שיטה למדידת RNA N 6 שינויי -methyladenosine ב תאים ורקמות

Chao-Yung Wang; Mei-Hsiu Lin; Hui-Ting Su

doi:10.3791/54672

מאמר שיטה

שיטה למדידת RNA N 6 שינויי -methyladenosine ב תאים ורקמות

DOI:

10.3791/54672

⸱

5 בדצמבר 2016

Chao-Yung Wang¹ , Mei-Hsiu Lin¹ , Hui-Ting Su¹

¹Department of Cardiology, Chang Gung Memorial Hospital, Chang Gung University College of Medicine

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטה סופגת צפונית שונה למדידת N ⁶ -methyladenosine (מ ⁶ א) שינויים ב RNA מתוארת. השיטה הנוכחית יכולה לזהות שינויים ב RNAs ובקרות מגוונות תחת עיצובים ניסיוניים שונים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

N 6-Methyladenosine (m⁶A) שינויים של RNA מגוונים ונמצאים בכל מקום בקרב איקריוטים. הם מתרחשים ב-mRNA, rRNA, tRNA ומיקרו-RNA. מחקרים אחרונים גילו כי שינויים הפיכים אלה ב-RNA משפיעים על שחבור RNA, תרגום, פירוק ולוקליזציה. תהליכים פיזיולוגיים מרובים, כמו מקצבים צירקדיים, פלוריפוטנטיות של תאי גזע, פיברוזיס, מטבוליזם של טריגליצרידים והשמנת יתר נשלטים גם הם על ידי שינויים ב-m⁶A. משקעים חיסוניים/ריצוף, ספקטרומטריית מסה וכתם צפוני שונה הם חלק מהשיטות הנפוצות למדידת שינויים ב-m⁶A. כאן, אנו מציגים טכניקת כתמים צפון-מזרחית למדידת שינויים ב-m⁶A. הפרוטוקול הנוכחי מספק הפרדה בגודל טוב של RNA, התאמה וסטנדרטיזציה טובים יותר לעיצובים ניסיוניים שונים, ותיחום ברור של שינויים ב-m⁶A במקורות שונים של RNA. בעוד שידוע שלשינויים ב-m⁶A יש השפעה מכרעת על הפיזיולוגיה האנושית הקשורה למקצבים צירקדיים והשמנת יתר, תפקידיהם במצבים פיזיולוגיים (פתו) אחרים אינם ברורים. לכן, לחקירות על שינויים ב-m⁶A יש אפשרות עצומה לספק תובנות מפתח לפיזיולוגיה מולקולרית.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לשינויים דינמיים והפיכים ב-RNA יש תפקידים חשובים בהומאוסטזיס RNA. לפני ארבעה עשורים, שינויים ב-N 6-methyladenosine (m⁶A) נמצאו בשפע בטרנסקריפטומים אוקריוטיים¹. יש להם פונקציות מגוונות ב-RNA שליח (mRNA), RNA ריבוזומלי (rRNA), RNA גרעיני קטן, RNA העברה ומיקרו-RNA². השינויים ב-m⁶A של mRNA משפיעים על שחבור³, תרגום⁴, השפלה⁵ ולוקליזציה². יתר על כן, הם משפיעים על ביוגנזה של ריבוזום ותפקוד מיקרו-RNA⁶. השימור האבולוציוני של m⁶A שינויים של RNA מצוין בחיידקים חד-תאיים לבני אדם רב-תאיים⁷. תיחום התפקידים של שינויים ב-m⁶A נמצא כעת במחקר נרחב. המאמצים צפויים לספק תובנות חדשות לגבי בקרת תמלול. מחקרים אחרונים מגלים כי שינויים כימיים אחרים של mRNA⁸ ממלאים גם הם תפקידים קריטיים בחילוף החומרים של RNA.

מקצבים צירקדיים⁹, פלוריפוטנטיות של תאי גזע¹⁰, מטבוליזם של טריגליצרידים⁴, פיברוזיס¹¹, השמנת יתר¹² ודיכאון מג'ורי¹³ הם כמה דוגמאות לתהליכים שבהם ידוע ששינויים ב-m⁶A שולטים בתוצאות. לתעתיקים רבים של גנים של שעון ביולוגי יש m⁶A אתרים¹⁴. אפנון של m⁶A מתילאז או דמתילאז מעורר שינויים בתקופה הצירקדית¹⁵. Mettl3, m⁶A transferase, הוא מווסת לפלוריפוטנטיות של תאי גזע. מחסור ב-Mettl3 מוביל לקטלניות עוברית מוקדמת ולהתחלת שושלת חריגה בשלב¹⁰ שלאחר ההשתלה. מחסור במסת שומן והשמנת יתר (FTO), m⁶A demethylase, באדיפוציטים משפיע על גיוס חומצות שומן ומשקל גוף באמצעות ויסות פוסט-שעתוק של Angptl4⁴. מחקרים אלה מגלים כי m⁶A לא רק שולט בעיבוד mRNA, אלא גם ממלא תפקידים קריטיים בהתפתחות האמבריולוגית ובפתו-פיזיולוגיה. לפונקציה של שינויים ב-m⁶A יש השלכות על שיקולים טיפוליים בעתיד.

