אפיון של קומפלקסים חלבונים Multi-למקטע של MxA האדם שימוש ללא denaturing polyacrylamide ג'ל אלקטרופורזה

Summary

מאמר זה מתאר פרוטוקול פשוט ומהיר להערכת המצב האוליגומרי של חלבון GTPase MxA דמוי דינמין מליזאטים של תאים אנושיים באמצעות שילוב של PAGE שאינו דנטורציה עם ניתוח כתמים מערביים.

Abstract

היווצרות קומפלקסים אוליגומריים היא תנאי הכרחי למבנה ותפקוד תקינים של חלבונים רבים. חלבון האפקטור האנטי-ויראלי MxA המושרה על ידי אינטרפרון מפעיל פעילות אנטי-ויראלית רחבה נגד נגיפים רבים. MxA הוא GTPase דמוי דינמין ויש לו יכולת ליצור מבנים אוליגומריים מסדר גבוה יותר. עם זאת, האם אוליגומריזציה של MxA נדרשת לפעילותו האנטי-ויראלית היא נושא לוויכוח. אנו מתארים כאן פרוטוקול פשוט להערכת המצב האוליגומרי של MxA המתבטא באופן אנדוגני או אקטופי בחלק הציטופלזמי של קווי תאים אנושיים על ידי אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד ללא דנטורציה (PAGE) בשילוב עם ניתוח כתמים מערביים. שלב קריטי בפרוטוקול הוא בחירת חומרי ניקוי למניעת צבירה ו/או משקעים של חלבונים הקשורים במיוחד לממברנות תאיות כגון MxA, מבלי להפריע לפעילותו האנזימטית. היבט מכריע נוסף של הפרוטוקול הוא ההגנה הבלתי הפיכה על קבוצות התיול החופשיות של שאריות ציסטאין על ידי יודואצטמיד כדי למנוע אינטראקציות מלאכותיות של החלבון. פרוטוקול זה מתאים להערכה פשוטה של המצב האוליגומרי של MxA ויתר על כן מאפשר מתאם ישיר של הפעילות האנטי-ויראלית של מוטציות ממשק MxA עם המצבים האוליגומריים שלהם.

Introduction

המבנה הרביעון של חלבון ממלא תפקיד מכריע בתהליכים תאיים רבים. מסלולי איתות, ביטוי גנים, ואנזים הפעלה / ביטול הפעלה כל מסתמכים על ההרכבה הנכונה של קומפלקסי חלבונים ^1-4. תהליך זה ידוע גם בשם שָׁוֶה או-oligomerization הטרו נובע קוולנטי בלתי הפיך או הידרופובי אלקטרוסטטית הפיך אינטראקציות חלבון-חלבון. Oligomerization לא רק מגוונת את תהליכים תאיים שונים מבלי להגדיל את גודל הגנום, אלא גם מספק אסטרטגיה חלבונים לבנות מתחמי יציבה כי הם עמידים יותר כלפי denaturation והשפלה ^5. פגמים oligomerization להשפיע על תפקודם של חלבונים והוא יכול להוביל להתפתחות של מחלות. לדוגמה, hydroxylase פנילאלנין האנזים יוצר מורכבות tetrameric. כמה מוטציות במתחם חלבון יכול להחליש את היווצרות tetramer ולהוביל פנילקטונוריה מחלת ^6.

