מאמר שיטה

מבחני ללמוד את התפקיד של Vitronectin הידבקות חיידקים עמידות סרום

7.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54653

⸱

16 באוקטובר 2018

 ,  ,  ,  , 
1Clinical Microbiology, Department of Translational Medicine, Lund University, 2Department of Molecular Biology, Umea University

במאמר זה

סיכום

הדו ח מתאר פרוטוקולים עבור אפיון אינטראקציות בין חלבונים חיידקי הממברנה החיצונית vitronectin מווסת את המשלים אנושי. הפרוטוקולים ניתן ללמוד את איגוד תגובות והתפקוד הביולוגי של vitronectin של כל מין חיידקית.

תקציר

חיידקים לנצל המשלים הרגולטורים, כאמצעי התחמקות את התגובה החיסונית של המארח. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקולים להערכת הרכישה vitronectin תפקיד-ההצגות משטח של תא החיידק בהתנגדות מערכת החיסון של הפונדקאי. ניסויים cytometry זרימה מזוהות vitronectin לפלסמה אנושית ליגנד עבור החלבון הממברנה החיצונית קולטן חיידקי H של Haemophilus influenzae סוג f. וזמינותו מקושרים-אנזים immunosorbent הועסק כדי לאפיין את אינטראקציות חלבון חלבון רקומביננטי מטוהרים H בין vitronectin, איגוד זיקה הוערכה באמצעות ביו-שכבה אינטרפרומטריה. החשיבות הביולוגית של הכריכה של vitronectin לחלבון H על פני תא החיידק תוך התחמקות של התגובה החיסונית מארח אושר שימוש assay ההתנגדות של סרום עם נורמלי, מדולדל vitronectin בנסיוב אדם. חשיבותה של vitronectin ב הדבקות חיידקים נותחו באמצעות שקופיות זכוכית עם או בלי ציפוי vitronectin, ואחריו צביעת גראם. לבסוף, חיידקי הדבקה על תאי אפיתל מכתשי אדם monolayers נחקר. הפרוטוקולים המתוארים כאן ניתן להתאים בקלות במחקר של כל המינים חיידקי של ריבית.

מבוא

Vitronectin (Vn) הוא גליקופרוטאין אנושי חשוב מעורב בשמירה על הומאוסטזיס באמצעות התקנה של מערכת fibrinolytic. Vn מתפקד גם כרגולטור המשלים על ידי עיכוב מסלול המשלים מסוף במהלך היווצרות מורכבות C5b6-7, C9 הפילמור. מספר פתוגנים חיידקיים הוכחו לגייס Vn אל פני השטח של התא, כאמצעי2,1,התצהיר המשלים התנגדות3. בנוסף, Vn מתפקד מולקולה "כריך" בין חיידקים, המארח תאים אפיתל רצפטורים, הדבקות ובכך קידום הפנמה של פתוגנים2,4,5. איגוד של Vn השטח תא החיידק מתווך על ידי לחלבונים אחרים לא מזוהה כיום. מלא שחקרתי את תפקיד פונקציונלי Vn-איגוד של התחמקות של התגובה החיסונית צינור של ולכן ידרוש זיהוי של חלבונים Vn-גיוס.

השלב הראשוני לזיהוי. Vn-מחייב חלבונים הוא כדי לבדוק אם. חיידק עניין באפשרותך לאגוד מטוהרים Vn-מיכשור היא שיטה נוחה וישירה כדי לקבוע אם Vn מאוגד לתאים הפתוגן. במחקר זה, אנחנו העריכו את הכריכה של Vn שונים Haemophilus influenzae סוג f (Hif) מבודד קליניים6. השיטה המתוארת כאן היא כמותית, והוא יכול לשמש כדי להבדיל את קיבולת איגוד של מגוון רחב של זני חיידקים. במחקר הקודם, אנחנו מאופיין חלבון H (PH) של Hif כמו חלבון מחייב Vn7. לפיכך, במחקר הנוכחי, הפוטנציאל Vn-איגוד של מוטציות (WT) Hif פראי-סוגlph Hif M10Δ הושוו באמצעות פרוטוקולים המתואר.

ברגע נקבע כי. חיידק נקשר Vn, השלב השני הוא לאפיין את פרוטאום השטח על מנת לזהות פוטנציאל Vn-מחייב חלבונים. מגוון רחב של גישות יכול לשמש למטרה זו,8,9, אך הללו לא שתוארו בדו ח זה. השיטה המתאימה ביותר לבחינת אינטראקציות חלבון-חלבון היא recombinantly אקספרס שנבחר פני שטח חלבונים חיידקי ב e. coli ולטהר מאת כרומטוגרפיית זיקה. כאן, אנו משתמשים PH ואינטראקציה המולקולרי שלה עם Vn כדי להמחיש את השיטה. אינטראקציות בין PH רקומביננטי Vn מאופיינים באמצעות מקושרים-אנזים immunosorbent assay (אליסה)7 וטכניקה ללא תווית שפותחו לאחרונה המכונה ביו-שכבה אינטרפרומטריה (בלי)10,11. בעוד ELISAs יכול לשמש כדי לאשר אינטראקציות חלבון-חלבון, רבנות בלי מספק נתונים מפורטים לגבי הפרמטרים קינטי של האינטראקציות.

