טיפות מימית משמש Microreactors אנזימטיות, הופעה אלקטרומגנטית שלהם

סיכום

מערכות התגובה מעבדה-ב--שחרור מאפשרים יישום רב תכליתי של תגובות מורכבות בקנה מידה microfluidic. פלטפורמה הופעה אוטומטית של מטריצה 3 x 3 של סלילים אלקטרומגנטיים פותחה נהגה בהצלחה מיזוג שני 10 µL microreactors, ובכך ליזום לתגובה אנזימטי של הקופה נוזלי המתקבל.

תקציר

עבור יישום מוצלח של מערכות התגובה microfluidic, כגון PCR ואלקטרופורזה, התנועה של אמצעי אחסון נוזלי קטן הוא חיוני. בקונבנציונלי מעבדה-ב--צ'יפ-פלטפורמות, ממיסים ודוגמאות מועברים בערוצים microfluidic מוגדר עם התקנות בקרת זרימה מורכבים. פלטפורמת הופעה droplet המובאת כאן היא אלטרנטיבה מבטיחה. זה ניתן להזיז טיפה נוזל (microreactor) על משטח מישורי של פלטפורמה התגובה (lab-ב--שחרור). הופעה של microreactors על פני השטח הידרופוביות של הפלטפורמה מבוססת על השימוש של כוחות מגנטיים על המעטפת החיצונית של הטיפות נוזלי אשר עשוי משכבה דקה של חלקיקים מגנטיט superhydrophobic. פני השטח הידרופוביות של פלטפורמת יש צורך למנוע קשר בין פני השטח כדי לאפשר תנועה חלקה של microreactor הליבה נוזלי. על הרציף, microreactors אחד או יותר עם אמצעי אחסון של 10 µL שאפשר למקמו ולשנות סימולטנית. הפלטפורמה עצמה מורכבת מטריצה 3 x 3 של סלילי כפול חשמל להכיל ליבות ניאודימיום או ברזל. מעברי צבע השדה המגנטי נשלטים באופן אוטומטי. מאת וריאציה של מעברי צבע השדה המגנטי, מעטפת הידרופובי מגנטי של microreactors ניתן לטפל באופן אוטומטי להעביר את microreactor או לפתוח את המעטפת הפיכה. התגובות של סובסטרטים ואנזימים המתאים יכול להיות ביוזמת מיזוג של microreactors או להביא אותם לידי מגע עם משטח זרזים קיבוע.

מבוא

יישומים טכניים עם תגובות מיקרו מתבצעות בעיקר בצ'יפס microchannel מוגדר מראש. מערכות אלו הן נרחב הקים ותיאר באופן מקיף בספרות (אינטר עאליה ^1,2,3). בשנת 2011, המחזור של טכנולוגיות microfluidic ברחבי העולם הסתכם בכ-6.2 מיליארד יורו ⁴. לעומת זאת, השימוש של הכור מיקרו מטלטלין בחופשיות תאים בעבר רק וצילומי לאור במידה מצומצמת. השיטה הנפוצה ביותר להעברת מימית טיפות מיקרו הוא electrowetting ⁵. שיטות אחרות של תנועת טיפות על משטחים מבוססות על שדות חשמליים ⁶, כוח מגנטי ⁷ או הופעה אקוסטית ⁸. בשל השטח שלילי יחס נפח, מערכות מבוססות-droplet microreactor אלה נחשפים אפקטים חזקים אידוי. לכן, ההצעה טיפה בדרך כלל נוסדה כמערכת דו-שלבית נוזלי, איפה השלב העליון יש נקודת רתיחה גבוהה הגנה על השלב מימית מפני אידוי. עם זאת, גישה זו כרוך סיכון גבוה של מזהם את ה-droplet התגובה על ידי לא מבוקרת דיפוזיה. זהו מכשול משמעותי להקמת המערכות שהוזכרו טכני.