קיימות מספר שיטות למדידת שינויים ב-m⁶A של RNA^16-18. באופן מסורתי, כרומטוגרפיה של שכבה דקה (TLC) וכרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC) משמשות לחקר ההתפלגות של m⁶A במספר RNAs^19,20. ספקטרומטריית מסה היא כלי רגיש לזיהוי שינויים ב-m⁶A ב-RNA. עם זאת, יש לכרות את ה-RNA על ידי RNase למקטעים קצרים לפני הניתוח על ידי ספקטרומטריית מסה²¹. משקעים חיסוניים וריצוף של מתיל-RNA (m⁶A-Seq)²² משקעים חיסוניים עם RNA מקוטע עם נוגדנים ספציפיים ל-m⁶A ומבצע ריצוף RNA מקביל. שיטה זו יוצרת נופים ברוחב טרנסקריפטום m⁶A. מיפוי ברזולוציה גבוהה של m⁶A קישור צולב ומשקעים חיסוניים ברזולוציה של נוקלאוטידים בודדים (miCLIP) ממפה עוד יותר שינויים ב-m⁶A ברזולוציה של נוקלאוטיד יחיד²³. שתי השיטות מספקות פרטים על שינוי m⁶A על פני כל הטרנסקריפטום, עם מידע על גנים ספציפיים. עם זאת, כימות וסטנדרטיזציה בשתי השיטות קשים אם ניסויים דורשים השוואה של מספר תנאים. יתר על כן, פיצולים של RNA עבור m⁶A-Seq משנים את מבנה ה-RNA המקורי, מה שעשוי להשפיע על רמות m⁶A מקוריות. כדי לזהות שינויים גלובליים של m⁶A ב-RNA והשינויים שלהם בתנאי ניסוי שונים, אנו מדווחים על שיטה המשתמשת בפרוטוקול כתמים צפוני שונה. שיטה זו פותרת RNA לפי משקל מולקולרי, באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל¹⁸. הליך זה מספק סטנדרטיזציה וכימות טובים יותר עבור ניסויים הכוללים מספר תנאים או דגימות. הוא גם מספק מידע ספציפי על שינוי m⁶A עבור RNAs שונים, בין אם rRNA, mRNA או microRNA.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: רנ"א הכל מ ⁶ רמה כוללת rRNA, mRNA, ו RNA קטנים אחרים. מאז RNA ריבוזומלי יש מ שופע ⁶ שינויים A, מדידת מ ⁶ הבגרויות תצטרך לשקול את העובדה הזו.

בידוד RNA 1.

