הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

דרך אמין להערכת זרע נביטה, תרדמת, ותמותה בתנאי שדה

10.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54663

⸱

6 בנובמבר 2016

 ,  ,  , 
1Department of Horticulture and Crop Science, Ohio State University, 2Department of Ecology and Evolutionary Biology, University of Kansas, 3Department of Biology, Washburn University

במאמר זה

סיכום

כאן אנו מציגים פרוטוקול להערכת שאירים זרע, נביטה תרדמת בתנאי שדה באמצעות קבור, רצועות זרע שכותרתו כלוריד tetrazolium בדיקות כדאיות (ט"ז).

תקציר

אנו מתארים טכניקות לקירוב דינמיקת בנק זרעים לאורך זמן באמצעות Helianthus annuus כדוגמה למין מחקר. ניתן לקפל ולהדביק רצועות של בד פוליאסטר חדיר ודבק לבניית רצועה של תאים המכילים זרעים ומידע מזהה, תוך מתן אפשרות למגע עם תשטיף אדמה, מים, מיקרואורגניזמים וטמפרטורת הסביבה. רצועות עשויות להיבנות עם מגוון רחב של מספרי תאים וגדלים ולאפשר לחוקר לאכלס מגוון גנוטיפים בתוך מין יחיד, מינים שונים או זרעים שחוו טיפולים שונים. בניגוד לחבילות זרעים בודדות, רצועות נשלפות ביתר קלות כיחידה. בעוד שניתן לכלול מנות משוכפלות בתוך רצועה, רצועות שונות יכולות לשמש כבלוקים או שניתן לאחזר אותן בזמנים שונים לצורך תצפית על התנהגות הזרעים לאורך זמן. השתמשנו באקדח דבק בטמפרטורה גבוהה כדי לתחום תאים ואטמנו את הרצועות לאחר הכנסת הזרע והתגים המזהים את הבלוק וזמני ההסרה. לאחר מכן נקברו רצועות הזרעים בשדה בעומק הרצוי, כאשר המיקום סומן להסרה מאוחרת יותר. טורפי בעלי חיים מתחפרים הודרו למעשה על ידי שימוש בכיסוי של בד חומרה מרשת מתכת על פני האדמה. לאחר מרווח הזמן שנבחר לקבורה, נחפרו רצועות והזרעים הוערכו לנביטה, תרדמה ותמותה. בעוד שלעתים קרובות ניתן להבחין בין זרעים מתים בבירור לבין זרעים חיים לא מונבטים בעין, זרעים רדומים זוהו באופן חד משמעי באמצעות מבחן קולורימטרי סטנדרטי של טטרזוליום כלוריד לכדאיות זרעים.

מבוא

המטרה הכללית של שיטה זו היא להעריך הישרדות זרע ובמהימנות לאורך זמן בתנאי שדה.

בנק זרעי קרקע הם עתודה התפזרו, זרעי קיימא עדיין ungerminated מופצים גם על פני הקרקע, בתוך חול משטח, או בתוך פרופיל הקרקע, אשר עשוי להימשך זמני או במשך שנים רבות 1,2. כאשר שיטות קבורות זרע דומה לזו המוצגת כאן יושמו מחקר 17 שנים באמצעות כמה עשרות מינים, זרעי קיימא נמצאו רבי מהמינים נבדקו 3. תרדמת זרעים היא לחסום זרע נביטה עד השילוב המתאים של תנאי שתיל הישרדות להתעורר 4. נותרים רדומים יכול להרשות זרעים לשרוד בתנאים קשים, כגון טמפרטורות חורף נמוכות, הגבלה מזינה, או בצורה עונתית, עד טריגר חיצוני עבור תרדמת שחרור מאפשר נביטה. מפעיל עבור שחרור תרדמת יכול להשתנות כתוצאה מחשיפת תרכובות קרות, הוארכו שהותירו fזעמם, או תקיפה פיזית על קליפת הזרע דרך שחיקה או במגע עם חומצות הקיבה חיה 5. כרמזי נביטה יכולים להיות סוגים או מינים ספציפיים לעתים קרובות תוצאה של ברירה טבעית בעבר, נביטת זרעים הסתגלותי הוא המתרחש בזמן לא מתאים, ועלול לגרום לתמותת זרע או שתיל או צמיחת שתיל מסכנה. בעוד תרדמת סווגה למספר סוגים על פני המנגנונים של שחרור תרדמת (למשל, תרדמת גופנית, תרדמת פיזיולוגית), 6 תרדמת זרעים נשארת אחד לפחות הבין נושאים בביולוגית צמח. לכן, מחקרים בתחום המאפשרים הערכה על המצב של זרעים בודדים או קבוצות של זרעים בתנאים אקולוגיים רלוונטיים יש כוח הסבר גבוה יותר מענפים פשוט לסמוך על בדיקות נביטת תקן במעבדה.

