הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הזרקת Intranenal של Escherichia coli במודל עכברוש של Pyelonephritis

7.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54649

⸱

18 ביולי 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Radiology, Case Western Reserve University, 2Department of Pediatrics, Case Western Reserve University, 3Department of Urology, Case Western Reserve University, 4Department of Biomedical Engineering, Case Western Reserve University

במאמר זה

סיכום

כתב יד זה מתאר מודל כירורגי של חולדות של פיילונפריטיס באמצעות זיהום תוך-כלייתי ישיר על ידי Escherichia coli לאגן הכליה. ניתן להשתמש בהליך הניסוי כדי לחקור את הפתוגנזה של פיילונפריטיס כמו גם את הדלקת והפיברוזיס הנלווים.

תקציר

פיילונפריטיס הוא זיהום חיידקי של הכליה ונגרם לרוב על ידי Escherichia coli. זיהומים חוזרים עלולים לגרום לדלקת כליות משמעותית ולפיברוזיס ובסופו של דבר לגרום לירידה בתפקוד הכליות. לפני שניתן יהיה לשפר את הניהול הקליני ומניעה של פיילונפריטיס, יש לבסס מודל אמין בבעלי חיים על מנת לחקור את מנגנוני ההתקדמות, ההישנות והיעילות הטיפולית. מודל הזיהום הטרנס-שופכה מחקה מקרוב את הפיילונפריטיס האנושי אך מציג שונות ניכרת בשל הסתמכותו על ריפלוקס בשופכה כדי להעביר את החיידקים לכליה. כאן, פרוטוקול כירורגי מפורט לביצוע הזרקות חיידקים לאגן הכליה של החולדה מסופק ומאושר על ידי הדמיית תהודה מגנטית לא פולשנית (MRI). באמצעות פרוטוקול זה, בעלי חיים מקבלים חשיפה ישירה לריכוז רצוי של חיידקי E. coli ויכולים להתאושש לחלוטין מההליך הכירורגי עם טיפול הולם לאחר הניתוח. זה מקל על הערכות MRI אורכיות עוקבות של המודלים של חיות הניסוי להשוואה עם בקרות מלוחות. באמצעות גישת אספקה ישירה זו, חומרת הזיהום ניתנת לשליטה וישימה למחקרים מכניסטיים של התקדמות כמו גם לפיתוח אסטרטגיות טיפול חדשות.

מבוא

מודלים מכרסמים שימשו כדי לחקור תופעות רבות של המחלה האנושית, כולל pyelonephritis וזיהומים בדרכי השתן (UTI). UTI הם בעיה בריאותית גלובלית, והוא יכול להשפיע על ילדים, גברים ונשים בכל הגילאים. 1 , 2 , 3 הביטוי הראשוני של UTI כולל דלקת שלפוחית ​​השתן, ואם הזיהום עולה לאורך השופכן, זיהום כליות (pyelonephritis) עשוי לעקוב. במקביל, שכיחות הסוכרת מתקרבת ל -400 מיליון איש ברחבי העולם. 4 , 5 חשוב לציין כי שכיחות UTI עשויה להיות גבוהה פי 4 בחולים הסובלים מהשמנת יתר או סוכרת מסוג 2, מה שמוביל לסיכון מוגבר לדלקת UTI חוזרת (rUTI), אלח דם, פיברוזיס כליות מדלקת פילונפריטיס, וחוסר תפקוד של שלפוחית ​​השתן. 6 , 7 , 8 מכרסמיםמודלים חשובים לחקר UTI, משום שטיפולים אנטיביוטיים עכשוויים מייצרים תגובה מתמשכת ומניעה רק בקבוצת משנה של חולי UTI. כדי לשפר את הטיפול UTI הקליני, הצעדים העיקריים הם להבין את המנגנון של RUTI ואת התהליכים הפתופיזיולוגיים שלה מפני דלקת חריפה לדלקת פיברוזיס, כמו גם את ההשפעה של סוכרת מסוג 2.