באמצעות פתרון טיהור ribonuclease (מרוסס על מגבות נייר), לנגב את טפטפות ומשטחי ספסל מעבדה. מגבות נייר רטובות עם מי nuclease ללא ולנגב טפטפות ומשטחי ספסל במעבדה שוב.
הפקת RNA
1. בידוד RNA סה"כ
  1. שימוש בוחש עילי, homogenize 50-100 מ"ג של רקמה או 5-10 x 10 ⁶ תאים 1 מ"ל של תמיסת בידוד RNA שמרו על 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: רקמה יותר (100-150 מ"ג) עשויה להידרש דגימות רקמה שומניות מעכברים בגלל ריכוזי RNA הנמוכים בו. דוגמאות שמקורו מן הלב העכבר, כבד, שרירי השלד, ריאות, מוח, מקרופאגים הועסק ⁴ בעבר.
  2. בcubate homogenates מדגם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. הוספת 100 μL של 1-bromo-3-chloropropane (BCP) לכל 1 מ"ל של homogenate המדגם. לנער את צינורות בתוקף למשך 15 שניות ולהמשיך לבודד רנ"א הכל על פי הוראות היצרן ^24.
2. Polyadenylated mRNA טיהור מ- RNA סה"כ מבודד
  1. לטהר mRNA polyadenylated באמצעות ערכות או פרוטוקולים זמינים.
    1. לנער היטב מחדש להשעות כל אחד מהפתרונות הבאים: פתרון מחייב 2x, אוליגו חרוזי פוליסטירן (DT), והפתרון לשטוף. ודא אוליגו (DT) חרוזים חם לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
    2. העבר 120 μL של פתרון elution לכל הכנה לתוך צינור וחום עד 70 ° C בתוך גוש חימום.
    3. פיפטה עד 500 מיקרוגרם של רנ"א הכל לתוך צינור microcentrifuge. עם nuclease ללא מים, להתאים את עוצמת הקול כדי 250 μL.
    4. הוסף 250 μL של פתרון מחייב 2x אל רנ"א הכל כךlution מערבולת בקצרה לערבב את תוכנו.
    5. הוסיפו 15 μL של אוליגו (DT) חרוז מערבולת ביסודיות לערבב.
    6. דגירה את התערובת על 70 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות.
    7. הסר את המדגם מגוש החימום ולתת לו לעמוד בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות.
    8. צנטריפוגה ב 15,000 XG במשך 2 דקות.
    9. מוציאים בזהירות את supernatant, משאיר מאחוריו כ 50 μL.
    10. הוספת 500 μL של פתרון לשטוף מחדש להשעות את הגלולה ידי pipetting.
    11. פיפטה ההשעיה לתוך מערכת צינור ספין מסנן / אוסף.
    12. צנטריפוגה ב 15,000 XG במשך 2 דקות. הסר את עמודת צינור איסוף וזורק את הזרימה דרך. החזר את עמודת צינור האיסוף.
    13. פיפטה 500 μL של פתרון לשטוף על מסנן הספין.
    14. צנטריפוגה ב 15,000 x גרם במשך 2 דקות.
    15. מעביר את מסנן הספין לתוך צינור איסוף טרי.
    16. פיפטה 50 μL של פתרון elution מחומםעד 70 ° C על גבי במרכז מסנן הספין.
    17. דגירה של 2-5 דק 'ב 70 ° C. צנטריפוגה ב 15,000 XG דקות 1.
    18. פיפטה נוסף 50 μL של פתרון elution מחומם ל -70 מעלות צלזיוס על גבי במרכז מסנן הספין.
    19. חזור על שלב 1.2.2.1.18.
  2. הוספת 100 מיקרוגרם / מ"ל גליקוגן, 0.1 נפח של 3 M חיץ נתרן אצטט (5.2 pH), ו 2.5 כרכים של אתנול אבסולוטי. משקע הלילה ב -80 ° C.
  3. צנטריפוגה ב 15,000 XG במשך 25 דקות ב 4 °. בטל supernatant.
  4. שטפו את הכדור עם 1 מ"ל של אתנול 75%. צנטריפוגה ב 15,000 XG במשך 15 דקות ב 4 ° C.. מוציאים בזהירות את אתנול.
  5. יבש באוויר במשך 3-5 דקות.
  6. הוסף 10 μL של מי nuclease ללא לפזר את הגלולה.
  7. חנות ב -70 ° C.
הכשרת RNA וכימות
1. באמצעות ספקטרופוטומטר, לקבוע את ריכוז RNA על ידי NotIng את הספיגה ב 260 ננומטר ו -280 ננומטר. יחס _{_260/280} צריך להיות 1.8-2.2.
2. בדוק את איכות המדגם RNA באמצעות 0.8% ג'ל agarose אלקטרופורזה ^25.
  הערה: רנ"א הכל ללא פגע איקריוטיים צריך להראות 28S אינטנסיבי 18S rRNA להקות. יחס 28S לעומת עוצמת להקת 18S rRNA עבור הכנת RNA טובה הוא ~ 2.

2. ג'ל אלקטרופורזה והסעה

הערה: הפרוטוקולים כן חיץ ניתנים בטבלת 1.