ללמוד את תפקיד פונקציונלי Vn הדבקות חיידקים, שני מבחני שונים יכול להיות מנוצל. הבדיקה הראשונה המתוארת כאן היא מדידה ישירה של חיידקי ההקפדה משטחי זכוכית מצופים Vn, בעוד וזמינותו השני בוחן את הדבקות על פני השטח של תאים אפיתל. הבדיקה הראשונה, שקופיות זכוכית היו מצופים Vn, הכריכה של WT או מוטציה Hif זנים הוערכה על ידי גראם מיקרוסקופ. טכניקה זו מבדיל בקלות חיידקים מבוססת על היכולת לאגד Vn12. הידבקות חיידקים בתרבית של תאים ואז נותחו על ידי הוספת חיידקים בתרבית על גבי טפט של סוג II מכתשי תאים אפיתל; מצורף חיידקי הוערכה על ידי ספירת מספר המושבה יוצרי יחידות (CFUs). חיידקים מודבקת למביטה יכול להיות מכובד ב נוכחות או היעדרות של Vn4,13.

התפקיד של רכישת Vn בהתנגדות סרום חיידקי הוערך באמצעות הרג סרום assay (כלומר, פעילות אחרים סרום). כדי להעריך את המשמעות של רכישת Vn בהתנגדות סרום, פעילות אחרים של סרום מדולדל Vn (VDS) נמשל עם זה של נסיוב אדם נורמלי (NHS). השיטה המשמשת ברצון מבדיל Vn-איגוד נגד חיידקים מחייב מבוסס על התנגדות סרום. השתמשנו בשיטה זו כדי ללמוד את התפקיד של Vn במחתרת סרום של פתוגנים חיידקיים מספר4,12.

שיטות רבות דווחו ללמוד אינטראקציות פתוגן-פונדקאי. כאן, אנו מתארים את ערכה של פרוטוקולים של ניתן להתאים בקלות במחקר של כל פתוגן כדי להעריך את התפקיד של Vn ב פתוגנזה. בדקנו פרוטוקולים אלה באמצעות פתוגנים שונים ולאחר Hif נבחר כדוגמה עבור דוח זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. ניתוח של Vn כמו ליגנד חלבון משטח חיידקי