s = "jove_content"> חלבון MxA האדם הוא אינטרפרון (IFN) -induced חלבון מפעיל אנטי הפעלת פעילות אנטי רחבה נגד RNA השונה וכן נגיפי DNA ^7. היא שייכת superfamily של GTPases גדול דמוי dynamin ויש לו את היכולת ליצור מבנים oligomeric גדול במבחנה ^8. Oligomerization הוצע להגן MxA מפני השפלה המהירה ^9,10. למרות ניסיונות נמרצים מצד קבוצות מחקר רבות, את המנגנון המולקולרי של פעולה נותר חמקמק בעיקר ואת תפקידה של מדינת oligomerization של MxA לתפקוד אנטי שלה נמצא תחת דיון ^9,11,12. בהקשר זה, גאה ועמיתים לעבודה הציעו מודל שבו MxA מפעיל הפעילות אנטי שלה על ידי אינטראקציה עם נוקלאופרוטאינים ויראלי בצורה של מבני oligomeric גדולים דמוית טבעת ^11. עם זאת, ולאחרונה, הראינו כי הדימרים MxA תערוכת פעילות אנטי אינטראקציה עם nucleoprotein של נגיף שפעת A ^12. Based על המבנה הגבישי של MxA, גאו ועמיתים לעבודה זיהו מספר שאריות חומצת אמינו באזורי ממשק כי הם קריטיים עבור oligomerization שלה במבחנה ותפקוד אנטי שלה ^11,13. לכן, על מנת להבהיר הקובעות oligomeric של MxA מפעיל פעילות אנטי, ביקשנו להקים פרוטוקול פשוט במהירות כדי לקבוע את המצב oligmeric של מוטציות ממשק MxA לידי ביטוי בתאים אנושיים, כמו גם אנדוגני MxA הביע לאחר גירוי IFNα.

אמנם יש טכניקות רבות שאינם בשימוש נפוץ כדי לחקור את האינטראקציה בין חלבונים כגון החלבון המפוצל גרין פלורסנט (פיצול-GFP) assay השלמה ^14, תהודת plasmon משטח ¹⁵ והעברת אנרגית תהודת פורסטר (סריג) ^16, הם אינם מספקים מידע של stoichiometry המדויק של קומפלקס חלבוני oligomeric. לקבלת חקירה של היבט מסוים זה, טכניקות כגוןפיזור רב-זווית אור (יונקים) ¹⁷ ו ultracentrifugation אנליטית ¹⁸ הם מאוד שימושיים. בדרך כלל, את החלבונים נותחו באמצעות שיטות אלה הם חלבונים מטוהרים. תהליכי oligomerization עשויים להיות תלויים גם בגורמים תאיים אחרים. אם הגורמים הללו אינם ידועים, הניתוח הוא יותר קשה. בנוסף, כמה חלבונים שקשה לבטא ב E. coli כדי לטהר. לכן, שיטות אלה אינן הבחירה האופטימלית לנתח oligomerization חלבון בסביבת הסלולר. בנוסף, טכניקות אלה דורשים מכשירים יקרים אשר אינם זמינים.

ג'ל polyacrylamide ללא denaturing אלקטרופורזה (עמוד), כרומטוגרפיה הדרה גודל או crosslinking כימיים ואחריו סולפט dodecyl נתרן קונבנציונאלי (SDS) -PAGE הם כלי שימושי לאפיון היווצרות של oligomers מ lysates תא ^2,19,20. שיטות אלו אינן מחייבות ציוד מיוחד והוא יכול להיות בקלות PErformed במעבדה סטנדרטית. אנחנו בתחילה העריכו פרוטוקולים cross-linking כימיים שונים שהובילו invariantly להצטברות הלא ספציפית ומשקעים של MxA. לכן, אנחנו הבאים נבדקים פרוטוקולי עמוד הלא denaturing. כדף הלא denaturing כולל את השימוש SDS, הגירה של חלבונים תלוי תשלום מולדתם. עמוד כחול-יליד משתמש G250 הכחול המבריק coomassie לטעון חלבונים עם תשלום הכולל שלילי, בדומה SDS, אבל לא לפגל החלבון ^21. למרבה הצער, coomassie משקע כחול מבריק בנוכחות מלחי גבוה קטיונים divalent (למשל Mg ²⁺⁾ כלולים לעתים קרובות מאגרים תמוגה. בהתאם המאגרים בשימוש, זה עלול להיות קשה לנתח את המדגם מבלי אופטימיזציה נוספת של צעדים, עלול להיות בעל השפעה על החלבון המורכב oligomeric.