הכנת ג'ל פורמלדהיד (1%)
1. יש לשטוף את כל הציוד אלקטרופורזה עם diethylpyrocarbonate (DEPC) מים.
2. ממיסים 2.5 גרם של agarose ב 215 מ"ל מים DEPC לחלוטין במיקרוגל.
3. הוסף 12.5 מ"ל של 10x 3- (N- morpholino) חומצה propanesulfonic (מגבים) חיץ 22.5 מ"ל של פורמלדהיד 37%.
4. יוצקים את התערובת לתבנית המנגנון אלקטרופורזה עם מסרק סמיך 1.5 מ"מ.
5. לחסל בועות או לדחוף tשולי עד הקצוות הג'ל במסרק נקי.
6. אפשר הג'ל לחזק בטמפרטורת החדר.
לדוגמא הכנה
1. מערבבים 1-10 מיקרוגרם של RNA סך 11.3 μL של חיץ מדגם.
2. מערבבים 2 מיקרוגרם של הסמן RNA (1 מיקרוגרם / μL) עם 11.3 μL של חיץ מדגם.
3. מוסיפים מים nuclease ללא דגימות 2.2.1 ו 2.2.2 כדי בהיקף כולל של 16 μL.
4. מחממים על 60 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ולאחר מכן לצנן על הקרח.
5. מערבבים 16 μL של המדגם מ 2.2.3 עם 4 μL של צבע מעקב, המכיל 0.1 מיקרוגרם / μL ethidium ברומיד על הקרח.
  זהירות: ברומיד Ethidium הוא אולי טרטוגניות ורעילים אם נשאף. קרא גליון בטיחות ברומיד ethidium.
אלקטרופורזה
1. הוסף 200 מ"ל של 10x מגבים חיץ ל -1,800 מ"ל של DDH ₂ O לבצע למאגר פועל מגבים 1x.
2. השתמש למאגר פועל מגבי 1x לשטוף את הבארות של ג'ל.
3. t טרום ריצההוא הג'ל על 20 V למשך 5 דקות.
4. טען את דגימות רנ"א לתוך הבארות של ג'ל.
5. מכסים בנייר כסף, כדי למנוע חשיפה לאור. הפעלה ב 35 V עבור כ -17 שעות (לילה)
6. בדוק ולצלם את הג'ל תחת אור UV.
לְהַעֲבִיר
1. חותכים את ג'ל להסרת החלק בשימוש.
2. הכן 500 מ"ל של 10x חיץ SSC (250 מ"ל של חיץ 20x SSC ו 250 מ"ל מים DEPC).
3. שטפו את הג'ל פעמיים עם חיץ 10x SSC במשך 20 דקות עם רועד ב 50 סל"ד.
4. חותכי 1 נייר סינון גיליון גדול מספיק כדי לשמש נייר פתילה, אשר סופג חיץ העברה ממגש ההעברה (איור 1).
5. חותכים 4 חתיכות של נייר סינון לאותו גודל כמו ג'ל.
6. חותכים 1 גיליון קרום ניילון חיובי טעונים לאותו גודל כמו ג'ל.
7. סמן חריץ על הג'ל ואת הקרום כסמן כדי להבטיח את הכיוון הנכון.
8. משרים את הממברנה חיץ 2x SSC במשך 15 דקות.
9. יוצקים 500 מ"ל of 10x SSC חיץ למגש ההעברה.
10. הנח את גיליון נייר סינון גדול על פני הצלחת זכוכית להרטיב את נייר הסינון עם חיץ העברה.
11. מרדד כל בועות עם טפטפת.
12. משרי 2 חתיכות של נייר סינון מראש לחתוך חיץ העברה ומניח אותם על המרכז של נייר הסינון משלב 2.4.5. הסר את כל בועות.
13. הנח את הדף בצד ג'ל למטה על נייר הסינון.
14. הנח את קרום על גבי הג'ל. ישר את החריצים של הג'ל ואת הממברנה.
15. מניחים 2 חתיכות של נייר סינון מראש לחתוך על גבי הממברנה ואת להרטיב את נייר הסינון עם חיץ העברה.
16. הסר את כל בועות בין השכבות.
17. החל בניילון סביב הג'ל על מנת להבטיח כי רק מגבה לספוג חיץ עובר דרך ג'ל הממברנה.
18. סטאק את מגבות נייר על גבי נייר הסינון.
19. מניח צלחת זכוכית גדולה על גבי המגבות.
20. מניחים משקל על החלק העליון של הערימה.
21. שמור לילה לאפשר RNA להעביר מן הג'ל על הממברנה.