ניצול של מאפייני זרע ידועים יכול לספק תובנה לתוך המנגנונים של תרדמת. פיקוח על תרדמת זרעים הוא שיתוףmplex, לרבות הבקרה הגנטית של גורמים פיזיולוגיים מורפולוגיים. בעוד הבנה מלאה של הרוחב של מנגנוני תרדמת טרם הובהרה, מודל כללי התפתח, מעורב מערכת יחסים היזון חוזר בין שני ההורמונים הצמחיים Gibberellic החומצה (GA) ו abscisic חומצה (ABA) 7. במודל כללי זו לזרעים עם מרכיב פיסיולוגי התרדמת שלהם, GA משמש אות לשחרור תרדמת, בעוד ABA משמש כדי לשמור על במצב הרדום. השפעות גנטיות אימהיות כמו גם בסביבת הגידול האימהית יכול להשפיע תרדמת ותכונות זרע אחרות, כגון גודל, דרך רקמות שנוצרו אימהי ו -8 אותות התפתחותיים. אימהי שנוצר מבנים חיצוניים (או כיסויי זרע) תהא רשאית להותיר תרדמת, לעיתים בשילוב עם רמזים פיזיולוגיים. מאז כיסויי זרע נגזר אימהי נשלטים על ידי הגנים של הצמח האם, הם עלולים שלא לשקף את ההרכב הגנטי הגרעיני בפועל של הזרע. אנחנו צריכים אותנואד achenes annuus Helianthus מתוך מערך של היברידית יבול-בר חוצה כדי להקניט את השפעות גנטיות העובר לעומת אימהי אלה על מאפייני זרע 9,10. לפיכך, עיצובי מחקר הכוללים מינים שונים, סוגי צלב, או גנוטיפים יכולים ללקט מידע על אקולוגיה וגנטיקה של זרע תרדמת, נביטה והישרדות.

דוגמא חשובה של כמה פנוטיפים נביטה והישרדות זרע יכולים להשפיע דינמיקה באוכלוסייה ניתן לראות אזורי כלאי יבול-בר. בחירה במהלך הביות של צמחי מעובדים תבטל את רוב התרדמת ומפחיתה את יכולתו של זרע לשרוד מחוץ עונת הגידול. עם זאת זרימת גנים, או הכלאה בין הסוגים המעובדים ופרועים באזורים היברידיים יבול-בר יכולה לחדש אללים יבול (או וריאנטים גנטיים) לתוך אוכלוסייה בטבע, עם השפעות אפשריות על דינמיקת בנק זרעים. כלאיים בין קרובים טפחו ופרוע נמצאים פוטנציאל אזורי כלאיים-בר יבול עשוי להחזיקמגוון של פנוטיפים תרדמת ביניים, עם רק כמה פנוטיפים צפויים לשרוד בתנאים מחוץ הטיפוח (למשל, בחודשי החורף) 11.