כאן אנו מציגים פרוטוקול פשוט המבוסס על שיטה שפורסמה בעבר ²² כדי לקבוע oligomerization שלחלבון אנושי MxA נגזר lysates הסלולר באמצעות עמוד הלא denaturing.

Protocol

הערה: פרוטוקול זה מבוסס על פרוטוקול העמוד הלא denaturing שפורסם בעבר ^12. במחקר זה, המדינה oligomeric של החלבון MxA הוערכה באמצעות או תאים Vero overexpressing MxA או תאים A549 IFN מגורה-α להביע אנדוגני MxA. הפרוטוקול המתואר להלן ניתן להשתמש כדי לנתח את מצב oligomeric של כל חלבון בנוסף MxA. עם זאת, אופטימיזציה נוספת ייתכן שתידרש.

1. הכנת Cell Lysate עבור עמוד חדרים denaturing

הערה: כדי לנתח את מצב oligomeric של החלבון האנושי MxA בשני תאים Vero או A549, 1.0 x 10 ⁶ התאים נקצרו. בהתאם לסוג התא או השפע של החלבון לנתח, את המספר הסלולרי צריך להיות מותאם. כמו כן, חשוב להגן על חיץ תמוגה מהחשיפה לאור, ברגע iodoacetamide הרגיש לאור מתווסף.

1. זרע 0.3 x 10 ⁶ A549 או Vero תאים לכל היטבעד 6-מנות היטב. שמור את התאים ב 2 מיליליטר צמיחה בינונית לכל טוב (ראה טבלה 1). דגירת תאי לילה חממת תרבית תאים (37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2).
2. קציר התאים על ידי שטיפה עם 1 מ"ל של בופר פוספט (PBS) ולנתק ידי הוספת 0.5 מ"ל של 0.25% חומצה טריפסין-ethylenediaminetetraacetic (EDTA) 1x פתרון כ 5 דקות בטמפרטורת החדר.
3. ברגע תאים להתנתק המנה, להוסיף 0.5 מ"ל מדיום הגידול ומערבבים בזהירות על ידי pipetting למעלה ולמטה.
4. העברת התאים של כל אחד גם לתוך צינור אחד 2 מ"ל ו גלולה אותם באמצעות צנטריפוגות בראש הטבלה (5,000 XG, 4 ° C, 5 דקות).
5. מוציאים בזהירות את supernatant ידי pipetting מבלי להפריע גלולה התא.
6. שוטפים את התאים עם PBS 1 מ"ל קר כקרח על ידי pipetting ההשעיה תא בקפידה מעלה ומטה.
7. תאים גלולים בצנטריפוגה בראש טבלה (5,000 XG, 4 ° C, 5 דקות).
8. מוציאים בזהירות את supernatant ידי pipetting without ניתוק התא גלולה.
9. תאי Resuspend ב 200 חיץ μl קר כקרח תמוגה (ראה טבלה 1) על ידי pipetting למעלה ולמטה ולשים על קרח.
10. מיד, להגן lysate מן האור על ידי כיסוי הצינורות באמצעות נייר אלומיניום דגירה במשך 30 דקות על הקרח.
    הערה: לאחר הדגירה במשך 30 דקות על קרח, זה כבר לא חיוני בשמירה על lysate מחשיפה לאור, מאז להגנה על קבוצות תיאול חינם הוא בלתי הפיכה.
11. הסר פסולת התא על ידי צנטריפוגה בצנטריפוגה בראש הטבלה מראש צונן (13,000 XG, 4 ° C, 20 דקות).
12. לאזן עמודות דיאליזת חיץ דיאליזה (טבלה 1) בחדר הקר על 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות במהלך שלב צנטריפוגה. השתמש בעמודה עם משקל מולקולרי המנותק של 10,000.
    1. צרף את העמודות כדי מצוף לצוף ולשים אותם לתוך כוס המלאה עם חיץ דיאליזה. כדי להבטיח ערבוב עדין, להשתמש בוחש מגנטי. אל תיגע הממברנה.
       הערה: Dialysניתן לרכוש או מכינים עמודות 1.5 מיליליטר צינורות לפי הפרוטוקול שתואר על ידי פיאלה ועמיתים לעבודה ^19.
13. הסר את העמודות מתוך מאגר דיאליזת המצוף לצוף. מעבירים את lysates פינה לתוך הטור דיאליזה מוכן ידי pipetting בלי לגעת קרום. צרף את העמודות כדי מצוף לצוף ולשים אותם בחזרה לתוך הכוס מלאה עם חיץ דיאליזה.
14. Dialyze את lysate בתוך מבחנה המכילה מאגר דיאליזה קרים כקרח (טבלה 1) לפחות 4 שעות (או רצוי לילה) בשעה 4 ° C תוך ערבוב בזהירות בעזרת בוחש מגנטי. השתמש לפחות חיץ דיאליזה 100 מ"ל עבור lysate 200 μl.
15. מעבירים את המדגם dialysed לתוך צינור 1.5 מ"ל. הסר משקעים ידי צנטריפוגה בצנטריפוגה בראש הטבלה (13,000 XG, 4 ° C, 20 דקות). כדי למנוע ניתוק של החלבון oligomeric מתחמי להמשיך עם פרוטוקול (סעיף 2) מיד לאחר דיאליזה. אין להקפיאאת lysates המוכן.