3. איתור של N ⁶ -methyladenosine

ממברנה Crosslinking
1. שמור את קרום לחת חיץ 2x SSC.
2. מניחים 2 גיליונות נייר מסנן שקוע עם 10x חיץ SSC לתוך crosslinker UV.
3. מניחים את קרום על גבי נייר הסינון, כשהצד RNA-adsorbed פונה כלפי מעלה.
4. בחר "מצב autocrosslink" (120,000 μJ) ולחץ על כפתור "התחל" כדי להתחיל את ההקרנה.
5. בדוק את הממברנה ואת ג'ל עם לוכד תמונה ג'ל UV כדי לאשר את העברת RNA מן הג'ל על הממברנה.
immunoblotting
1. חסום את הממברנה ב 5% חלב דל שומן מלוחים טריס שנאגרו עם 20 Tween (TBST) חיץ בטמפרטורת החדר למשך שעה 1.
2. לשטוף שלוש פעמים עם חיץ TBST במשך 15 דקות.
3. דגירה הממברנה לילה מ ⁶ ( N ⁶ פתרון נוגדנים -methyladenosine) (1: 1,000 ב 5% דל שומן חיץ חלב TBST) ב 4 ° C..
4. לשטוף את הממברנה שלוש פעמים עם חיץ TBST במשך 15 דקות.
5. דגירה הממברנה ב HRP-מצומדות חמור פתרון נוגדנים נגד ארנב (1: חיץ 2,000 5% דל שומן חלב TBST) במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר.
6. לשטוף את הממברנה שלוש פעמים עם חיץ TBST במשך 15 דקות.
7. החל את המצע chemiluminescent משופרת (0.125 מ"ל לס"מ ² של קרום).
8. ללכוד את chemiluminescence עם ההגדרות האופטימליות של תרמי הדיגיטלי, על פי הוראות יצרן ^26.
מ ⁶ כימות
למדוד את עוצמת chemiluminescent היחסית מ ⁶ באמצעות תוכנת ImageJ.
בתפריט התוכנה ImageJ, בחר באפשרות "קובץ" כדי לפתוח את הקובץ הרלוונטי.
בחר באפשרות "מלבן" מ ImageJ ולצייר על ידי מסגרת סביבאת האותות.
אם RNA ריבוזומלי הוא לא המוקד של ניסויים, להימנע להקות ריבוזומלי 18S ו -28 RNA מ ⁶ לחישוב.
לחץ על "פיקוד" ו "1" כדי לאשר את השביל שנבחר.
לחץ "פיקוד" ו "3" כדי להראות את העלילה שנבחרה.
לחץ על הכלי "ישר" לצייר קווים כדי להפריד את האזור המפולח.
לחץ על הכלי "שרביט" כדי לרשום את המידות.
לייצא את הנתונים.
לנרמל את רמות א מ ⁶ עם להקת RNA ריבוזומלי 18S מן המכתים ברומיד ethidium.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לאחר 14 ימים בשלב יממה רגיל-כהה אור, עכברי wild-type הונחו בחשכה מתמדת. RNAs מהכבד נדגמו ב 4 במרווחים hr ולמד עם סופג הצפוני שונה. מתילציה של rRNAs, mRNAs, ו RNA הקטן התגלתה בבירור (איור 2). ההשוואה בין זמני יממה שונים (CT) ניתן לחשב במדויק עם תקן 18S rRNA. הייתה תנודת יממה חזקה של רמות מ ⁶ ב rRNA, mRNA, ו RNA הקטן.

כדי למנוע את ההפרעה שהוצעה על ידי rRNA, RNAs polyadenylated יכול להיות מטוהר, כמו בשלב 1.2.2. לאחר הטיהור, rRNA ניתן למנוע במידה רבה, כדי לאפשר ויזואליזציה טובה יותר של RNAs האחר (איור 3).

figure-results-1
g> איור 1: רכבת יחידת העברת כתם. יחידת העברת נימים עבור סופג את הרנ"א על הקרום מוצגת. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-2
איור 2: קצב היממה של בחינות הבגרות מ ⁶ ב C57BL / 6J. נתון זה מראה את מ ⁶ כתם של RNA הכולל כבדים עכברי-בר הקריב ביום הראשון של השלב הכהה כהה לאחר 14 ימים של שלב אור כהה רגיל ב 4 במרווחי h. כימות נעשה באמצעות מ ⁶ הפרש צפיפות התמונה בין 18S ו -28 rRNA. מ ^'6 שפע היה מנורמל הלהקה 18S rRNA מן הג'ל פורמלדהיד בתחתית.et = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-3
איור 3: כתמי הקלע זרק ⁶ עם או בלי rRNA. כתמי נציג מ ⁶ א 'של רנ"א הכל ו- RNA polyadenylated מן הכבדים של עכברי-בר מוצגים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

טבלה 1: חוצצים ופתרונות.

1	חיץ 10x מגבים (pH 7.0, להגן מפני אור)
	מגבים	41.85	g	0.2 M
	אצטט נתרן	4.1	g	0.05 מ '
	EDTA, Disodium מלח	3.7	g	0.01 M
	מי DEPC
	סה"כ	1	L
	מערבבים בטמפרטורת החדר
2	20x חיץ SSC (pH 7.0)
	נתרן כלורי	175.3	g	3 M
	ציטראט Trisodium	88.3	g	0.3 M
	מי DEPC
	סה"כ	1	L
	מערבבים בטמפרטורת החדר, ואז החיטוי
3	דיי מעקב
	חיץ 10x מגבים	500	μL	1x
	Ficoll 400	0.75	g	15%
	bromophenol כחול	0.01	g	0.2%
	קסילן Cyanol	0.01	g	0.2%
	מי DEPC
	סה"כ	5	מ"ל
	חנות ב -20 ° C
4	מי DEPC
	לדלל יחס של 1: 1,000 של DEPC DDH ₂ O
	מערבבים למשך הלילה בטמפרטורת החדר, ואז החיטוי
5	חיץ מדגם (להגן מפני אור)
	חיץ 10x מגבים	200	μL
	37% פורמלדהיד	270	μL
	Formamide	660	μL
	חנות ב -20 ° C