המטרה של שיפור מודלים של בעלי חיים היא לפתח טכניקות המאפשרות הערכה מדויקת יותר של התקדמות המחלה והתערבויות טיפוליות. כמה גישות שונות שימשו כדי לגרום pyelonephritis חולדות ו / או עכברים ללמוד את הפתופיזיולוגיה של נזק לכליות, את ההשפעה של טיפול אנטיביוטי, וכן היבטים אחרים של הקורס הטבעי של UTIs. גישה נפוצה להקים UTI מדרדר הוא צנתור transurethral. 10 , 11 , 12 , 13 </ Sup> שיטה זו מציגה חיידקים דרך השופכה לתוך שלפוחית ​​השתן של בעלי חיים הרדים. בעוד טכניקה זו מקרוב מדמה pyelonephritis האדם, ההיארעות בפועל ואת גודל של זיהום pyelonephritis יכול להיות משתנה מאוד בגלל מספר גורמים, כולל חוסר ריפלוקס אוורטרי ספונטנית או הימנעות השתן במהלך או מיד לאחר חיסון. 11 כתוצאה מכך, השתנות הניסוי בגידול זיהום pyelonephritis עולה יכול להגביל את התועלת של מודל זה כדי לחקור זיהומים כליות, כמו גם אסטרטגיות טיפוליות.

דוח זה מתאר מודל כירורגי pyelonephritis חולדה שבו E. coli מוזרק ישירות לתוך הכליה חולדה. למרות מודל חולדה זה פולשני, כמות E. coli נמסר כליה ניתן לשלוט באופן יעיל המאפשר דלקת כליות חזקה דלקת. 14 במסגרת הליך זה, אנו מתארים גםאיך אלה המושרה זיהומים כליות ניתן לפקח longitudinally עם in vivo מגנטית תהודה הדמיה (MRI).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל המחקרים בבעלי חיים בוצעו על פי פרוטוקולים מאושרים לטיפול בבעלי חיים מוסדיים ושימוש ועדת (IACUC) באוניברסיטת קייס ווסטרן ריזרב. משך הליך כירורגי המתואר להלן הוא כ 45-60 דקות. הליך MRI עצמו הוא כ 15 דקות עבור כל נקודת זמן.

1. הרדמה

  1. הרדים עכברוש בחדר isoflurane להגדיר ב 2% isoflurane מעורבב עם חמצן כדי להקל על טיפול בבעלי חיים וריסון לפני מתן הרדמה הזרקת תוך - peritoneally.
  2. לאחר 3-5 דקות של חשיפה isoflurane, לבדוק כי החיה הוא הרדים ולא מציג שום תגובה על קמצוץ הבוהן.
  3. עוד חולדה מסודר עם זריקה תוך-צפית של תערובת של xylazine ו ketamine: 75 מ"ג / ק"ג קטמין / 10 מ"ג / ק"ג xylazine. בעת ביצוע זריקות intra-פריטונאלי, למשוך בחזרה את המחט כדי להבטיח חלקים של המעי או איברים חיוניים אחרים לא נקברו.
  4. אנידלקת 2 מ"ג / ק"ג של bupivacaine תת עורית באתר החתך לספק הקלה על כאב מקומי.

2. הכנת אזור כירורגי

  1. לעקר מכשירים כירורגי ואספקה ​​לפני שהם משמשים לניתוח לפרוס על כרית כירורגי סטריליות. רוב המכשירים והאספקה ​​יכול להיות autoclaved ושימוש חוזר.
  2. השתמש כפפות סטריליות עבור כל הליכים כירורגיים.
  3. השתמש תער חשמלי לגלח את הפרווה מן הצד הימני של החיה. לגלח את החיה מהחלק התחתון של הצלעות כלוב לחלק העליון של הרגל האחורית מתן אזור גדול ללא שיער עבור החתך.
  4. מניחים את החיה על כרית כירורגי סטרילי לבודד את האזור מחטא מן האזורים הסמוכים.
  5. לשפשף את העור עם חיטוי כגון povidone יוד או betadine. התחל את קרצוף במרכז האתר כירורגית ולעבור החוצה באופן מעגלי. חזור לפחות שלוש פעמים עם מחיקת חדש של יוד פובידון או betadine.
  6. לשפשף את האתר כירורגי עם 70% אלכוהול ספוגי עד העור הוא ברור, כמו יוד עשוי להיות רעיל אם נספג.