אלקטרופורזה 2.

הערה: אלקטרופורזה בוצע כפי שתואר קודם עם כמה שינויים ^22. בפרוטוקול המתואר להלן, ג'לים שיפוע מראש יצוק שימשו (שיפוע 4-15%). לחלופין, ג'ל ניתן להכין במעבדה. זה מאוד חשוב לכלול כל סוכן denaturing כגון SDS כדי למנוע ניתוק של קומפלקסים חלבונים oligomeric. זמן של אלקטרופורזה הוטב מדינות oligomeric השונות של חלבון MxA אדם. עם זאת, זה יכול להשתנות עבור חלבונים אחרים, תלוי בגודל של מתחם oligomeric כמו גם המגוון של פרדה שאמורה להיות מושגת על מנת לנתח את המורכבות. לכן, הזמן האופטימלי של אלקטרופורזה צריך להיקבע באופן אמפירי. עבור הרזולוציה המיטבית של oligomers להיות מנותח הזרם לא יעלה על 25 מילי-אמפר.

1. להרכיב את הג'ל עמוד הלא denaturing בתא ג'ל. מלאו tהוא תא פנימי וחיצוני עם חיץ ריצה מראש צונן (טבלה 1).
2. טרום להפעיל את הג'ל עם חיץ ריצה מראש צונן במהירות של 25 מיליאמפר לכל ג'ל במשך 15 דקות בחדר הקר על 4 מעלות צלזיוס.
3. מערבבים 15 μl של lysates מוכן לעיל עם 5 μl של חיץ מדגם 4x (טבלה 1). אין להרתיח את המדגם.
4. טען 15 μl של מדגם ורמת חלבון יליד הבחירה על הג'ל. הפעל את הג'ל על 25 מילי-אמפר עבור 4 שעות בחדר קר ב 4 ° C..
   הערה: עבור ניתוחים וכמותיות, פרוטוקול כימות חלבון (למשל ברדפורד חלבון assay ²³⁾ יכול להתבצע על מנת להבטיח טעינה של כמויות שוות של חלבון הכולל לכל נתיב.

