS (500 ng / ml DAPI ב HBSS-מלא).
    8. לאחר צנטריפוגה בשלב 5.1.6, לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה ב 500 μ; L FACS פתרון הטעינה. מעביר את השעית התא לתוך (צינור FACS) צינור תחתי עגול 12 x 75 מ"מ ולשמור את הצינור על קרח בחושך עד מיון בתוך השעה 1.
  2. מכתים לפיצוי
    1. צינורות לייבל 6 FACS PE, APC-Cy7, FITC, V500, DAPI או בלא כתם. Splenocytes Aliquot ב 1 x 10 6 תאים / צינור לתוך צינורות FACS, ולשטוף עם 4 מ"ל HBSS מלא ב 800 XG במשך 5 דקות, 4 ° C..
      הערה: השתמש DNA מחייבת הקרינה לצבוע, DAPI, להבחין בין תאים חיים מן התאים המתים. DAPI יכולים לעבור דרך קרום התא של תאים מתים (אבל לא של תאים חיים) ו- DNA כרומוזום לאגד.
    2. לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה ב 100 μl HBSS-מלא.
    3. בכל צינור FACS המתאים, להוסיף אחד נוגדנים הבאים: אנטי עכבר CD19-PE 01:40 דילול, אנטי עכבר CD11b-APC-Cy7 1:80 דילול, אנטי עכבר PDCA-1-FITC 1:40 דילול או B220-V500 01:40 דילול אנטי עכבר כפי שהומלץ על ידי manufacturer. השאירו את ה -5 (DAPI) ו -6 (בלא כתם) FACS צינורות כפי שהם. מערבבים היטב על ידי רועדת דגירה כל צינורות FACS על הקרח בחושך במשך 15 דקות.
    4. לאחר דגירה, להוסיף 4 מ"ל קרח קר HBSS מלא לתוך צינור כל צנטריפוגות צינורות FACS ב 800 XG במשך 5 דקות, 4 ° C.
    5. לאחר צנטריפוגה, לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה ב 500 קרח μl HBSS קר-מלא למעט גלולה בצינור שכותרתו DAPI, אשר resuspended ב 500 μl FACS פתרון הטעינה. שמירה על כל 6 צינורות על הקרח בחושך עד מיון.

6. מיון על הסדרן הנייד

הערה: מבצע של מיון הליך על cytometer והתוכנה טופל עם הדרכה מפורטת המסופקת על ידי החברה. בקצרה, אנו משתמשים 100 זרבובית מיקרון ב 20 psi, ריכוז תא היעד שנקבע בין 5 - 10 מיליון דולר מ"ל, ולהתאים יעילות עד 70% ומעלה (כלומר, סכסוכים הזמן תחת 30%).

  1. הכן צינורות אוסף FACS עם 500 μl FBS / צינור המכיל 100 U / ml פניצילין, סטרפטומיצין.
  2. להתאים את הפרמטרים פיצוי של סדרן התא באמצעות צינורות פיצוי חד כתם משלב 5.2.
    1. קלט 10,000 תאי צינור בלא כתם להגדיר שער שלילי עבור כל עוצמת פלורסנט.
    2. קלט 10,000 תאי צינורות פיצוי חד כתם אחרים כדי להגדיר שער חיובי עבור כל עוצמת פלורסנט.
      הערה: התוכנה מחשבת את הפרמטרים פיצוי אוטומטי.
  3. השתמש מדגם אחד משלב 5.1 כדי להגדיר את השערים של אוכלוסיות תאים ממוינות על ידי הקלטת 3,000 תאים. באמצעות עוצמת פלורסנט כפרמטרים של X ו- גרף ציר Y, ​​אוכלוסיית תאי יעד השער באופן ידני כקבוצה של נקודות כנראה מופרדות נקודות אחרות.
    הערה: סט gating זהו גמיש שרירותי המבוסס על הדרישות של חוקרים. אם החוקרים מצפים טוהר גבוה יותר על בסיס סמנים אחד או יותר, להזיז את השערגבוה יותר על בסיס עוצמת ניאון המקביל.
  4. טען צינור איסוף ולהתחיל למיין את אוכלוסיית תא המטרה.
  5. שמור את צינור איסוף על הקרח לאחר מיון עד שכל דוגמיות נעשים.
  6. להוסיף C10 קר קרח על צינור איסוף עד 4 מ"ל, כובע להפוך לערבב.
  7. צנטריפוגה צינור האיסוף ב 800 XG במשך 5 דקות, 4 ° C, ולאחר מכן לשאוב supernatant, יוצא בסביבות 200 μl עם תא גלול ללא פגע.
  8. להוסיף C10 קר קרח 1 מ"ל ל resuspend התא גלולה ולהעביר את כל השעיה התא לתוך צינור 1.5 מ"ל צנטריפוגות.
  9. צנטריפוגה צינור 1.5 מ"ל ב 800 XG במשך 5 דקות, 4 ° C ו לשאוב supernatant, עוזב 100 μl עם תא גלולה ללא פגע.
  10. אחסן את אוכלוסיות תאים ממוינים על הקרח עד לשימוש.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