  1. זיהוי Vn-איגוד על פני השטח חיידקים באמצעות cytometry זרימה
    הערה: ב cytometry זרימה, היינו בצד פיזור ופיזור קדימה שער אירועים חיוביים. כדי לבחון את האינטראקציות עם Vn, מבודד Hif קליניים (n = 10)7 נבחרו יחד עם e. coli BL21 (DE3) כפקד שלילי (איור 1א').
    1. תרבות Hif קליניים מבודד במדיום אינפוזיה (BHI) המוח ללב, בתוספת 10 µg/mL NAD ו המין ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות-200 סל ד. להשתמש תרבות e. coli14לוריא-Bertani בינונית. הקציר Hif בשלב אמצע יומן (OD600 = 0.3)15, ו resuspend את החיידקים בתוך באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS), pH 7.2, המכיל 1% (w/v) אלבומין שור (BSA) (מאגר חסימה; PBS-BSA). להתאים את המתלים 109 CFU/mL.
    2. להעביר את aliquots המכיל 5 x 106 CFU צינורות סיבוב המדרגה פוליסטירן (12 x 75 מ מ2) 5 מ"ל ולהוסיף 1 מ"ל של מאגר חסימה. Centrifuge את המתלים ב 3,500 × g בטמפרטורת החדר (RT)16 במשך 5 דקות כדי הצניפה החיידקים ולאחר מכן תשאף היטב כדי להסיר את תגובת שיקוע מבלי להפריע בגדר.
    3. Resuspend כדורי חיידקי עם μL 50 החסימה מאגר המכיל 250 ננומטר Vn דגירה הדגימות עבור 1 h RT מבלי לרעוד. לאחר דגירה, גלולה את החיידקים על ידי צנטריפוגה ב x 3,500 g למשך 5 דקות ולאחר מכן לשטוף את כדורי שלושה זמני באמצעות PBS והשלבים צנטריפוגה דומה.
    4. כדי בגדר חיידקי, להוסיף 50 μL של ראשי כבשים נגד Vn polyclonal נוגדנים (pAbs)-מטריים דילול ב- PBS-BSA. דגירה ההשעיה עבור h 1-RT, ולאחר מכן לשטוף את החיידקים שלוש פעמים עם PBS להסיר נוגדנים לא מאוגדים (כפי שמתואר בשלב 1.1.3).
    5. לאחר מכן, הוסף μL 50 של PBS-BSA המכיל fluorescein isothiocyanate (FITC)-מצומדת pAbs כבשים נגד חמור (דילול מטריים) ואת תקופת דגירה-RT של h 1 בחושך.
    6. הכן פקד ריק על ידי המקננת חיידקים עם חסימת מאגר בלבד ולא pAbs ללא Vn.
    7. רוחצים חיידקים שלוש פעמים עם 1 מ"ל מאגר החוסמים את גלולה התליה על ידי צנטריפוגה, כמתואר בסעיף 1.1.2. לבסוף resuspend בגדר חיידקי עם 300 µL ל- PBS, לנתח ידי cytometry זרימה7.
  2. אליסה ניתוח של אינטראקציה בין PH רקומביננטי Vn
    הערה: בקרת צריך להיכלל כדי לא לכלול איגוד לא ספציפית. חלבון Factor H (FH) או מחייב C4b אנושי (C4BP) משמשים בפקדים חיוביים ושליליים, בהתאמה.
    1. לדלל כל אחד החלבונים האנושית (Vn, FH ו C4BP) בנפרד ל- 50 nM, טריס-HCl, pH 9.0 (ציפוי מאגר). לוותר על 100 µL של חלבון פתרון כל טוב של צלחת microtiter Polysorp. הצלחות עם המכסה סגור ואחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה (16 שעות) כדי להקל את הנייח של חלבון על גבי צלחת microtiter בארות.
    2. למחוק את הפתרון מהצלחת microtiter על-ידי הטיית במהופך מעל הכיור ולשטוף הבארות שלוש פעמים עם 300 µL של PBS/טוב. לחסום את הבארות מצופה עבור h 1 RT עם PBS המכילה 2.5% (w/v) BSA (PBS-BSA).
    3. לאחר הסרת הפתרון חסימה, לשטוף הבארות שלוש פעמים עם 300 µL ל- PBS המכילה 0.05% (v/v) Tween 20 (PBST) לכל טוב. להוסיף 100 µL של 50 ננומטר רקומביננטי PH שלו מתויג לדגימת כל טוב ואני תקופת דגירה של h 1-RT. בבארות שליטה, להוסיף µL רק 100 של PBS-BSA.
      הערה: הגן lph קידוד ה-PH מ Hif היה מוגבר על ידי ה-PCR, משובטים לתוך הווקטור ביטוי pET26b המוסיפה 6 × שלו תג-קצה קרבוקסילי של החלבון ביטוי. וקטור recombinant הפכה e. coli BL21(DE3) לביטוי. Ni-נ שרף שימש לטהר את חלבון רקומביננטי15.
    4. לבטל את הפתרון חלבון ולהסיר את החלבונים לא מאוגד ע י שטיפת הבארות שלוש פעמים עם 300 µL של PBST לכל טוב. להוסיף 100 µL של PBS-BSA המכיל חזרת peroxidase (HRP)-מצומדת pAbs אנטי שלו (1:10, 000 דילול) ואת תקופת דגירה של h 1-RT.
    5. להכין 20 מ מ פתרון A על ידי המסת tetramethylbenzidine בריכוז של 5% מתנול אצטון ו- 45%. כדי להכין פתרון B, להמיס 19.2 גר' חומצת לימון ב 1,000 מ ל H2O, להתאים את רמת ה-pH ל 4.25 על-ידי הוספת קו ולאחר מכן להוסיף 230 µL של 30% H2O2. לאחסן שני פתרונות בחושך-RT. לפני השימוש, מערבבים µL 500 של פתרון B עם 9.5 מ של פתרון A להכין ריאגנט לזיהוי את אליסה.
    6. לשטוף את הבארות שלוש פעמים עם 300 µL של PBST לאדם טוב, לזהות קומפלקסים אנטיגן-נוגדן על-ידי הוספת µL 100 של ריאגנט לזיהוי אליסה מכל קידוח.
    7. להוסיף 50 µL של 1 מ' H2אז4/well כדי לעצור את התגובה. למדוד את הצפיפות האופטית של הבארות-450 nm באמצעות קורא microplate.
  3. חקר האינטראקציה קינטיקה של recombinant PH, Vn באמצעות רבנות בלי
    1. לשתק Vn אנושי על חיישנים אמין-תגובתי באמצעות את אמין צימוד השיטה, על פי הנחיות היצרן11.
    2. באמצעות PBS, באופן סדרתי לדלל את ליגנד (רקומביננטי PH) מ- 0 4 מיקרומטר, להעביר את הפתרונות וכתוצאה מכך צלחת microtiter שחור 96-ובכן, שטוח התחתונה. הפעל את הניסוי ב 30 ° C באמצעות מכשיר מתה על17.
    3. לטעון את התיקיה data בתוכנה מתה על ניתוח נתונים. בחר באפשרות 'החיישן בבחירה' . לאחר מכן, בחר 'הפניה טוב' (חיישן מצופים Vn ב- PBS) עבור חיסור.
    4. בחר 'יישור ציר y בסיסית' ובחר 'interstep תיקון וליישר להתאחדות'. הקש 'תהליך נתונים' זה ייפתח אוטומטית בכרטיסיה ' ניתוח '.
    5. בכרטיסייה ' ניתוח ', בחר באפשרות 'האגודה ו דיסוציאציה' תחת פריסטלטיות. בחר את הדגם ' איגוד 1:1, התאמה גלובלית ". הקש 'להתאים עקומה' , ייצוא התאמת נתונים17.