מטרת כתב היד הזה היא להראות כיצד, בשיטת רצועת קבורת הזרע, אנחנו יכולים להעריך נביטה, תרדמת, והישרדות של מגוון רחב של זני זרעים בתקופות זמן שונים כדי לחקור השונות הטבעיות שלהם בתנאי שדה. בדוגמא שלנו, העסקנו גרעינים מ -15 סוגי צומח פרה היברידי צלב מאז אנו מעוניינים השפעות גנטיות אימהיות העוברות על מאפייני זרע.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. לאסוף זרע ממינים מרובים או מבוקרת צלבים של מין יחיד

הערה: זה זרע למשל בשימוש מ 15 סוגים הדדית בתוך annuus המינים Helianthus (חמניות) באמצעות פרא, היברידי, וסוגי יבול כמו (המייצר זרע) האימהי ההורה.

  1. בסוף עונת הגידול, לאסוף ראשי זרע בוגרים בשקיות שכותרתו. זרע נקי מזרע מוץ ומניחים מעטפות שכותרתו עם סוג צלב הורי בפורמט סטנדרטי (דהיינו אב x האימהית).
  2. זרע גורף יחד במעטפות גדולות באמצעות כמויות שווות של זרע ממספר שווה של סוגי צלב הוריים זהים. לדוגמה, 100 זרעים מתוך 10 סוגים צלב עם אותם הורים אימהי ואבהי. לייבל המעטפות עם זיהוי (סוג צלב) מידע. מעטפות גדולות אלו הם אדונים זרע לשימוש במילוי רצועות קבורה בסעיף 2.
האם אימהי
האם אבהי Wild: WxW F 1: WXC יבול: CXC
Wild: WxW 0% WxW 25% F 1 XW † 50% CxW †
BC: WxF1 או F1xW 12.5% ​​WxBC 37.5% F 1 xBC 62.5% CxBC
F 1: WXC 25% WxF 1 † 50% F 1 XF 1 75% CXF 1 †
F 2: F 1 XF 1 25% WxF 2 50% F 1 XF 2 75% CXF 2
יבול: CXC 50% WXC † 75% F 1 XC † 100% CXC

טבלה 1. t צלב הוריםypes המופק אבקה ביד. סוגי צלב היברידיים יבול-בר חמניות יוצרו עם אבקה ביד לשימוש בניסוי קבורת זרע. מתאים לכל סוגי הצלב, ההורה האימהי המפורטים ראשון וההורה האבהי מפורט שני. סוגי צלב מסומנים † הם חלק זוגות סוג צלב גומלין עם אללים יבול באותה% אבל הורים אימהיים שונים. לוח שפורסם בעבר ב: פייס, BA et al. (2015) 15.

2. יצירת רצועות קבורות זרע מותאמים אישית

הערה: בדוגמא זו, היו לנו שלושה טיפולים להסרת תאריך 15 משכפל, כך אנו נדרשים 45 רצועות כוללות. דוגמה זו משתמשת ב -15 תאים לכל רצועת כך, אנו נדרשים מספיק בד או וכילה פוליאסטר מרושת בסדר לשכן 15, 7 x 10 תאים ס"מ. ראה איור 1.

  1. התחל על ידי חיתוך 20 x 105 ס"מ רצועת בד עבור כל רצועה זרע.
  2. מדוד וסמן תאים, ואז לקפל את הבד לשניים. שימוש בפוh-טמפרטורה אקדח דבק, לאטום אחד קצר (10 ס"מ) בסוף. לאחר הדבק מתקרר מעט, אבל לא לגמרי, לחץ על הצדדים הבד יחד כדי ליצור חותם.
    זהירות: טיפים אקדח דבק ודבק בטמפרטורה גבוהה יכול לגרום לכוויות אם במגע עם העור הוא ממושך.
  3. קווי דבק מהקצה המקופל בקצה הקצר הפתוח בכל סימן תא. לחץ על שני הצדדים הבד יחד לאורך קווי דבק על מנת להבטיח חותמות ללא חורים בין תאים. זרעים הנודדים בין התאים לתרום שגיאה ניסיונית.
    הערה: עכשיו כי תאים נוצרו, בקצה פרש צריך להישאר פתוח ומוכן לקבל זרע, וכן פרטים מזהים שלהם (שם סוג צלב).
  4. אקראי להקצות סוגי צלב זרע תאים עבור כל רצועה.
    1. מלאו תאי זרע עם מספר אחיד של זרעים (20 לכל תא משמשים בדוגמה זו). עבור מדבקות, השתמש סמנים קבעו תעשייתיים על חתך ל-בכושר חצי גן הפלסטיק, כך שהם מסוגליםלעמוד קבורה.
      הערה: שיטות תיוג חלופיות יכולות לשמש.
    2. לאחר כל תא מתמלא זרע התווית שלו, לאטום את תא מיד עם אקדח דבק בטמפרטורה גבוהה. המשך עד הרצועה לזרע כולו אטומה לחלוטין. לייבל רצועה הכוללת בתא הראשון עם לשכפל, לחסום ו / או מידע טיפול.
      הערה: לצורך המחקר שלנו, מאז נאלצנו להסיר את הזמני, בלוקים, ולשכפל רצועות בתוך בלוקים, כללנו את כל המידע הזה.
    3. בדקו אם פערים בין תאים ודבקים במקום לפי צורך לפני שעברתי לרצועה הבאה.