החוקרים בקשו להעשיר מח עצם PDC עם טוהר גבוה, וללא השפעת סוגי תאים אחרים, מן MRL / LPR נוטה זאבת עכברי שניהם בגיל צעיר ומבוגרים ללמוד את השינויים התפקודיים של PDC באשר ליכולתם לייצר IFNα. אסטרטגית הטיהור הראשונה השתמשה הייתה MCS, אשר, כפי שמראה איור 1, הוביל רק 7.75 טוהר% לאחר העשרה. לעומת MCS, FACS מועשר PDC עם טוהר גבוה ככל 96.4%. כדי להבטיח טוהר גבוהה, אסטרטגיה gating צעד-אחר-צעד בוצע. כפי שניתן לראות בתרשים 2, ת...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול המתואר בכתב יד זה מיועד להעשרה בטוהר גבוה של pDC חי השומר על היכולת לייצר IFNα. היישומים של פרוטוקול זה כוללים, אך אינם מוגבלים לטיהור של pDC ו/או כל תא חד-גרעיני אחר ממח העצם של MRL/LPR וכל זני עכבר אחרים לחקר תפקודים תאיים ומולקולריים. מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול זה הם להבטיח כדאיות וטוהר גבוהים של ה-pDC הממוין. שלב המפתח הראשון הוא שחרור מח עצם מהעצמות. כדי למזער פגיעה בתאי מח העצם, חשוב לפצח בעדינות את העצמות ולערבב את העלי במקום לרסק את העצמות. שלב המפתח השני הוא העשרת תאים חד-גרעיניים עם מדיום שיפוע צפיפ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים בנוגע לפרסום מאמר זה.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים למעבדת ציטומטריית זרימה במכללת וירג'יניה-מרילנד לרפואה וטרינרית על השימוש במתקן הליבה של זרימה ציטומטרית. עבודה זו נתמכה על ידי קרנות הסטארט-אפ של XML. XL הוא עמית בולים בתוכנית לתואר שני במדעי הביו-רפואה והווטרינריה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
RPMI 1640ג'יבקו מבית Life Technologies11875-093
סרום בקר עובריHyCloneSH30396.03
נתרן פירובטג'יבקו מבית Life Technologies11360-070
MEM חומצות אמינו לא חיוניותג'יבקו מבית Life Technologies11140-050
HEPESgibco מבית Life Technologies15630-080
2-מרקפטואתנולGIBCO של Life Technologies21985-023
L-גלוטמין ג'יבקו מבית Life Technologies25030-164
פניצילין-סטרפטומיציןג'יבקו מבית Life Technologies15140-122
1x Hank' s תמיסת מלח מאוזנת gibco by Life Technologies14175-079
MACS BSA Stock SolutionMiltenyi Biotec130-091-376
MgCl2SIGMAM8266
DNase ISIGMAD4527
מאגר ליזה של תאי דם אדומים (RBC) eBioscience00-4300-54
שיפוע צפיפות בינוניGE Healthcare17-1440-02Ficoll-Paque Plus 
נגד עכבר CD19-PEBD Pharmingen553786
נגד עכבר CD11c-PEeBioscience12-0114-82
נגד עכבר CD11b-APC-CY7BD Pharmingen557657
נגד עכבר PDCA-1-FITCeBioscience11-3172-81
נגד עכבר B220-V500 BD Pharmingen561226
DAPIinvitrogenD3571
ערכת בידוד תאים דנדריטיים פלסמציטואיד II, עכברMiltenyi Biotec130-092-786
BD FACSAria I ציטומטר זרימה BD Biosciences643178
BD FACS Diva גרסה 6BD Biosciences