3. הליך כירורגי

  1. שמור על הליך זה בתנאים aseptic.
  2. למקם את החיה הרדים על המיטה חימום חם בעמדה decubitus שמאל לרוחב עם האגף הימני פונה כלפי מעלה.
    הערה: יש להקפיד לשמור על טמפרטורת הגוף הליבה של החולה ב 35-37 מעלות צלזיוס כדי למנוע היפותרמיה. מיטה זו התחממות צריך גם להיות מעוקרים לפי הצורך כדי לשמור על תנאים aseptic.
  3. להרגיש על כלוב צלעות, ולעשות חתך קטן 2-3 ס"מ ימין retroperitoneal הגב באמצעות גודל סטרילי 10 להב סכין מנתח החל בחלק התחתון של הצלעות כלוב.
  4. המקום גזה סטרילית longitudinally לאורך כל צד של החתך.
  5. לנתח משם את הרקמה התת עורית, שומן, ואת השרירים על מנת לדמיין ולגשת חלל הבטן. השתמש מספריים Mayo מעוקל להב לאפשר חדירה עמוקה יותרRation לתוך הפצע ו לחתוך רקמות עבות.
  6. לאחר הכבד הוא גלוי בבירור ונגיש, להשתמש מלקחיים קהה כדי לסגת את הכבד כלפי מעלה.
  7. באמצעות זוג אחר של מלקחיים קהה ביד השנייה, לחשוף את הכליות הנכונה כך שהוא יושב ממש מחוץ חלל הבטן.
  8. השתמש באצבע המצביע ובאגודל היד השמאלית כדי להחזיק את הכליה במצב. עם היד הימנית, לאט לאט בהזרקה 0.1 מ"ל UTI89 E. coli פתרון (ריכוז בין 1 x 10 8 -1 x 10 9 ) מזרק סטרילי לתוך האגן הכליות (המופיע כמו בועה לבנה) 15 .
    הערה: הכן את titer בקטריאלי כמתואר בסעיף 15 .
  9. מניחים רצועת המוסטאט absorbable מעל המחט כדי למנוע יצוא של inoculum לתוך הצפק. לאט לאט למשוך את המחט מתוך האגן הכליות.
    הערה: יש להקפיד לא לחדור או להדביק הרקמות הסובבות וכתוצאה מכך infecti היעדו / או סיבוכים.
  10. השתמש מזרק גדול לשטוף היטב את הכליה עם מלוחים רגילים לפני הצבת אותו בחזרה חלל הבטן.

4. התפרים

הערה: תפר כי יהיה קבור ברקמות צריך להיות 4-0 לא absorbable קלוע sutures. ניתן להשתמש בחומרי תפירה נספגים או מונופילמנטיים למשטחי גוף.

  1. מניחים את התפרים באופן שווה, קרוב ככל האפשר לקצה רקמות כדי למנוע חסימה של זרימת הדם; בדרך כלל לא יותר מ 0.3 ס"מ מן הקצה יש צורך.
  2. לתפוס את העור להסיט אותו מעט באמצעות זוג מלקחיים שיניים בסדר, לסובב את המחט בעל למצב pronated לקראת פירסינג העור.
  3. כונן את המחט דרך עובי מלא של העור על ידי supinating את פרק כף היד כדי לסובב את המחט ולהעביר אותו דרך העור.
  4. חזור על תהליך זה על קצה העור הקרוב ביותר לאדם המבצע את ההליך.
  5. לְהַדֵקהתפרים מספיק כדי להתנגד קצוות רקמות. כל לחץ חזק יותר יפריע לאספקת הדם, ריפוי פצעים איטי ויכול לגרום להרס.
  6. לקשור את תפר באמצעות קשרים מרובעים, כאילו זה היה תפר קטוע פשוט, אלא רק את גדיל קצר הוא חתך, משאיר על זנב 3-4 מ"מ.
  7. לאחר תפר הראשון כבר כבוי, להכין למקום תפר השני על 3 מ"מ מן הראשון, ולהמשיך את תפר פועל.
  8. לאחר סיום החתך הוא הגיע, לא למשוך את תפר האחרון לחלוטין דרך. במקום זאת, להשתמש בלולאה אשר מוחזק עם מחזיק מחט כאן כמו גדיל קצר על מנת לקשור את קצה דיסטלי של תפר הסגירה.
  9. באמצעות קשרים המכשיר, לקשור את תפר באמצעות קשרים מרובעים. התוצאה היא 3 גדילי דבק מן הקשר הושלמה בקצה הדיסטלי.

5. התאוששות בעלי חיים

  1. להזריק 2.1 מ"ג / ק"ג Yohimbine intra-peritoneally לאחר הניתוח כדי להפוך את ההרדמה. אNimals צפויים להתאושש לחלוטין מהליך כירורגי לאחר 3-5 שעות.
  2. שמור את החיה על כרית חימום (כדי למנוע היפותרמיה) ו מצעים רכים סופג לאחר הניתוח.
  3. לספק rehydration עם נוזלים אוראליים או פרקטראליים עד שהוא יכול לחזור להאכלה רגילה (בתוך 24 שעות). להזריק כ 0.6 מ"ל של תמיסת מלח תמיסת peritoneally מיד לאחר הניתוח להגביל את ההשפעות התייבשות.
  4. ספק כאבים כפי שתואר IACUC אישרה טיפול בבעלי חיים פרוטוקול שימוש. להזריק 5 מ"ג / ק"ג carprofen תת עורית לניהול כאב.
  5. מעקב אחר חתכים באופן קבוע עבור נפיחות, exudate, כאב, או dehiscence.