2. אפיון התפקיד של Vn המותרים של חיידקי

  1. מחקר של חיידקי ההקפדה משטחי זכוכית מצופים Vn
    1. להכין פתרון 2 µg/mL של Vn PBS ב ו- pipet 10 µL של פתרון זה על גבי מיקרוסקופ זכוכית מחליק כמו טיפה אחת. לאפשר הירידה להתייבש על השקופית למשך 30 דקות ב- RT. מעיל שקופית עם אלבומין אנושי (HSA) כפקד שלילי.
    2. לשטוף את השקופיות זכוכית מצופים חלבון שלוש פעמים בטבילת השקופיות לשתי שניות בתוך המכיל PBS להסיר את עודף חלבון ללא ציפוי. הוסף 20 מ של תרבות Hif טריים (שמתואר בשלב 1.1.1) לתוך צלחת פטרי פלסטיק סטרילית ויציפו את Vn- / זכוכית מצופים HSA שקופיות במדיום תרבות. דגירה כל המנות של 37 ° C עבור 1 h ברעידות-סל ד 20.
      הערה: Hif M10, Hif M10Δlph גדלו במדיום BHI נוזלי או על פלטות אגר שוקולד. המדיום של המוטציה lph היה בתוספת µg/mL 10 kanamycin15.
    3. לאחר דגירה, להסיר כל חיידק לא מאוגד על-ידי השוקע השקופיות שלוש פעמים ב גביע מלא עם PBS. דמיינו חיידקים על ידי צביעת גראם, כמתואר.
      1. הסר PBS עודף מכל שקופית על-ידי הטיית זה נוגע בקצה על גבי נייר טישו. מילה נהדרת השקופיות למשך 3-5 דקות-RT, ותקן חיידקים מודבקת על-ידי העברת כל שקופית 3 פעמים מעל להבה.
      2. להחזיק את השקופית בקצוות עם שתי אצבעות על מגש מוכתמים, ולאחר מכן להוסיף 3-4 טיפות (200 – 300 µL) של 2.3% קריסטל ויולט פתרון. חכה 60 s ולאחר מכן לשטוף השקופיות תחת זרם עדין של ברז מים עבור 3-4 s.
      3. להוסיף 3-4 טיפות של 0.33% פתרון יוד על השקופיות. חכה 1 דקות ולאחר מכן לשטוף את השקופית תחת זרם עדין של מי ברז. יבש בזהירות את השקופיות באמצעות נייר סופג.
      4. להוסיף 3-4 טיפות של פתרון decolorizing המכיל אלכוהול איזופרופיל 75% ו-25% אצטון אותן לשקופית. לאחר 5-10 s, יש לשטוף את השקופית תחת זרם עדין של מי ברז.
      5. להוסיף 3-4 טיפות (200 – 300 µL) של הפתרון carbolfuchsin בסיסי. חכה 1 דקות ולאחר מכן לשטוף את השקופיות תחת זרם עדין של מי ברז. יבש את השקופיות בעזרת נייר סופג.
      6. דמיינו את החיידקים תחת מיקרוסקופ אור, בחירה של העדשה המטרה שמן-טבילה ב- 100 X הגדלה18. להשוות את דבקותה של Hif WT וחיידקים המוטציות על משטחים Vn, HSA-מצופה זכוכית.
  2. מחקר של הדבקות תלויי-Vn של חיידקים בתאי אפיתל
    הערה: assay הדבקות יעיל זה היה בשימוש שלנו4,הקודם מחקרים7.
    1. תרבות A549 תאים (סוג II מכתשי אפיתל תאים) בבקבוקון תרביות רקמה 75 ס מ2 בינונית F12 בתוספת 10% עגל עוברית (vol/כרך) סרום (FCS) (בינוני מלא) ו- 5 גנטמיצין µg/mL. דגירה את הבקבוק בתוך אינקובטור עם 5% CO2 ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 ימים עד 80% confluent (confluency יכול להיות מוערך דמיין כיסוי משטחים על ידי תאים באמצעות מיקרוסקופ הפוכה). ארבעת השלבים הבאים מתארים כיצד להתכונן בתאי אפיתל19,assay20.
