הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

אפיון של קומפלקסים חלבונים Multi-למקטע של MxA האדם שימוש ללא denaturing polyacrylamide ג'ל אלקטרופורזה

10.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54683

⸱

28 באוקטובר 2016

 , 
1Institute for Medical Virology, University of Zurich, 2Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research

במאמר זה

סיכום

מאמר זה מתאר פרוטוקול פשוט ומהיר להערכת המצב האוליגומרי של חלבון GTPase MxA דמוי דינמין מליזאטים של תאים אנושיים באמצעות שילוב של PAGE שאינו דנטורציה עם ניתוח כתמים מערביים.

תקציר

היווצרות קומפלקסים אוליגומריים היא תנאי הכרחי למבנה ותפקוד תקינים של חלבונים רבים. חלבון האפקטור האנטי-ויראלי MxA המושרה על ידי אינטרפרון מפעיל פעילות אנטי-ויראלית רחבה נגד נגיפים רבים. MxA הוא GTPase דמוי דינמין ויש לו יכולת ליצור מבנים אוליגומריים מסדר גבוה יותר. עם זאת, האם אוליגומריזציה של MxA נדרשת לפעילותו האנטי-ויראלית היא נושא לוויכוח. אנו מתארים כאן פרוטוקול פשוט להערכת המצב האוליגומרי של MxA המתבטא באופן אנדוגני או אקטופי בחלק הציטופלזמי של קווי תאים אנושיים על ידי אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד ללא דנטורציה (PAGE) בשילוב עם ניתוח כתמים מערביים. שלב קריטי בפרוטוקול הוא בחירת חומרי ניקוי למניעת צבירה ו/או משקעים של חלבונים הקשורים במיוחד לממברנות תאיות כגון MxA, מבלי להפריע לפעילותו האנזימטית. היבט מכריע נוסף של הפרוטוקול הוא ההגנה הבלתי הפיכה על קבוצות התיול החופשיות של שאריות ציסטאין על ידי יודואצטמיד כדי למנוע אינטראקציות מלאכותיות של החלבון. פרוטוקול זה מתאים להערכה פשוטה של המצב האוליגומרי של MxA ויתר על כן מאפשר מתאם ישיר של הפעילות האנטי-ויראלית של מוטציות ממשק MxA עם המצבים האוליגומריים שלהם.

מבוא

המבנה הרביעון של חלבון ממלא תפקיד מכריע בתהליכים תאיים רבים. מסלולי איתות, ביטוי גנים, ואנזים הפעלה / ביטול הפעלה כל מסתמכים על ההרכבה הנכונה של קומפלקסי חלבונים 1-4. תהליך זה ידוע גם בשם שָׁוֶה או-oligomerization הטרו נובע קוולנטי בלתי הפיך או הידרופובי אלקטרוסטטית הפיך אינטראקציות חלבון-חלבון. Oligomerization לא רק מגוונת את תהליכים תאיים שונים מבלי להגדיל את גודל הגנום, אלא גם מספק אסטרטגיה חלבונים לבנות מתחמי יציבה כי הם עמידים יותר כלפי denaturation והשפלה 5. פגמים oligomerization להשפיע על תפקודם של חלבונים והוא יכול להוביל להתפתחות של מחלות. לדוגמה, hydroxylase פנילאלנין האנזים יוצר מורכבות tetrameric. כמה מוטציות במתחם חלבון יכול להחליש את היווצרות tetramer ולהוביל פנילקטונוריה מחלת 6.

s = "jove_content"> חלבון MxA האדם הוא אינטרפרון (IFN) -induced חלבון מפעיל אנטי הפעלת פעילות אנטי רחבה נגד RNA השונה וכן נגיפי DNA 7. היא שייכת superfamily של GTPases גדול דמוי dynamin ויש לו את היכולת ליצור מבנים oligomeric גדול במבחנה 8. Oligomerization הוצע להגן MxA מפני השפלה המהירה 9,10. למרות ניסיונות נמרצים מצד קבוצות מחקר רבות, את המנגנון המולקולרי של פעולה נותר חמקמק בעיקר ואת תפקידה של מדינת oligomerization של MxA לתפקוד אנטי שלה נמצא תחת דיון 9,11,12. בהקשר זה, גאה ועמיתים לעבודה הציעו מודל שבו MxA מפעיל הפעילות אנטי שלה על ידי אינטראקציה עם נוקלאופרוטאינים ויראלי בצורה של מבני oligomeric גדולים דמוית טבעת 11. עם זאת, ולאחרונה, הראינו כי הדימרים MxA תערוכת פעילות אנטי אינטראקציה עם nucleoprotein של נגיף שפעת A 12. Based על המבנה הגבישי של MxA, גאו ועמיתים לעבודה זיהו מספר שאריות חומצת אמינו באזורי ממשק כי הם קריטיים עבור oligomerization שלה במבחנה ותפקוד אנטי שלה 11,13. לכן, על מנת להבהיר הקובעות oligomeric של MxA מפעיל פעילות אנטי, ביקשנו להקים פרוטוקול פשוט במהירות כדי לקבוע את המצב oligmeric של מוטציות ממשק MxA לידי ביטוי בתאים אנושיים, כמו גם אנדוגני MxA הביע לאחר גירוי IFNα.