העבודה האחרונה עוסקת שלב נוזל נוזל מוצק שאינו דוגל מעברים. גישה יעילה ביותר הוא השימוש של משטחים superhydrophobic, מאפשר היווצרות של טיפות מימית כדורית. הרחבה של המושג הזה התגובה הוא השימוש של מיקרו תגובת תאי עם משטח superhydrophobic או מעטפת, אשר יכול למשל להיות מורכב חלקיקי טפלון (PTFE) ⁹. זוויות הקשר שלהם על משטחים הם בדרך כלל בטווח של 160° (בהתאם חספוס פני השטח). התאים כדורית ובכך לספק התנגדות מינימלית לתנועה על משטח, במקביל מספקים הגנה מפני אידוי מים.

טיפות מימית מצופה חלקיקי מיקרו PTFE בגודל עשוי לשמור על צורתם כדורית עד קוטר של-2 מ מ. בעוצמות גבוהות, הקליפה הידרופובי בדרך כלל לא סגור לחלוטין כבר ¹⁰. השפעת חומרים אחרים מעטפת והרחבת של השדה של היישום של השיש נוזלי ממיסים פולרי בוצע על-ידי גאו מקארתי באמצעות נוזלים יוניים ¹². על היווצרות של פגזים מבוסס חלקיק הידרופוביות, קטרים חלקיקים בגדלים של 10 nm-30 מיקרומטר כה תיאר ^11,14,16. מחקרים חדשים הראו כי חלקיקים הידרופובי כחומר מעטפת השימוש אפילו טוב יותר מזה של microparticles ¹³. מחקרי יציבות הראשון אישר עלייה ביציבות כאשר גודל החלקיקים מצומצמת מ ca. 600 nm ca- 100 ננומטר. תוצאות הזה סביר להניח התפלגות החלקיקים צפופה בסביבה מימית הספרה ה- ¹⁵.

ההגנה על התגובה מימית תאים על ידי פגז הידרופוביות שלהם כערבים גולות נוזלי תוארה לראשונה בשנת 2001 על ידי. Aussillous et al. , Mahadevan. et al. ^{17 , 18}. מאז, תוארו מספר יישומים של תאים אלה התגובה מוגדרים. לדוגמה, חיישן הגז מבוסס על גולות נוזלי ¹⁹ ו שיטת זיהוי זיהום מים המבוסס על בסיס איכותי שטיחות כבר מפותחת ²⁰. המחברים מבחינים את היתרונות של שיעורי תגובה גבוהה וצריכה נמוכה של כימיקלים של מערכות מיקרו התגובה שלהם. פרסומים אחרונים עוסקים הייצור של גולות נוזלי pH רגיש ¹⁶ או הייצוג של "חלקיקים יאנוס" עם שני ציפויים שונים של פונקציונליות שונה. לדוגמה, Bormashenko. ואח יכול לסנתז של microreactor עם קליפות של טפלון, פחמן שחור מוליכים למחצה ²¹. יתר על כן הוכח כי microreactors יכול באופן יעיל ונוח לסנתז polyperoxides על ידי קליטת חמצן חיצוני כמו comonomer דרך ממשק גז נוזלי חדיר ²⁴. בגישה אחרת הקליפה של סיליקה-חלקיקים מבוססי גולות נוזלי לספק את המשטחים המצע תגובתי לווסת את התגובה מראה כסוף קלאסי ²⁶. בעיות הנוכחי עבור מחקר ופיתוח בתחום של טיפות הידרופילית-core-הידרופובי-shell הן את התאמת גודל החלקיקים, ייצור לשחזור של טיפות monodisperse, את wettability של משטחים ועל ההשפעה של שניה מעטפת הידרופילית על תאי מיקרו תגובה ²², כמו גם על שליטה טובה יותר. של מסלולים רביב, למשל עבור הפיתוח של microPCR-מערכות רציפות ⁴.