      1. לשטוף את טפט תא בתוך הבקבוק פעמיים עם 20 מ של PBS מאת מתערבל עדין. כדי לנתק את התאים מפני השטח את הבקבוק, להוסיף 2 מ"ל של התא ניתוק אנזים פתרון, דגירה. הבקבוק למשך 5 דקות ב 37 º C. הקש את הבקבוק עם כף היד שלך כדי לנתק את כל התאים מפני השטח פלסטיק. פיפטה למעלה ולמטה כמה פעמים כדי לפזר תא גושים.
      2. להוסיף מ 18 ל F12 שלם בינוני הבקבוק ולהעביר את המתלים התא כולו צינור בז 50-mL סטרילי. Centrifuge התליה תא עבור 5 דקות ב x 200 גר' ב- RT וזורקים את תגובת שיקוע. Resuspend בגדר תא ב- 10 מ"ל של מדיום מלאה F12.
      3. להסיר µL 10 של התליה תא למקם אותו בצינור גלאים, ולאחר מכן להוסיף 90 µL של פתרון Trypan blue. טען את הדגימה hemocytometer (עומק 0.1 מ מ) לאחר הנחת את coverslip.
      4. לספור את כל התאים קיימא באזורים A, B, C ו- D (כל שדה מכיל 16 ריבועים, כל ריבוע יש אזור של 0.0025 מ מ2), ואז לחשב את המספר הממוצע של תאים ([A + B + C + D] / 4). לחשב את מספר תאים למיליליטר באמצעות המשוואה הבאה:
        תאים למ"ל קיימא = ממוצע תא ספירת × 104 × דילול גורם20.
        הערה: כאן, הגורם דילול הוא 10.
      5. לדלל התליה תא ל 5.0 x 103 תאים למ"ל באמצעות מלאה גנטמיצין בינוני המכיל 5 µg/mL. לוותר על μL 500 של השעיה תא לתוך כל טוב של צלחת התרבות התא 24-. טוב. דגירה את הצלחת ב 37 ° C 5% CO2 עד התאים הם 90% confluent.
    2. לפני זיהום חיידקי, להסיר את המדיום מן הבארות, להוסיף F12 בינונית (ללא FCS) ולאחר מכן דגירה בין לילה ב 37 º C.
    3. לשטוף את טפט תא שלוש פעמים עם µL 500 ל- PBS במקום RT. הצלחת על קרח ולהוסיף µL 100 של טרום מקורר בינוני F12 המכיל 10 µg/mL צלחת Vn-Incubate ב 4 ° C עבור 1 h. שליטה וולס, הוסיפו רק F12 בינוני.
    4. לאחר דגירה, לבטל את הפתרון על-ידי pipetting, לשטוף שכבת תאים פעמיים עם 1 מ"ל של PBS ב RT. Resuspend תרבות של Hif M10 בוגר טרי (שלב 1.1.1) F12 בינוני (2 × 108 CFU/mL). להוסיף 100 µL של ההשעייה חיידקי מכל קידוח, דגירה את הצלחת. בשביל 2 h ב- 37 מעלות צלזיוס.
      הערה: כל טוב מכיל כ5 A549 2 x 10 תאים. זיהום, 2 x 107 CFU חיידקי נוספו, המתאימים ריבוי של זיהום של 100.
    5. הסר את המדיום על-ידי pipetting ולשטוף בתאי אפיתל A549 שלוש פעמים עם PBS. להוסיף µL 50/טוב של פתרון ניתוק התא, דגירה את הצלחת. בשביל 5 דקות ב 37 º C.
    6. לאחר מכן, להוסיף 50 µL F12 בינוני מלא בכל טוב כדי לעצור את התגובה אנזימטיות. העברה בתאי אפיתל (≈100 μL [קרי, האחסון כולו]) מבאר כל שפופרת זכוכית 6-mL המכיל 4 חרוזי זכוכית. Lyse התאים ב RT מאת vortexing למשך 2 דקות.
    7. לדלל 10 µL של התא lysate 100-fold על-ידי הוספת 10 µL של lysate µL 990 F12 בינוני. צלחת µL 10 המדגם מדולל על צלחת אגר שוקולד.
    8. דגירה של צלחת אגר שוקולד ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה, ואז לספור את המושבות. כל מושבה מייצגת CFU אחד.