אמנם יש טכניקות רבות שאינם בשימוש נפוץ כדי לחקור את האינטראקציה בין חלבונים כגון החלבון המפוצל גרין פלורסנט (פיצול-GFP) assay השלמה 14, תהודת plasmon משטח 15 והעברת אנרגית תהודת פורסטר (סריג) 16, הם אינם מספקים מידע של stoichiometry המדויק של קומפלקס חלבוני oligomeric. לקבלת חקירה של היבט מסוים זה, טכניקות כגוןפיזור רב-זווית אור (יונקים) 17 ו ultracentrifugation אנליטית 18 הם מאוד שימושיים. בדרך כלל, את החלבונים נותחו באמצעות שיטות אלה הם חלבונים מטוהרים. תהליכי oligomerization עשויים להיות תלויים גם בגורמים תאיים אחרים. אם הגורמים הללו אינם ידועים, הניתוח הוא יותר קשה. בנוסף, כמה חלבונים שקשה לבטא ב E. coli כדי לטהר. לכן, שיטות אלה אינן הבחירה האופטימלית לנתח oligomerization חלבון בסביבת הסלולר. בנוסף, טכניקות אלה דורשים מכשירים יקרים אשר אינם זמינים.

ג'ל polyacrylamide ללא denaturing אלקטרופורזה (עמוד), כרומטוגרפיה הדרה גודל או crosslinking כימיים ואחריו סולפט dodecyl נתרן קונבנציונאלי (SDS) -PAGE הם כלי שימושי לאפיון היווצרות של oligomers מ lysates תא 2,19,20. שיטות אלו אינן מחייבות ציוד מיוחד והוא יכול להיות בקלות PErformed במעבדה סטנדרטית. אנחנו בתחילה העריכו פרוטוקולים cross-linking כימיים שונים שהובילו invariantly להצטברות הלא ספציפית ומשקעים של MxA. לכן, אנחנו הבאים נבדקים פרוטוקולי עמוד הלא denaturing. כדף הלא denaturing כולל את השימוש SDS, הגירה של חלבונים תלוי תשלום מולדתם. עמוד כחול-יליד משתמש G250 הכחול המבריק coomassie לטעון חלבונים עם תשלום הכולל שלילי, בדומה SDS, אבל לא לפגל החלבון 21. למרבה הצער, coomassie משקע כחול מבריק בנוכחות מלחי גבוה קטיונים divalent (למשל Mg 2+) כלולים לעתים קרובות מאגרים תמוגה. בהתאם המאגרים בשימוש, זה עלול להיות קשה לנתח את המדגם מבלי אופטימיזציה נוספת של צעדים, עלול להיות בעל השפעה על החלבון המורכב oligomeric.

כאן אנו מציגים פרוטוקול פשוט המבוסס על שיטה שפורסמה בעבר 22 כדי לקבוע oligomerization שלחלבון אנושי MxA נגזר lysates הסלולר באמצעות עמוד הלא denaturing.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: פרוטוקול זה מבוסס על פרוטוקול העמוד הלא denaturing שפורסם בעבר 12. במחקר זה, המדינה oligomeric של החלבון MxA הוערכה באמצעות או תאים Vero overexpressing MxA או תאים A549 IFN מגורה-α להביע אנדוגני MxA. הפרוטוקול המתואר להלן ניתן להשתמש כדי לנתח את מצב oligomeric של כל חלבון בנוסף MxA. עם זאת, אופטימיזציה נוספת ייתכן שתידרש.

1. הכנת Cell Lysate עבור עמוד חדרים denaturing

הערה: כדי לנתח את מצב oligomeric של החלבון האנושי MxA בשני תאים Vero או A549, 1.0 x 10 6 התאים נקצרו. בהתאם לסוג התא או השפע של החלבון לנתח, את המספר הסלולרי צריך להיות מותאם. כמו כן, חשוב להגן על חיץ תמוגה מהחשיפה לאור, ברגע iodoacetamide הרגיש לאור מתווסף.