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bonner, W. A., Hulett, H. R., Sweet, R. G., Herzenberg, L. A. Fluorescence activated cell sorting. Rev Sci Instrum. 43 (3), 404-409 (1972).
  2. Herzenberg, L. A., et al. The history and future of the fluorescence activated cell sorter and flow cytometry: a view from Stanford. Clin Chem. 48 (10), 1819-1827 (2002).
  3. Brown, M., Wittwer, C. Flow cytometry: principles and clinical applications in hematology. Clin Chem. 46 (8 Pt 2), 1221-1229 (2000).
  4. Laerum, O. D., Farsund, T. Clinical application of flow cytometry: a review. Cytometry. 2 (1), 1-13 (1981).
  5. Alvarez-Barrientos, A., Arroyo, J., Canton, R., Nombela, C., Sanchez-Perez, M. Applications of flow cytometry to clinical microbiology. Clin Microbiol Rev. 13 (2), 167-195 (2000).
  6. Mattanovich, D., Borth, N. Applications of cell sorting in biotechnology. Microb Cell Fact. 5 (12), (2006).
  7. Aldahlawi, A. M., Elshal, M. F., Damiaiti, L. A., Damanhori, L. H., Bahlas, S. M. Analysis of CD95 and CCR7 expression on circulating CD4(+) lymphocytes revealed disparate immunoregulatory potentials in systemic lupus erythematosus. Saudi J Biol Sci. 23 (1), 101-107 (2016).
  8. Cullender, T. C., et al. Innate and adaptive immunity interact to quench microbiome flagellar motility in the gut. Cell Host Microbe. 14 (5), 571-581 (2013).
  9. Fernandez, A. G., et al. High-throughput fluorescence-based isolation of live C. elegans larvae. Nat Protoc. 7 (8), 1502-1510 (2012).
  10. Cai, M., et al. DC-SIGN expression on podocytes and its role in inflammatory immune response of lupus nephritis. Clin Exp Immunol. 183 (3), 317-325 (2016).
  11. Blasius, A., et al. A cell-surface molecule selectively expressed on murine natural interferon-producing cells that blocks secretion of interferon-alpha. Blood. 103 (11), 4201-4206 (2004).
  12. Welzel, G., Seitz, D., Schuster, S. Magnetic-activated cell sorting (MCS) can be used as a large-scale method for establishing zebrafish neuronal cell cultures. Sci Rep. 5, 7959(2015).
  13. Valli, H., et al. Fluorescence- and magnetic-activated cell sorting strategies to isolate and enrich human spermatogonial stem cells. Fertil Steril. 102 (2), 566-580 (2014).
  14. Yamashiro, S., et al. Phenotypic and functional change of cytokine-activated neutrophils: inflammatory neutrophils are heterogeneous and enhance adaptive immune responses. J Leukoc Biol. 69 (5), 698-704 (2001).
  15. Apostolidis, S. A., Lieberman, L. A., Kis-Toth, K., Crispin, J. C., Tsokos, G. C. The dysregulation of cytokine networks in systemic lupus erythematosus. J Interferon Cytokine Res. 31 (10), 769-779 (2011).
  16. Asselin-Paturel, C., Brizard, G., Pin, J. J., Briere, F., Trinchieri, G. Mouse strain differences in plasmacytoid dendritic cell frequency and function revealed by a novel monoclonal antibody. J Immunol. 171 (12), 6466-6477 (2003).
  17. Liao, R., et al. Tacrolimus Protects Podocytes from Injury in Lupus Nephritis Partly by Stabilizing the Cytoskeleton and Inhibiting Podocyte Apoptosis. PLoS One. 10 (7), e0132724(2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Fluorescence activated Cell SortingPlasmacytoid Dendritic CellsBone Marrow IsolationCell Surface StainingForward Scatter AnalysisSide Scatter AnalysisMagnetic Activated Cell SortingLupus prone MiceIFNalpha ProductionCell Purity Analysis

מאמרים קשורים