figure-protocol-1
איור 1. סכמטי זרע רצועת קבורה. דוגמה של רצועת קבורה מראה זיהוי סוג צלב לסלוני הפרט. ההורה אימהי מופיע ראשון עם ההורה האבהי המפורט שני. צבעים מצביעים הורות אימהית שונה,עם צהוב פראי, כחול היברידי F 1, ואדום לזריעה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

3. Bury רצועות זרע בתחום

  1. לחפור מגרשים לעומק שצוין רצועות הבית. הקצאת רצועות לבלוקי פרט בו רצועות מסודרות באופן אקראי כדי לאפשר תאריך ההסרה לשמש כזהות עלילת תא הראשית (בדוגמא זו, סוג הצלב) כמו עלילת המשנה בניתוח.
  2. מכסים רצועות עם האדמה. בד חומרת רשת מתכת Cut להיות 10 סנטימטר גדול יותר מגרשים ומניחים על גבי רצועות קבורות. השתמש U-סיכות כדי לאבטח בקצות קצות בד כיסוי בעפר.
    הערה: כיסוי זה מיועד למעט אוכלי זרעים מתחפרים. בתור אפשרות נוספת, מרסר et al. 13 נבנו קבור תיבות של בד חומרה שהקיפו את רצועות הזרע עקב לחץ גופר אינטנסיבי loca בתחומםtion.)
  3. מניח דגלים של המודד צבעוני, להבדיל רצועת תאריכי מיקום והסרה כדי להשלים רשומים כתובים וברור.

4. לחפור רצועות ולהעריך זרע

  1. לחפור רצועות זרע שהוקצו תאריך הסרה נתון. לשמור על הרצועות בסביבת לחה מגניבה עד שהם מגיעים למעבדה שבה הערכת הזרע תתקיים. ניתן להשיג זאת על ידי לפפה את רצועות העיתון הרטוב והצבתם צידנית על הובלה או משלוח בין לילה.
  2. שטוף בץ ואדמה מן הרצועות במים עד רצועות נקיות מספיק שברים הללו חיצוניים לא זרעים מעורפלים.
  3. השתמש במספריים לחתוך תא אחד פתוח בכל פעם. רוזן זרעים מונבטים ולהסיר אותם. רוזן בבירור זרעים מתים (למשל, נרקבו, או זרעים רקוב). מניח זרעי ungerminated על שכותרתו, נייר סופג רטוב פטרי בגודל נוסף להבחין זרעי ungerminated, רדומים, ומתים.
    1. מניחים צלחות פטרי עם ungerminatedזרעים לתוך מערכת תא צמיחת תנאי נביטה סטנדרטיות: 25 ° C / 10 ° C 12 שעות יום / הלילה. אפשר זרעי שבוע לנבוט. כל זה עושה, ולמנות אותן כפי קיימא, אבל ungerminated מאז הם לא נובטים בתנאי שדה.
  4. לאחר הטיפול הקאמרי הצמיחה, מבחן הנותר זרעי ungerminated עבור כדאיות באמצעות כלוריד tetrazolium (ט"ז) 13. כדי להשיג זאת, להמציא פתרון אחוז המתאים TZ עבור מין המחקר באמצעות Handbook AOSA tetrazolium בדיקת 14. בדוגמה זו, פתרון 1% משמש.
    1. חותכים את הזרעים ungerminated לשניים ומניחים מחצית היו העובר האנדוספרם גלויים בצלחת פטרי המכילה פתרון מספיק TZ לכסות את הזרע (זרעים עשויים לצוף, זה בסדר).
    2. מניחים מנות TZ פטרי לתוך להגדיר באינקובטור ב 30 מעלות צלזיוס ולחכות 3 שעות. הערה: טמפרטורות גבוהות תגרומנה לתגובה מהירה יותר, אם ירצו בכך, אבל overstaining סיכון.
  5. סר צלחות פטרי מן החממה ולהעריך. זרעים אשר מוכתם אדום בעוברים שלהם הם germinable, בעוד זרעים בלא כתם מתים. התייעץ עם מדריך בדיקת AOSA tetrazolium לקבלת פרטים נוספים על מקרים גבוליים מבדיל ומינים בפרט.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