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לשינויים ב-RNA יש תפקידים חשובים בתפקוד התא ובפיזיולוגיה. ההבנה הנוכחית של הוויסות, התפקוד וההומאוסטזיס של שינויים אלה עדיין נחקרת ומורחבת⁸. לכן, יש צורך בשיטה מדויקת וסטנדרטית להערכת השינויים ב-RNA. שיטת הכתמים הצפונית המתוקנת מספקת כימות מדויק של שינויים ב-RNA ותיחום ברור של השינויים ב-RNA מגוונים. למרות שהשיטה דורשת לפחות 3 ימים, ניתן לתקנן אותה ולהשתמש בה בעיצובים ניסיוניים שונים. יתר על כן, עם נוגדנים שונים, הוא יכול לזהות שינויים שונים ב-RNA²⁷.

חשוב להפריד בין RNA שונים בעת ניתוח שינויים ב-RNA. RNA ריבוזומלי מהווה חלק גדול מהכמות הכוללת של RNA^28,29. התוצאות מניתוח שינויים ב-RNA רק ב-RNA הכולל ייצגו בעיקר את השינויים ב-rRNA. מתילציה ושינויים אחרים כאלה של rRNA יכולים להסוות את השינויים ב-RNA אחרים. באמצעות הליך הפרדת ג'ל, ניתן לנתח בצורה מדויקת יותר את השינויים של mRNA ו- RNA קטנים אחרים.

מיפוי רחב טרנסקריפטום עם m⁶A אימונו-משקעים וריצוף מספק תובנה מפורטת לגבי השינוי של כל סוג של RNA²². הוא מספק מידע על ה-RNA הספציפיים ורזולוציה של כ-80-120 bp. למרות ש-m⁶A-Seq יכול להשוות את השינויים בין תנאי ניסוי שונים, בחירת הסטנדרטים והבקרות המתאימים לניסויים כאלה היא קשה¹⁸. קשה לשחזר משקעים חיסוניים, ולעתים קרובות נותנים וריאציות משמעותיות בין חזרות. יתר על כן, m⁶A-Seq דורש פיצול של דגימות RNA לפני משקעים חיסוניים וריצוף³⁰. תהליך הפיצול עלול לגרום להשפעות מיותרות על שינויי ה-RNA המקוריים. אם הניסוי אינו זקוק למידע של הגן הספציפי אך דורש תנאים שונים להשוואה, השיטה הנוכחית מספקת הדמיה ובקרה טובים יותר עבור מערכי ניסוי מגוונים.

שינוי RNA הוא צעד חשוב בוויסות בקרת שעתוק³¹. עם זאת, ההומאוסטזיס ומנגנוני הוויסות של שינויים שונים ב-RNA בתחומים פיזיולוגיים מגוונים עדיין אינם ברורים. באמצעות שיטת הכתם הצפוני השונה הנוכחית, ניתן לכמת ולהשוות שינויים שונים ב-RNA. יתר על כן, ניתן לחקור את השינויים והתקנות של שינויים ב-RNA בפירוט רב יותר. בעתיד, ניתן יהיה גם לשלב את הנתונים הניסויים הן מפרוטוקולי הכתם הצפוני הקלאסי והן מפרוטוקולי הכתם הצפוני המותאמים, ולספק תובנות טובות יותר על הביולוגיה של RNA.

הגורם החשוב ביותר הקובע את הצלחת פרוטוקול הכתם הצפוני המותאם הוא שלמות דגימת ה-RNA. RNAs עם כמות מסוימת של פירוק עשויים להניב תוצאות טובות של כתמים צפוניים קלאסיים, אך יכולה להיות לכך השפעה משמעותית על תוצאות הכתם הצפוני המותאם. השינויים ב-RNA ברקמות או בקווי תאים שונים יכולים גם הם להשתנות באופן משמעותי. חשוב לבדוק את עומסי דגימות ה-RNA המתאימים לרקמות שונות לפני ביצוע הניסויים הסופיים.