6. אימות באמצעות הדמיה תהודה מגנטית

  1. התנהגות i vivo MRI ניסויים על שדה גבוה בעלי חיים קטנים MRI סורקים.
  2. להשרות הרדמה עם isoflurane 3% חמצן ומיקום החיה עם הכליה הנכונה ב isocenter בסורק ה- MRI ו מתאיםאכלו רדיו. לספק לבעלי חיים 1-2% הרדמה isoflurane ברציפות לאורך כל הליך הדמיה באמצעות nosecone.
    הערה: בתמונות MRI של vivo שמוצג באיור 1 , נעשה שימוש בגליל נפח של חולדה (בקוטר פנימי = 72 מ"מ).
  3. השתמש ניטור בבעלי חיים מערכת בקרה כדי לשמור על קצב הנשימה של כל חיה (40-60 נשימות / דקות) ואת טמפרטורת הגוף הליבה (35 ± 1 ° C).
  4. השתמש רב פרוסה, הד הד ספין MRI הרכישה כדי להשיג ברזולוציה גבוהה, T2 משוקלל תמונות משוקלל של כליות נגוע והבקרה. פרמטרים אופייניים לרכישת MRI הם זמן חזרה = 5,000 msec, זמן הד = 40 msec, עובי פרוסה = 2.0 מ"מ, רזולוציה מרחבית במטוס = 200 מיקרומטר, 3 ממוצעי אותות וזמן רכישה של 8 דקות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

טכניקות ההדמיה הרפואית מציעות את האפשרות להעריך באופן לא פולשני את היעילות של UTI ואת היעילות הטיפולית. לכן, MRI נוצל כדי לאמת אינדוקציה של זיהום חריף לאחר הזרקה של 1-2 x 10 7 UTI89 E. coli , וכן לדמיין את השינויים בכליה לפני ואחרי הניתוח. איור 1a-b מראה אזור הולך וגובר של זיהום בכליות (חיצים צהובים). תמונות MRI שהתקבלו עבור כל בעל חיים בימים 1 ו 4 לאחר זיהום לעזור לאפיין את הצמיחה של דלקת חריפה pyelonephritis. ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

עולה pyelonephritis חריפה מכרסמים (כלומר עכברים וחולדות) יכול להיות מיוצר על ידי צנתור transurethral. 16 , 17 , 18 שיטה זו זיהום transurethral הוא יתרון בכך שהוא לא פולשני ומחקה את הפתופיזיולוגיה האנושית של זיהום עולה. 17 , 18 , 19 , 20 עם זאת, שיטה זו ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין גילויים נוספים.

תודות

המחברים מבקשים להודות לתמיכתם של NIH/NIDDK K12 DK100014 (Lan Lu), מרכז הסרטן המקיף למקרה (NIH/NCI P30 CA43703), ושיתוף הפעולה למדע קליני ותרגום של קליבלנד (NIH/NCATS UL1 TR000439).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
כרית סופגתפישר14-127-47
כרית גזה כותנה סטריליתפישר22-415-469
כפפות כירורגיות לטקסהנרי שיין בריאות בעלי חיים21540
מספריים מעוקלים מאיופישרS17341
ישר קהה Forecepsפישר08-895
ידית אזמל פישר08-913-5
להבי אזמל סטרילייםפישר53220
1 מ"ל מזרק לואר-לוקBD Biosciences309628להזרקות חיידקים
20 מ"ל מזרק לואר-לוק BD Biosciences301031לשטיפת מי מלח
HemostatSeneca Medical240267
23 גרם 3/4 אינץ'. מחט BD Biosciences305143
30 גרם 1 אינץ'. מחט BD Biosciences305128
מזרק אינסולין U-100אקסל אינטרנשיונל 25846לזריקות תרופות
איזופלורןהנרי שיין בריאות בעלי חיים050033
קסילזיןהנרי שיין בריאות בעלי חיים33197הזרקת IP
קטמיןפטרסון וטרינרי 07-881-9413הזרקת IP
יוהימבין (אטיפמזול)פטרסון וטרינרי 07-867-7097הזרקת IP לאחר ניתוח
בופיבקאין (מרקאין)פטרסון וטרינרי 07-890-4584הזרקת SQ במקום החתך 
4-0 Chromic Gut SutureEthicon Inc.U203H
4-0 תפר Vicryl קלועEthicon Inc.J304H
1 מ"ל מזרק SubQBD Biosciences309597
E. coli  UTI89 או CFT073ATCC700928
Surgicel Absorbable HemostatEthicon Inc.ETH1951CS 
Biospec 9.4T MRI ברוקר 94/20 ברית המועצות