הופעה מגנטי של אלה microreactors מציע את היתרון של טווחי תנועה גבוהה יחסית של סלקטיביות טוב של הכוח בעת עבודה במערכות הביוכימי. בעת שימוש מגנטיט הידרופובי חלקיקים, הם לממש את הפונקציה של העברת כוח מגנטי את תנועת microreactors, כמו גם את הפונקציה של פגז הידרופובי. תנועת מגנטי של טיפות עם חלקיקים מגנטיים בתוך droplet היה שמהווה לראשונה בשנת 2006 על ידי להמן. et al. ²³ ו. Shikida et al. ²⁵, אשר השתמשו באופן ידני עבר קבועים magnets כמו מפעילים גיוס כללי של droplet יחיד. גישה אחרת כדי להעביר כמות קטנה של נוזל התממש על ידי זאו. et al., אשר משמש החלקיקים₄ הידרופובי Fe₃O מעטפת מגנטי. המעטפת של השיש נוזל מגנטי פתחו על הצד העליון של הטיפה שדה מגנטי הפוך אנכית ²⁷. מבוסס על תפיסה זו, Xue. et al. הצליחו לפתח חלקיקים אשר יוצרים microreactor עם מתח פני השטח של דיין 20.1 ס מ^{− 1 28}. . לין ואח מפוברק חדשניים מבוססי תאית מיקרו/ננו הירארכי הספירות פאראמגנטיות על וגם superhydrophobicity המספקים יציבות אלוהים droplet נוזל מגנטי תחבורה ומניפולציה ³¹. זה כה שוחרר רק הוכחה-של-עיקרון ללמוד, לא משמש עבור כל יישום. שליטה מגנטיים וחשמליים של הקופה נוזלי הוא נרדף כעת בגישות הראשון. זאו. et al. ב 2010 ¹⁵ לג'אנג. ואח 2012 ²⁹ הצליחו לפתח מניפולציה droplet על ידי התנועה (המופעלים באמצעות היד) ידני של מגנט קבוע מתחת ליבה-קליפה טיפות. . Bormashenko et al. ¹¹ שהשיג ההאצה של גולה נוזלי פרומגנטי במהירות של 25 ס מ s^-1 מתקרב מגנט נאודימיום. העיקרון שהוזכרו לעיל מחקרים בוצעו באופן בלעדי על ידי התנועה ידנית של מגנט קבוע קטן. כצעד הבא פיתוח, זאו. et al. הצליחו לאחרונה להעריך את צפיפות השטף המגנטי הנדרש לתנועה של השיש נוזל מגנטי על ידי שינוי המרחק של מגנט קבוע ³⁰. עבור פקד תגובה לזו של מערכות מעבדה-על-שבב נפוצות, זה בלתי נמנע לספק אמצעי בקרה אוטומטיות של v נוזלי דיסקרטיתolumes. כדי לספק צורך זה, פיתחנו מערכת בקרה חדשה המבוססת על מעברי צבע משתנה השדה שמלמדות, העבר ולפתוח את microreactors מגנטי.

פרוטוקול

1-Hydrophobization של חלקיקים מגנטיים

1. לסינתזה של החלקיקים המגנטיים הידרופוביות, להוסיף 0.85 g FeCl ₃ hexahydrate (3.14 אינצ mmol) 0.30 g FeCl ₂ tetrahydrate (1.51 mmol) 200 מ ל פתרון מים/אתנול (4:1 v/v).
2. כדי תערובת זו, הוסף 0.20 מ ל 1H. 1H, 2 H, 2H-Perfluorooctyltriethoxysilane (PFOTES) (5.23 mmol) עם בחישה נמרצת על ידי פגים (500 סל ד). לבצע הסינתזה באווירה גז אינרטי (N ₂) באמצעות בקבוקון סיבוב המדרגה עם פקק על מנת למנוע חמצון המשני של החלקיקים מגנטיט.
3. להתאים את הירידה פתרון חכם עם פתרון אמוניה מימית (1.5 M) pH של 8 (pH נקבע על ידי מד pH). מוסיפים את הפתרון עבור 24 שעות ביממה באמצעות של פגים.
4. להפריד בין החלקיקים דיסקות מן הפתרון על-ידי הצבת את הבקבוק על הבר מגנט (דבק 40 x 20 x 10 מ מ, מגנט cuboid ניאודימיום כוח 25 ק ג). שופכים את הפתרון תוך שמירה על המגנט המצורף בתחתית הבקבוק.
5. לרחוץ את החלקיקים שלוש פעמים עם הפתרון מים/אתנול תוך שימוש בר מגנט כמתואר ב- 1.4). יבש את החלקיקים ב 60 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות (תשואה. ca. 0.43 g).
6. לניתוח החלקיקים, להשתמש במיקרוסקופ אלקטרונים סריקה לפי יצרן ' הוראות s.