מכיוון שהליכי הכתמים נקראו באופן מסורתי על שם ד"ר סאות'רן וכיוונים גיאוגרפיים שונים, אנו מציעים את השם "כתמים צפון-מזרחיים" לטכניקה הנוכחית.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

החוקרים אין לי מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C.Y.W. קיבל תמיכה מהמכון הלאומי לחקר הבריאות (NHRI-EX101-9925SC), המועצה הלאומית למדע (101-2314-B-182-100-MY3, 101-2314-B-182A-009) ובית החולים צ'אנג גונג ממוריאל (CMRPG3B1643, CMRPG3D1002, CMRPG3D0581, CMRPG380091 ו-CMRPG3C1763).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
פתרון RNaseZap	אמביון	AM9782	פרוטוקול 1.1
פתרון ריאגנט TRI	אמביון	AM9738	פרוטוקול 1.2.1.1
1-Bromo-3-chloropropane (BCP)	פרוטוקול סיגמא	B9673	1.2.1.3
פרוטוקול אתנול	JTbaker	8006	1.2.1.3
פרוטוקול איזופרופנול	סיגמא	I9516	1.2.1.3
GenElute mRNA Miniprep Kit	Sigma	MRN70	פרוטוקול 1.2.2.1
גליקוגן	אמביון	AM9510	פרוטוקול 1.2.2.2
נתרן אצטט	Fluka	71183	פרוטוקול 1.2.2.2.2 פרוטוקול
מים ללא נוקלאז	אמביון	AM9930	1.2.2.6
פרוטוקול DEPC	Sigma	D5758	2.1.1
Agarose	JT Baker	A426	2.1.2
MOPS	Sigma	M1254	פרוטוקול 2.1.3
תמיסת פורמלדהיד 37%	סיגמא	F8775	פרוטוקול 2.1.3
EDTA, מלח דיסודיום	JT Baker	8993	פרוטוקול 2.1.3 10x MOPS מאגר
פורממיד	סיגמא	F7503	פרוטוקול 2.2.1
RNA סמן מילניום	אמביון	AM7150	פרוטוקול 2.2.2
אתידיום ברומיד	אמרסקו	X328	פרוטוקול 2.2.5
Ficoll PM400	GE Healthcare	17-0300-10	פרוטוקול 2.2.5 צבע מעקב
ברומופנול כחול	סיגמא	114391	פרוטוקול 2.2.5 צבע מעקב
קסילן ציאנול FF	Sigma	X4126	פרוטוקול 2.2.5 צבע מעקב
נתרן כלורי דיהידרט	JT Baker	3624	פרוטוקול 2.4.2 20x מאגר SSC
טריסודיום ציטראט	סיגמא	S1804	פרוטוקול 2.4.2 20x מאגר SSC
נייר ספיגה Hybond פרוטוקול	Healthcare	RPN6101M	פרוטוקול 2.4.4
GE Hybond-N+ ממברנה	GE Healthcare	RPN303B	פרוטוקול 2.4.6
Stratalinker UV Crosslinker 2400	Stratagene	400075	פרוטוקול 3.1.2
לוכד ג'ל 1500	טכנולוגיית ANT	לוכד ג'ל 1500	פרוטוקול 3.1.5
Anti-m⁶A (N⁶-methyladenosine)	מערכות סינפטיות	202003	פרוטוקול 3.2.3
Amersham ECL Anti-Rabbit IgG, פרוטוקול AB	GE Healthcare	NA934	3.2.5
ChemiDoc MP System	BIO-RAD	1708280	פרוטוקול 3.2.8