3. כתם המערבי

הערה: מתוארת להלן הפרוטוקול של מערכת כתם מערבית רטובה. ניתן להשתמש בכל קרום סופג. הפעל פלואוריד polyvinylidene (PVDF) ממברנות מתנול 100% לפני איזון ב סופג buffer. טכניקת הכתם המערבית חצי היבשים יכולה לשמש לחלופין, אבל צריך להיות מותאם במיוחד מתחמי oligomeric גדולים.

1. לפרק את הג'ל ובזהירות להעביר אותו למאגר SDS (טבלה 1).
2. דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר תוך רעד בעדינות.
3. כן 2 ספוגים, 4 גיליונות נייר תאי מסנן קרום סופג לכל ג'ל. משרים אותם סופג חיץ (טבלה 1).
4. הרכב את הכריך כדלקמן (מלמטה למעלה): 1 ספוג, 2 גיליונות נייר תאיים מסנן, קרום, ג'ל, 2 גיליונות נייר תאיים מסנן, 1 ספוג.
5. מכניסים את הכריך לתוך הטנק סופג. ודא כי הקרום פונה קוטב בתוספת בעוד ג'ל פונה קוטב מינוס.
6. מלאו את מיכל סופג עם חיץ סופג מראש צונן.
7. כתם ב 90 mA הלילה ב 4 מעלות צלזיוס במשך תוצאות העברת חלבון הטובות ביותר.
8. לפרק את הכריך ולדמיין תקן החלבון ידי דוגרי קרום Poncפתרון S eau במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
9. Destain הממברנה על ידי שטיפה את Ponceau S בזהירות עם מים ללא יונים עד שאתה יכול לראות את הלהקות בבירור התקן החלבון.
10. סמן את הלהקות של תקן החלבון באמצעות עט.
    הערה: שיורי Ponceau S יכול להפריע immunostaining. כדי למנוע זאת, הקרום ניתן destained עוד יותר על ידי דגירה ב 0.1 M NaOH 1 דקות ושטיפה לאחר מכן עם מים ללא יונים.
11. חסום את הממברנה עם חסימת חיץ (ראו טבלה 1) לפחות שעה 1 בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
12. דמיינו חלבון (ים) של עניין על ידי immunostaining באמצעות נוגדנים המכוונים נגד החלבון להיות מנותח.
    הערה: החלבון האנושי MxA היה דמיין באמצעות נוגדן polyclonal הארנב ספציפי אדם MX1 מדולל 1: 1,000 בחסימת מאגר (טבלת 1). פתרון נוגדן הודגר הלילה ב 4 ° C.. לחלופין, א חד השבטיNTI-MxA נוגדן (שיבוט 143) יכול לשמש (מידע לא מוצג) ^24.

Results

באמצעות עמוד הלא denaturing, ניתחנו את המדינה oligomeric של סוג בר האנושי MxA, את MxA מוטציות ממשק dimeric (R640A) ו MxA (L617D) וכן מוטציה ממשק monomeric MxA (M527D) מ lysates תא ^12. התאים היו lysed במאגר המכיל 1% octylphenoxypolyethoxyethanol (NP-40) ו iodoacetamide כדי להבטיח חלבון solubilization והגנה על קבוצות תיאול בחינם (ראה איור 1). כפי שתוארו קודם לכן, מלח מטבוליטים קטנים הוסרו על ידי דיאליזה ^19. הפרדת חלבון בוצעה על ידי עמוד הלא den...