3. ניתוח ההתנגדות תלויי-Vn לפעילות אחרים בנסיוב אדם

  1. NHS רכישה ממקור מסחרי. להכין VDS כמו שתואר לעיל12. לחדש את VDS עם 180 ננומטר Vn אשר שווה ל Vn נוכח NHS.
  2. הכן סרום חום-לא פעיל (שלו) על ידי חימום NHS ב 56 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי להשבית חלבוני המשלים.
    הערה: ריכוז אופטימלי סרום (5%) ואת זמן הדגירה (15 דקות) עבור וזמינותו שתואר בשלבים 3.3 – 3.7 היו נחושים מדעית Hif15; פרמטרים אלה יכול להשתנות עבור אחרים פתוגנים חיידקיים.
  3. התרבות חיידקים (בתיק הזה, Hif M10 ו את המוטציה Hif M10Δlph) לשלב יומן אמצע (OD600 = 0.3). גלולה חיידקים על ידי צנטריפוגה ב x 3,500 g למשך 10 דקות.
  4. Resuspend בגדר חיידקי עם נפח 1 דקסטרוז ג'לטין Veronal מאגר (DGVB++; pH 7.3) המכילה 2.5% (w/v) גלוקוז, 2 מ מ MgCl2, CaCl 0.15 מ מ2ו- 0.1% (wt/כרך) ג'לטין.
  5. להוסיף 1.5 x 103 CFU של חיידקים כדי 100 µL של DGVB++ המכילה 5% סרום (NHS, שלו, ב- VDS, או VDS + 180 ננומטר Vn). דגירה המדגם ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ברעידות-300 סל ד.
  6. הסר את µL 10 aliquot תערובת התגובה ב 0 min (דוגמה0 T) ו- 15 דקות (מדגםt T) וצלחת על שוקולד אגר. דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  7. לאחר דגירה, לספור את המושבות המופיעים על הצלחת. לחשב האחוזים של חיידקים הרג12 באמצעות המשוואה הבאה: (CFU-Tt) / (CFU ב T0) × 100.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