פרוטוקול GE מקושר HRP

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Thammana, P., Held, W. A. Methylation of 16S RNA during ribosome assembly in vitro. Nature. 251 (5477), 682-686 (1974).
Meyer, K. D., Jaffrey, S. R. The dynamic epitranscriptome: N6-methyladenosine and gene expression control. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (5), 313-326 (2014).
Niu, Y., et al. N6-methyl-adenosine (m6A) in RNA: an old modification with a novel epigenetic function. Genomics Proteomics Bioinformatics. 11 (1), 8-17 (2013).
Wang, C. Y., et al. Loss of FTO in adipose tissue decreases Angptl4 translation and alters triglyceride metabolism. Sci Signal. 8 (407), 127(2015).
Wang, X., et al. N6-methyladenosine-dependent regulation of messenger RNA stability. Nature. 505 (7481), 117-120 (2014).
Berulava, T., Rahmann, S., Rademacher, K., Klein-Hitpass, L., Horsthemke, B. N6-adenosine methylation in MiRNAs. PLoS One. 10 (2), 0118438(2015).
Deng, X., et al. Widespread occurrence of N6-methyladenosine in bacterial mRNA. Nucleic Acids Res. 43 (13), 6557-6567 (2015).
Dominissini, D., et al. The dynamic N-methyladenosine methylome in eukaryotic messenger RNA. Nature. , (2016).
Fustin, J. M., et al. RNA-methylation-dependent RNA processing controls the speed of the circadian clock. Cell. 155 (4), 793-806 (2013).
Geula, S., et al. Stem cells. m6A mRNA methylation facilitates resolution of naive pluripotency toward differentiation. Science. 347 (6225), 1002-1006 (2015).
Wang, C. Y., et al. FTO modulates fibrogenic responses in obstructive nephropathy. Sci Rep. , SREP18874 (2016).
Jia, G., et al. N6-methyladenosine in nuclear RNA is a major substrate of the obesity-associated FTO. Nat Chem Biol. 7 (12), 885-887 (2011).
Du, T., et al. An association study of the m6A genes with major depressive disorder in Chinese Han population. J Affect Disord. 183, 279-286 (2015).
Wang, C. Y., Yeh, J. K., Shie, S. S., Hsieh, I. C., Wen, M. S. Circadian rhythm of RNA N6-methyladenosine and the role of cryptochrome. Biochem Biophys Res Commun. 465 (1), 88-94 (2015).
Wang, C. Y., Shie, S. S., Hsieh, I. C., Tsai, M. L., Wen, M. S. FTO modulates circadian rhythms and inhibits the CLOCK-BMAL1-induced transcription. Biochem Biophys Res Commun. 464 (3), 826-832 (2015).
Heyn, H., Esteller, M. An Adenine Code for DNA: A Second Life for N6-Methyladenine. Cell. 161 (4), 710-713 (2015).
Xiao, W., et al. Nuclear m(6)A Reader YTHDC1 Regulates mRNA Splicing. Mol Cell. 61 (4), 507-519 (2016).
Meyer, K. D., et al. Comprehensive analysis of mRNA methylation reveals enrichment in 3' UTRs and near stop codons. Cell. 149 (7), 1635-1646 (2012).
Horowitz, S., Horowitz, A., Nilsen, T. W., Munns, T. W., Rottman, F. M. Mapping of N6-methyladenosine residues in bovine prolactin mRNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (18), 5667-5671 (1984).
Resnick, R. J., Noreen, D., Munns, T. W., Perdue, M. L. Role of N6-methyladenosine in expression of Rous sarcoma virus RNA: analyses utilizing immunoglobulin specific for N6-methyladenosine. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol. 29, 214-218 (1983).
Golovina, A. Y., et al. Method for site-specific detection of m6A nucleoside presence in RNA based on high-resolution melting (HRM) analysis. Nucleic Acids Res. 42 (4), 27(2014).
Dominissini, D., et al. Topology of the human and mouse m6A RNA methylomes revealed by m6A-seq. Nature. 485 (7397), 201-206 (2012).
Linder, B., et al. Single-nucleotide-resolution mapping of m6A and m6Am throughout the transcriptome. Nat Methods. 12 (8), 767-772 (2015).
Fu, L., et al. Simultaneous Quantification of Methylated Cytidine and Adenosine in Cellular and Tissue RNA by Nano-Flow Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Coupled with the Stable Isotope-Dilution Method. Anal Chem. 87 (15), 7653-7659 (2015).
Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Nondenaturing agarose gel electrophoresis of RNA. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (6), 5445(2010).
Wang, C. Y., et al. FTO modulates fibrogenic responses in obstructive nephropathy. Sci Rep. 6, 18874(2016).
Li, X., et al. Transcriptome-wide mapping reveals reversible and dynamic N-methyladenosine methylome. Nat Chem Biol. , (2016).
Sanschagrin, S., Yergeau, E. Next-generation sequencing of 16S ribosomal RNA gene amplicons. J Vis Exp. (90), (2014).
Kukutla, P., Steritz, M., Xu, J. Depletion of ribosomal RNA for mosquito gut metagenomic RNA-seq. J Vis Exp. (74), (2013).
Mishima, E., et al. Immuno-Northern Blotting: Detection of RNA Modifications by Using Antibodies against Modified Nucleosides. PLoS One. 10 (11), 0143756(2015).
Klungland, A., Dahl, J. A. Dynamic RNA modifications in disease. Curr Opin Genet Dev. 26, 47-52 (2014).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

RNA Northern Blotting RNA UV m6A

שיטה למדידת RNA N 6 שינויי -methyladenosine ב תאים ורקמות

במאמר זה

סיכום

תקציר

מבוא

פרוטוקול

תוצאות

דיון

גילויים

תודות

חומרים

מקורות

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מאמרים קשורים