מקורות

  1. Saliba, W., Barnett-Griness, O., Rennert, G. The association between obesity and urinary tract infection. Eur J Intern Med. 24 (2), 27-31 (2012).
  2. Semins, M., Shore, A., Makary, M., Weiner, J., Matlaga, B. The impact of obesity on urinary tract infection risk. Urology. 79 (2), 266-269 (2011).
  3. Zilberberg, M., Shorr, A. Secular trends in gram-negative resistance among urinary tract infection hospitalizations in the United States, 2000-2009. Infect Control Hosp Epidemiol. 34 (9), 940-946 (2013).
  4. Whiting, D., Guariguata, L., Weil, C., Shaw, J. IDF diabetes atlas: global estimates of the prevalence of diabetes for 2011 and 2030. Diabetes Res Clin Pract. 94 (3), 311-321 (2011).
  5. Wild, S., Roglic, G., Green, A., Sicree, R., King, H. Global prevalence of diabetes: estimates for the year 2000 and projections for 2030. Diabetes Care. 27 (5), 1047-1053 (2004).
  6. Ma, D., Gulani, V., Seiberlich, N., Liu, K., Sunshine, J., Duerk, J., et al. Magnetic resonance fingerprinting. Nature. 495 (7440), 187-192 (2013).
  7. Lu, L., Sedor, J., Gulani, V., Schelling, J., O'Brien, A., Flask, C. A., et al. Use of diffusion tensor MRI to identify early changes in diabetic nephropathy. Am J Nephrol. 34 (5), 476-482 (2011).
  8. Rosen, D., Hooton, T., Stamm, W., Humphrey, P., Hultgren, S. Detection of intracellular bacterial communities in human urinary tract infection. PLoS Med. 4 (12), e329(2007).
  9. Torine, L. A. Urinary tract infection: diabetic women's strategies for prevention. Br J Nurs. 20 (13), 791-792 (2011).
  10. Rosen, D., Hung, C., Kline, K., Hultgren, S. Streptozocin-induced diabetic mouse model of urinary tract infection. Infect Immun. 76 (9), 4290-4298 (2008).
  11. Larsson, P., Kaijser, B., Mattsby-Baltzer, I., Olling, S. An experimental model for ascending acute pyelonephritis caused by Escherichia coli or proteus in rats. J Clin Pathol. 33 (4), 408-412 (1980).
  12. Gupta, R., Ganguly, N., Ahuja, V., Joshi, K., Sharma, S. An ascending non-obstructive model for chronic pyelonephritis in BALB/c mice. J. Med. Microbiol. 43 (1), 33-36 (1995).
  13. Fernandes, P., Shipkowitz, N., Bower, R. Murine models for studying the pathogenesis and treatment of pyelonephritis. Adv. Exp. Med. Biol. 224, 35-51 (1987).
  14. Kaye, D. The effect of water diuresis on spread of bacteria through the urinary tract. J. Infect. Dis. 124 (3), 297-305 (1971).
  15. Fierer, J., Tainer, L., Braude, A. Bacteremia in the pathogenesis of retrograde E. coli pyelonephritis in the rat. Am. J. Pathol. 64 (2), 443-456 (1971).
  16. Nickel, J., Olson, M., Costerton, J. Rat model of experimental bacterial prostatitis. Infection. 19 (3), S126-S130 (1991).
  17. Hagberg, L., Engberg, I., Freter, R., Olling, S., Eden, C. Ascending, unobstructed urinary tract infection in mice caused by pyelonephritogenic Escherichia coli of human origin. Am Soc Microbiol. 40 (1), 273-283 (1983).
  18. Kurosaka, Y., Ishida, Y., Yamamura, E., Takase, H., Otani, T., Kumon, H. A non-surgical rat model of foreign body-associated urinary tract infection with Pseudomonas aeruginosa. Microbiol. Immunol. 45 (1), 9-15 (2001).
  19. Anderson, B., Jackson, G. Pyelitis, an important factor in the pathogenesis of retrograde pyelonephritis. J Exp Med. 114 (3), 375-384 (1961).
  20. Anderson, J. Vesico-ureteric reflux. J R Soc Med. 55 (6), 419-426 (1962).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Escherichia coliMRI
הזרקת Intranenal של Escherichia coli במודל עכברוש של Pyelonephritis
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.