Vn-איגוד אל פני השטח של חיידקים נקבע על ידי cytometry זרימה. כל Hif מבודד קליני נבדק במחקר זה גייס Vn אל פני השטח של התא. אין אינטראקציה של Vn עם משטח תאים נצפתה לזן בקרה שלילית של e. coli (איור 1א'). כפי שמוצג באיור 1B, PH הוא חלבון Vn-איגוד מרכזי על פני השטח של תאים Hif. עקדת Vn מאת המתח WT Hif M10 גרם משמרת האוכלוסייה, ואילו Hif M10Δlph לא היה מאוגד Vn והופיע דומה אל הפקד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פתוגנים חיידקיים לגייס Vn השטח תא ולנצל את הרגולטור המשלים כדי למנוע התצהיר המשלים גורמים והשלמה של קרום התקפה מורכבים2. Vn משמשת גם כחברת מולקולה גשר בין חלבונים חיידקי משטח קולטני פני השטח של התא המארח, ובכך מאפשר פתוגנים לדבוק פני השטח של תאי אפיתל, לאחר מכן לתווך הפנמה. במחקר זה, אנו מתארים את הפרוטוקולים יכול לשמש כדי להעריך i) איגוד של Vn פני השטח של תאים חיידקיים, אינטראקציות חלבון-חלבון ii), זיקה קבועים ולאחר iii) תפקיד פונקציונלי Vn במתן התנגדות סרום ושיפור של הדבקות על פני השטח של התאים ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים כספיים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים קרן של אנה אדווין ברגר, לארס Hierta, רוצה שתיכנס לשם ואת Edla יוהנסון קרן, המועצה למחקר רפואי שוודי (להעניק מספר K2015-57 X-03163-43-4, www.vr.se), קרן סרטן באוניברסיטה חולים במאלמו, החברה Physiographical (קרן של Forssman), ולא של מועצת המחוז סקונה ומחקר ופיתוח.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תרמומיקסטר 1.5 מ"לEppendorf5355שייקר חימום וקירור בלוק יבש
5 מ"ל פוליסטירן צינור תחתון עגול BD Falcon60819-13812 & פעמים; סגנון 75 מ"מ
5% CO2 מסופק חממה תרמו סיינטיפיק 
צינור פוליסטירן 6 מ"ל תחתון עגול VWR89000-47812 & פעמים; סגנון 75 מ"מ עם מכסה
24 בארות לוחותBD Falcon08-772-1Hדרגת תרבית תאים
30% מי חמצן (H2O2) תמיסתSigma-AldrichH1009-100MLניתוח מעבדה דרגה
75 ס"מ2 בקבוק תרבית רקמותBD FalconBD353136מאוורר
צלחת תחתונה שטוחה שחורה 96 היטבGreiner Bio-One655090תרבית רקמות מטופלת ומיקרו; לוחות שחורים שקופים
A549 Cell Lineסיגמא-אולדריץ'86012804-1VL
אנזים לניתוק תאים (Accutase) Sigma-AldrichA6964-500MLבדרגת תרבית תאים
Pall Life Science18-5095חיישן לחלבון משותק על ידי צימוד אמינו 
אצטוןVWR97064-786בדרגת ניתוח
(BSA)Sigma-AldrichA2058מתאים לתרבית תאים
נייר תנבי VWR28511-007
אינטרפרומטר ביו-שכבתיPall Life ScienceFB-50258ציוד מדידת אינטרפרומטריה דו-שכבתית
תמיסת קריסטל סגולSigma-AldrichHT90132-1L
C4BP (חלבון מחייב C4b)Complement Technology, Inc.A109נקנה כנוזל קפוא בצורת
סידן כלורי (CaCl2)Sigma-AldrichC5670-500G
תמיסת קרבול-פוקסיןSigma-AldrichHT8018-250ML
חומצת לימוןSigma-Aldrich251275-500Gבדרגה של האגודה האמריקאית לכימיה (ACS)
Sigma-Aldrich75482-250ML-F
E. coli מארח (E. coli BL21)Novagen69450-3מארח ביטוי חלבון
F12 בינוניSigma-AldrichD6421בדרגת תרבית תאים
 BD Biosciences651154ציון ניתוח תאים ליישומי מחקר 
סרום עגל עוברי (FCS)Sigma-Aldrich12003Cמתאים לתרבית תאים
סרום אנושי רגיל (NHS)Complement Technology, Inc.NHSPooled Human Serum
FITC מצומד חמור נוגדנים נגד כבשים AbD SerotecSTAR88FPolyclonal
GentamicinSigma-AldrichG1397תרבית תאים בדרגת
גלוקוזSigma-AldrichG8270-1KG
ג'לטיןSigma-AldrichG9391מתאים לתרבית תאים
HemocytometerMarienfeld640210
נוגדנים מצומדים HRP נגד תג שלוAbcamab1269פוליקלונלי
HComplement Technology, Inc.A137נקנה כנוזל קפוא בצורת
C4BPComplement Technology, Inc.A109תמיסה קפואה
אלבומין סרום אנושיסיגמא-אולדריץ'A1653-10Gאבקה ליופילית
עמודת שרף זיקה היסטידין (HisTrap HP)GE Health Care Life Science17-5247-01עמודות ארוזות מראש עם Ni Sepharose
PHמבוטא ומטוהר באופן רקומביננטי במעבדה שלנו
תמיסת יודSigma-AldrichHT902-8FOZ
מתנולVWRBDH1135-1LPכיתה ניתוח
  מיקרוסקופאולימפוסIX73מיקרוסקופ הפוך
שקופיות מיקרוסקופSigma-AldrichS8902רגיל, גודל 25 מ"מ וזמנים; 75 מ"מ 
מגנזיום כלוריד (MgCl2)Sigma-AldrichM8266-1KG
פלסמיד מכיל מסוף C 6x His-tag על עמוד השדרה (pET26(b)))Novagen69862-3וקטור DNA
פוליסורב לוחות מיקרוטיטר Sigma-AldrichM9410עבור ELISA
אשלגן הידרוקסיד (KOH)Sigma-Aldrich6009האגודה האמריקאית לכימיה (ACS) כיתה
נוגדנים Vn כבשים אנטי-אנושייםAbD SerotecAHP396שייקר פוליקלונלי
 סטיוארט סיינטיפיקSTR6פלטפורמת שייקר
תרבית רקמות BDFalcon317516775 ס"מ2
  תרמומיקסר Sigma-AldrichT3317שייקר חימום וקירור בלוק יבש
TetramethylbenzidineSigma-Aldrich860336-100MGELISA כיתה
ויטרונקטין (Vn) מפלזמה אנושיתSigma-AldrichV8379-50UGכיתה תרבית תאים
BBD6220 אנושי חיישני AR2G אלבומין סרום בקר תמיסת הסרת צבע ציטומטר זרימה גורם אנושי מתויג שלו