Discussion

כאן אנו מתארים שיטה פשוטה המאפשרת הקביעה המהירה של מדינת oligomeric של חלבונים לידי ביטוי בתאי יונקים ידי עמוד הלא denaturing ואחריו ניתוח כתם מערבי. היתרון העיקרי של גישה זו היא כי המדינה oligomeric של חלבון נתון ניתן לקבוע מן lysates התא כולו ללא טיהור חלבון לפני. זו עשויה להיות חשובה עבור חלבוני oligomerize או להפעיל תפקידם בשיתוף עם גורמי עזר. בנוסף, החלבונים הם עדיין במצב הטבעי שלהם ואם חילוץ נוסף מן הג'ל, הפעילות האנזימטית או פונקציות חלבון אחרות ניתן לקביעה, בקורלציה למ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
יחידות דיאליזה Slide-A-Lyzer MINI, 10K MWCO, 0.5 מ"ל	Thermo Fisher Scientific	69570	שיווי משקל מקדים במאגר דיאליזה (אם רוצים להסיר גליצרול) ניתן לייצור עצמי על פי Fiala et al. 2011
4– 15% ג'ל חלבון טרומי Mini-PROTEAN TGX, 10 בארות,	Bio-Rad	456-1083	הפעלה מוקדמת במאגר רץ להתאמת מערכת החיץ
cOmplete, Mini, ללא EDTA		11836170001	להשתמש בטבליה אחת לכל 50 מ"ל
PBS, pH 7.4  בקבוק 500 מ"ל Gibco	Thermo Fisher Scientific	14190-094
Ponceau S solution	Sigma-Aldrich	P7170	<חזק>רעיל ללבוש כפפות ולהגן על העיניים
NativeMark Unstained Protein Standard  50 µ l	Invitrogen	P/N 57030	עומס 5 ומיקרו; l/well
תאי A549	ATCC	ATCC CCL185	גדלים במצע גידול (ראה <חזק>טבלה 1)
תאי Vero	ATCC	ATCC CCL81	גדלים במדיום גידול (ראה <חזק>טבלה 1)
נוגדן נגד Mx1	Novus Biologicals	H00004599_D01P	השתמש בדילול של 1:1,000
ECL אנטי-ארנב IgG, נוגדן שלם מקושר לחזרת פרוקסידאז (מ חמור)	GE-Healthcare	NA934V	שימוש בדילול של 1:10,000
0.5% טריפסין-EDTA (1x)              Life Technologies	תרמו פישר	15400-054
יודואצטמיד    5 גרם	Sigma-Aldrich	I-6125	מלאי  100 מ"מ
Bromphenolblue	Sigma-Aldrich	B0126-25G
DMEM +4.5 גרם/ליטר גלוק,+L-Glut,+טכנולוגיות חיים פירובט	תרמו פישר סיינטיפיק	41966-029
עט  סטרפטוקוקוס 100 x        100 מ"ל                            לייף טכנולוג'יז	תרמו פישר סיינטיפיק	15140 - 130
גלוטמקס 100x סטוק, 100 מ"ל        Life Technologies	Thermo Fisher Scientific	350500-038
סרום בקר עוברי, דיאליזה, מקור ארה"ב 500 מ"ל Gibco Lot: 42G9552K	Thermo Fisher Scientific	10270-106
נייר סינון תאית	Bio-Rad	1703965
PVDF blotting  ממברנה	GE-Healthcare	10600022
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Biosolve	0020092391BS
נתרן פלואוריד (NaF)	Sigma Aldrich	S-7920
NP-40	Calbiochem	492015
cOmplete, Mini, נטול EDTA
Tween 20	Calbiochem	6555204
CHAPS תמיסה 10%	Amresco	N907
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma Aldrich	43819
Glycine	Biosolve	0007132391BS
נתרן אורתוואנדאט (Na3VO4)	סיגמא אולדריץ'	450243
גליצרול	סיגמא אולדריץ	G7757
β-גליצרופוספט	סיגמא אולדריץ'	G9422
אבקת חלב	Migros/Switzerland
מתנול	Millipore	1.06009
נתרן קלוריד (NaCl)	סיגמא אולדריץ'	71380
מגנזיום כלוריד (MgCl2)	אמרסקו	288
נתרן דודציל סולפט (SDS)	סיגמא אולדריץ'	L4509
נתרן הידרוקסיד (NaOH)	סיגמא אולדריץ'	S-8045