סוגים צלב עם אחוז אלל הורות ועל היבול אימהי מגוון (טבלה 1) שונים ברחבי תאריכי הסרה באחוזים מונבטים, ungerminated, וזרעים מתים (איור. 2 ו -3). באמצעות בדיקות TZ של זרעי ungerminated, מצאנו כמה זרעים רדומים באמת על סילוקו השני (בתחילת האביב) (טבלה 2), בעוד כל הזרעים ungerminated ידי ההסרה השלישית (האביב) נמצאו רדום באמת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כאן אנו מציגים שיטות באמצעות רצועות קבורת הזרע להתבונן זרע נביטה, תרדמת ותמותה של מלאי מקור מגוונים בתקופות זמן שנבחרו מראש בתחום. היתרונות של שימוש רצועות ולא מנות בודדות לשכב (1) מהירות רצועה ובניית תא על בריאה של מנות בודדות; ו (2) הקלות והמהירות של הסרת תאים מרובים בתנועה אחת ללא הסכנה של השמטת חבילה או הסרה אחד שלא בכוונה. כפי שני מבין המועדים להסרת בדוגמה המוצגת כאן היו בחודשי החורף כאשר הקרקע היא קשה והן מבחינת התנאים הם קרים, שיטה זו מפחיתה הן העבודה ואת הפוטנציאל לטעויות ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית המענקים להערכת סיכונים ביוטכנולוגית מס' תחרותי 2006-39454-17438 ל- A. Snow, K. Mercer ו- H. Alexander ממשרד החקלאות של ארצות הברית, המכון הלאומי למזון וחקלאות. ניסויים בשיטה זו נערכו ונתמכו על ידי תחנת השדה של אוניברסיטת קנזס, יחידת מחקר של הסקר הביולוגי של קנזס ואוניברסיטת קנזס. המחברים רוצים להודות ל-P. Jourdan ו-E. Regnier על סקירות מועילות על גרסאות קודמות של כתב היד הזה. בנוסף, עבודה זו נעזרה בתרומות של הצוות בתחנת השדה של אוניברסיטת קנזס, חוות ווטרמן באוניברסיטת אוהיו סטייט (OSU), מרכז הגרמפלזמה של צמחי הנוי של USDA ב-OSU, והמעבדה לביולוגיה של זרעים במחלקה לגננות ומדעי הגידולים ב-OSU, במיוחד E. Renze, S. Stieve, A. Evans, ו-E. Grassbaugh, לתמיכה טכנית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מעטפות מטבעות קטנותכל
מעטפות מטבע גדולותכל
רשת יתושים פוליאסטר משורשת עדינהכל
אקדח דבק בטמפרטורה גבוההכל
מקל דבק בטמפרטורה גבוהה ממלאמחדש כל
סמן קבוע תעשייתיכל
תוויות גינהמפלסטיק כל
מספרייםכל
חפירהכל
רשת מתכת בד קשהכל
דגלי מודד, צבעים מרוביםכל
עיתון רטובכל
מצנןכל
נייר כתמיםכל
צלחות פטריכל
טמפ' תא גידול מבוקרכל
סכיני גילוחכל
כלי פטריכל
טטרזוליום כלורידכל
מיםכל
חום חממהכל