2. ייצור של Microreactors

1. לטחון כל החלקיקים מיובשים מעט באמצעות כבעלי זכוכית ומניחים כולן לאחר מכן ישירות במחבת במשקל (46 × 46 × 8 מ מ, פוליסטירן).
2. 10 פיפטה פתרון תגובה µL (הרכב כפי שמתואר 5.1) על גבי כל החלקיקים ואת מהלך שקילת במחבת מעט בצורה מעגלית במשך כ 10 s (חלקיק מסה על microreactor 10 µL: ca. 3.2 x 10 ק ג ^-7 < מה המצב class = "xref" > 33). לאחסן את החלקיקים שנותרו (חלקיקים אשר לא בעצמם סביב הפתרון התגובה) בטמפרטורת החדר עבור יישומים נוספים-
3. למדידת זווית microreactor הקשר, לבנות microreactor 5 µL עם מים כמתואר ב- 2.2), להניחה על סרט טפלון ולנתח את זווית מגע באמצעות מכשיר מדידה אופטית זווית מגע על-פי יצרן ' s הוראות.

3. הדפסת תלת-ממד של הגופים סליל

1. לעצב את הגופות סליל כפול בגובה של 16 מ מ (תא אחד), בקוטר של 10 מ"מ של הקוטר הפנימי של ca. 4 מ מ באמצעות תוכנת תיב מ לפי יצרן ' s הוראות.
2. להדפיס את הגופות סליל עם מדפסת תלת-ממד על פי היצרן ' s הוראות על-ידי שימוש בחומרים כגון polylactide הלהט. לעטוף את הגופות עם חוט נחושת 0.08 מ"מ כדי להשיג 4,500 windings באמצעות מכונת מתפתל מבוקר מחשב-

4. ייצור של פלטפורמת הופעה

1. סדר הכפול סלילי במטריצה (למשל 3 x 3 מטריקס) על לוח חשמלי עם אלמנט Peltier מתחת, לדפוק על הגלילים זוגי ולקשר אותם אל פקד באמצעות רצועת הכלים (כבל איור 3).
2. בהתאם ליישום המבוקש, להוסיף על ליבת ברזל (32 מ מ גובה, קוטר 4 מ מ) או מגנט נאודימיום (12.5 מ מ גובה, קוטר 4 מ מ, קה 1035 ז ^-1) לגוף סליל כדי לקבל שדה מגנטי חזק יותר.
3. לסיים הפלטפורמה למקם על צלחת, רצוי זכוכית קוורץ, עם גובה מקסימלי של 1 מ מ על המטריקס סליל-
4. במקום microreactor על פני השטח של פלטפורמת.
5. למשוך את החלקיקים העליון הפתרון התגובה ולפתוח ובכך microreactor להפעיל סליל עם מגנט נאודימיום פנימה על-ידי שימוש בפקד שצוין ב- 4.1). כדי לסגור microreactor שוב לבטל את הגליל.
6. כדי למזג שתי microreactors אשר הם בתחילה ca. בהפרש של 10 מ מ להשתמש מגנטים ניאודימיום כמתואר ב- 4.2). להרים את המגנט בגופים סליל הנדרש על ידי הפעלת הגלילים עבור ca. 25 s כדי לפתוח את אחד microreactor (נדרש מרחק בין שקרים microreactor, מגנט כ 12 מ מ) וכדי לעבור השני לאותו מיקום על הרציף.
7. להתקרר התגובה פתרון microreactor על פני השטח פלטפורמה וכדי להקטין את הטמפרטורה סליל לעבור על הרכיב Peltier ממוקם מתחת המטריקס סליל כמתואר ב- 4.1).