מקורות

  1. Singh, B., Su, Y. C., Riesbeck, K. Vitronectin in bacterial pathogenesis: a host protein used in complement escape and cellular invasion. Mol. Microbiol. 78 (3), 545-560 (2010).
  2. Hallstrom, T., et al. Conserved Patterns of Microbial Immune Escape: Pathogenic Microbes of Diverse Origin Target the Human Terminal Complement Inhibitor Vitronectin via a Single Common Motif. PloS one. 11 (1), 0147709(2016).
  3. Su, Y. C., Hallstrom, B. M., Bernhard, S., Singh, B., Riesbeck, K. Impact of sequence diversity in the Moraxella catarrhalis. UspA2/UspA2H head domain on vitronectin binding and antigenic variation. Micro. Infect. 15 (5), 375-387 (2013).
  4. Singh, B., et al. A fine-tuned interaction between trimeric autotransporter haemophilus surface fibrils and vitronectin leads to serum resistance and adherence to respiratory epithelial cells. Infect. Immun. 82 (6), 2378-2389 (2014).
  5. Kohler, S., et al. Binding of vitronectin and Factor H to Hic contributes to immune evasion of Streptococcus pneumoniae. serotype 3. Thromb. haemostasis. 113 (1), 125-142 (2015).
  6. Onelli, E., Citterio, S., O'Connor, J. E., Levi, M., Sgorbati, S. Flow cytometry, sorting and immunocharacterization with proliferating cell nuclear antigen of cycling and non-cycling cells in synchronized pea root tips. Planta. 202 (2), 188-195 (1997).
  7. Al-Jubair, T., et al. Haemophilus influenzae Type f Hijacks Vitronectin Using Protein H To Resist Host Innate Immunity and Adhere to Pulmonary Epithelial Cells. J. Immunol. 195 (12), 5688-5695 (2015).
  8. Martinez-Martin, N. Technologies for Proteome-Wide Discovery of Extracellular Host-Pathogen Interactions. J. Immunol. Res. 2017, 2197615(2017).
  9. Boleij, A., Laarakkers, C. M., Gloerich, J., Swinkels, D. W., Tjalsma, H. Surface-affinity profiling to identify host-pathogen interactions. Infect. Immun. 79 (12), 4777-4783 (2011).
  10. Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Anal. Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).
  11. Sultana, A., Lee, J. E. Measuring protein-protein and protein-nucleic Acid interactions by biolayer interferometry. Cur. Prot. Prot. Sc. 79, 11-26 (2015).
  12. Su, Y. C., et al. Haemophilus influenzae acquires vitronectin via the ubiquitous Protein F to subvert host innate immunity. Mol. Microbiol. 87 (6), 1245-1266 (2013).
  13. Ronander, E., et al. Nontypeable Haemophilus influenzae adhesin protein E: characterization and biological activity. J. Infect. Dis. 199 (4), 522-531 (2009).
  14. Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D'Ari, R. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth. J. Bact. 189 (23), 8746-8749 (2007).
  15. Fleury, C., et al. Identification of a Haemophilus influenzae factor H-Binding lipoprotein involved in serum resistance. J. Imunol. 192 (12), 5913-5923 (2014).
  16. Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Anal. Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).
  17. Rich, R. L., Myszka, D. G. Higher-throughput, label-free, real-time molecular interaction analysis. Anal. Biochem. 361 (1), 1-6 (2007).
  18. McNamara, G., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Microscopy and image analysis. Current protoc. Hum. Genet. , Chapter 4 Unit 4 4(2005).
  19. Lieber, M., Smith, B., Szakal, A., Nelson-Rees, W., Todaro, G. A continuous tumor-cell line from a human lung carcinoma with properties of type II alveolar epithelial cells. International J. Canc. 17 (1), 62-70 (1976).
  20. Foster, K. A., Oster, C. G., Mayer, M. M., Avery, M. L., Audus, K. L. Characterization of the A549 cell line as a type II pulmonary epithelial cell model for drug metabolism. Exp. Cell Res. 243 (2), 359-366 (1998).
  21. Su, Y. C., et al. Haemophilus influenzae P4 Interacts With Extracellular Matrix Proteins Promoting Adhesion and Serum Resistance. J. Infect. Dis. 213 (2), 314-323 (2016).
  22. Singh, B., Al-Jubair, T., Morgelin, M., Thunnissen, M. M., Riesbeck, K. The unique structure of Haemophilus influenzae protein E reveals multiple binding sites for host factors. Infect. Immun. 81 (3), 801-814 (2013).
  23. Vellaiswamy, M., Campagna, B., Raoult, D. Transmission electron microscopy as a tool for exploring bacterial proteins: model of RickA in Rickettsia conorii. New Microbiolog. 34 (2), 209-218 (2011).
  24. Pinne, M., Haake, D. Immuno-fluorescence assay of leptospiral surface-exposed proteins. J. Vis. Exp. JoVE. (53), (2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

ELISABio layer InterferometryHHaemophilus influenzae

מאמרים קשורים