מקורות

  1. Walck, J. L., Baskin, J. M., Baskin, C. C., Hidayati, S. N. Defining transient and persistent seed banks in species with pronounced seasonal dormancy and germination patterns. Seed Sci Res. 15 (3), 189-196 (2005).
  2. Alexander, H. A., Schrag, A. M. Role of soil seed banks and newly dispersed seeds in population dynamics of the annual sunflower. Helianthus annuus. J Ecol. 91, 987-998 (2003).
  3. Burnside, O. C., Wilson, R. G., Weiseberg, S., Hubbard, K. Seed longevity of 41 weed species buried 17 years in eastern and western. Weed Sci. 44 (1), 74-86 (1996).
  4. Baskin, C. C., Baskin, J. M. Seeds: Ecology, biogeography, and evolution of dormancy and Germination. , Academic Press. San Diego, CA. (2001).
  5. Finch-Savage, W. E., Leubner-Metzger, G. Seed dormancy and the control of germination. New Phytol. 171, 501-523 (2006).
  6. Baskin, J. M., Baskin, C. C. A classification system for seed dormancy. Seed Sci Res. 14 (1), 1-16 (2004).
  7. Donohue, K., et al. Environmental and genetic influences on the germination of Arabidopsis thaliana in the field. Evolution. 54 (4), 740-757 (2005).
  8. Roach, D. A., Wulff, R. D. Maternal effects in plants. Ann Rev Ecol Syst. 18, 209-235 (1987).
  9. Pace, B. A., Alexander, H. M., Emry, J. D., Mercer, K. L. Seed fates in crop-wild hybrid sunflower: crop allele and maternal effects. Evol Appl. 8 (2), 121-132 (2015).
  10. Alexander, H. M., Emry, D. J., Pace, B. A., Kost, M. A., Sparks, K. A., Mercer, K. L. Roles of maternal effects and nuclear genetic composition change across the life cycle of crop-wild hybrids. Am J Bot. 101 (7), 1176-1188 (2014).
  11. Stewart, N. C., Matthew, J., Halfhill, D., Warwick, S. I. Transgene introgression from genetically modified crops into their wild relatives. Genetics. 4, 806-817 (2003).
  12. Mercer, K. L., Shaw, R. G., Wyse, D. L. Increased germination of diverse crop-wild hybrid sunflower seeds. Ecol Appl. 16, 845-854 (2006).
  13. Delouche, J. C., Still, T. W., Rapset, M., Lienhard, M. The tetrazolium test for seed viability. Mississippi Sta Uni Ag Exp Sta Techn Bull. 51, 1-63 (1962).
  14. Association of Official Seed Analysts. Tetrazolium Testing Handbook. , 653 Constitution Avenue NE, Washington, DC 20002, USA. (2010).
  15. Alexander, H. M., Emry, D. J., Pace, B. A., Kost, M. A., Sparks, K. A., Mercer, K. L. Roles of maternal effects and nuclear genetic composition change across the life cycle of crop-wild hybrids. Am J Bot. 10 (7), 1176-1188 (2014).
  16. Weiss, A. N., Primer, S. B., Pace, B. A., Mercer, K. L. Maternal effects and embryo genetics: germination and dormancy of crop-wild sunflower hybrids. Seed Sci Res. 23, 241-255 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

תרדמת זרעיםתמותת זרעיםטטרזוליום כלורידחיוניות זרעיםדינמיקה של מאגרי זרעיםHelianthus Annuusשיטת רצועת הזרעיםניסויי קבורה
דרך אמין להערכת זרע נביטה, תרדמת, ותמותה בתנאי שדה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.