5. התגובה אנזימטי על ידי מיזוג Microreactors

1. התמוססות peroxidase חזרת-ריכוז של 0.1 µg מ ל ^-1 במאגר אשלגן פוספט (0.1 M, pH 6.5). לדלל את המצע, 10-אצטיל-3,7-dihydroxyphenoxazine (10 מ מ dimethylsulfoxide (דימתיל סולפוקסיד)) עם אשלגן פוספט מאגר (0.1 M, pH 6.5) כדי ריכוז של מיקרומטר 200.
2. 10 שימוש µL של כל הפתרונות הללו כדי לבנות microreactors שני כמתואר ב- 2.2). למזג את שני microreactors באמצעות הממוצע של כוחות מגנטיים (מגנט neodymium גליל: 12.5 מ מ x 4 מ מ, 1,035 קה מ ^-1) כמתואר ב- 4.6)-25 מעלות צלזיוס
3. לזהות את התגובה על-ידי הצבת בדיקה קרינה פלואורסצנטית (אורך גל עירור: 570 ננומטר, אורך גל פליטה: 585 ננומטר) ca. 10 מ מ ישירות מעל microreactor נפתח לפני המיזוג.

תוצאות

חלקיקי מעטפת יש קוטר של בסביבות 640 ננומטר. חלקיקים magnetizable בסוגריים את חלקיקי מעטפת fluorosilane יש קטרים בטווח בין 22 ננומטר ו-37 ננומטר. Microreactor 5 µL עם מים כמו גרעין נוזלי הייתה זווית הקשר של בסביבות 160°.

הכוח הנדרש כדי להזיז microreactor 10 µL כפי שתוארה לעיל היא µN ± 0.08 1.34. איור 1 מציג את הכוח האלקטרומגנטי של סליל עם windings 4,500 של חוטי נחושת של ליבת ברזל פנימי מופעל עם 58 mA...

דיון

השימוש המוצלח של microfluidic טכנולוגיות, חשוב לעבור שעוצמת התגובה המתאים לדרישות של סינתזה ביוטכנולוגי, ניתוחים. פלטפורמת הופעה המובאת כאן מאפשרת לך להעביר טיפות microfluidic על-ידי כוח מגנטי. התנועה יכולה להתבצע באופן חופשי בשני מימדים על משטח מישורי של פלטפורמה תגובה על-ידי תחימת הירידה נוזלי עם פגז superhydrophobic מגנטי. לפיכך מערכת חלופית לערוצים microfluidic מראש עם התקנות בקרת זרימה מורכבים, כמו בשימוש מערכות microfluidic המקובלת, לעבור ממיסים ודוגמאות הוא הציג. הופעה אוטומטית של טיפות תגובה קטנה ולכן הוא פישוט מ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מדפסת תלת מימד	FelixPrinters	Pro1
10-אצטיל-3,7-דיהידרוקסיפנוקסאזין (אדום אמפלקס)	Life Technologies	A12222
אמוניום הידרוקסיד	TU-KL	1072
תוכנת CAD	סימנס	סולד קצה
מכשיר מדידת זווית מגע	Dataphysics	OCA 20
צילינדר מגנט	Webcraft GmbH	S-04-13-N	https://www.supermagnete.de/stabmagnete-neodym-rund/stabmagnet-durchmesser-4mm-hoehe-12.5mm-neodym-n42-vernickelt_S-04-13-N
דיפוטסיום פוספט	ברנד קראפט	7758-11
תנור ייבוש	קלסר	FD 115
אתנול	סיגמא-אולדריץ'	68-17-5
FeCl2 tetrahydrate	TU-KL	1625
FeCl3 hexahydrate	TU-KL	1622
בדיקה פלואורסצנטית	PerkinElmer	LS 55
חזרת פרוקסידאז	קארל רוט	9003-99-0
מי חמצן	Th.Geyer GmbH & Co	7722-84-1
מונופוטסיום פוספט	ברנד קראפט	7778-77-0
אלמנט פלטייר	קונרד
Perfluoroctyltriethoxysilane	Sigma-Aldrich	51851-37-7
מיקרוסקופ אלקטרונים סורק	FEI	Helios NanoLab 650
	Webcraft GmbH	Q-40-20-10-N
מכונת סלילה	IWT GmbH	FW122