  1. זרע 0.3 x 10 6 A549 או Vero תאים לכל היטבעד 6-מנות היטב. שמור את התאים ב 2 מיליליטר צמיחה בינונית לכל טוב (ראה טבלה 1). דגירת תאי לילה חממת תרבית תאים (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2).
  2. קציר התאים על ידי שטיפה עם 1 מ"ל של בופר פוספט (PBS) ולנתק ידי הוספת 0.5 מ"ל של 0.25% חומצה טריפסין-ethylenediaminetetraacetic (EDTA) 1x פתרון כ 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. ברגע תאים להתנתק המנה, להוסיף 0.5 מ"ל מדיום הגידול ומערבבים בזהירות על ידי pipetting למעלה ולמטה.
  4. העברת התאים של כל אחד גם לתוך צינור אחד 2 מ"ל ו גלולה אותם באמצעות צנטריפוגות בראש הטבלה (5,000 XG, 4 ° C, 5 דקות).
  5. מוציאים בזהירות את supernatant ידי pipetting מבלי להפריע גלולה התא.
  6. שוטפים את התאים עם PBS 1 מ"ל קר כקרח על ידי pipetting ההשעיה תא בקפידה מעלה ומטה.
  7. תאים גלולים בצנטריפוגה בראש טבלה (5,000 XG, 4 ° C, 5 דקות).
  8. מוציאים בזהירות את supernatant ידי pipetting without ניתוק התא גלולה.
  9. תאי Resuspend ב 200 חיץ μl קר כקרח תמוגה (ראה טבלה 1) על ידי pipetting למעלה ולמטה ולשים על קרח.
  10. מיד, להגן lysate מן האור על ידי כיסוי הצינורות באמצעות נייר אלומיניום דגירה במשך 30 דקות על הקרח.
    הערה: לאחר הדגירה במשך 30 דקות על קרח, זה כבר לא חיוני בשמירה על lysate מחשיפה לאור, מאז להגנה על קבוצות תיאול חינם הוא בלתי הפיכה.
  11. הסר פסולת התא על ידי צנטריפוגה בצנטריפוגה בראש הטבלה מראש צונן (13,000 XG, 4 ° C, 20 דקות).
  12. לאזן עמודות דיאליזת חיץ דיאליזה (טבלה 1) בחדר הקר על 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות במהלך שלב צנטריפוגה. השתמש בעמודה עם משקל מולקולרי המנותק של 10,000.
    1. צרף את העמודות כדי מצוף לצוף ולשים אותם לתוך כוס המלאה עם חיץ דיאליזה. כדי להבטיח ערבוב עדין, להשתמש בוחש מגנטי. אל תיגע הממברנה.
      הערה: Dialysניתן לרכוש או מכינים עמודות 1.5 מיליליטר צינורות לפי הפרוטוקול שתואר על ידי פיאלה ועמיתים לעבודה 19.
  13. הסר את העמודות מתוך מאגר דיאליזת המצוף לצוף. מעבירים את lysates פינה לתוך הטור דיאליזה מוכן ידי pipetting בלי לגעת קרום. צרף את העמודות כדי מצוף לצוף ולשים אותם בחזרה לתוך הכוס מלאה עם חיץ דיאליזה.
  14. Dialyze את lysate בתוך מבחנה המכילה מאגר דיאליזה קרים כקרח (טבלה 1) לפחות 4 שעות (או רצוי לילה) בשעה 4 ° C תוך ערבוב בזהירות בעזרת בוחש מגנטי. השתמש לפחות חיץ דיאליזה 100 מ"ל עבור lysate 200 μl.
  15. מעבירים את המדגם dialysed לתוך צינור 1.5 מ"ל. הסר משקעים ידי צנטריפוגה בצנטריפוגה בראש הטבלה (13,000 XG, 4 ° C, 20 דקות). כדי למנוע ניתוק של החלבון oligomeric מתחמי להמשיך עם פרוטוקול (סעיף 2) מיד לאחר דיאליזה. אין להקפיאאת lysates המוכן.

אלקטרופורזה 2.

הערה: אלקטרופורזה בוצע כפי שתואר קודם עם כמה שינויים 22. בפרוטוקול המתואר להלן, ג'לים שיפוע מראש יצוק שימשו (שיפוע 4-15%). לחלופין, ג'ל ניתן להכין במעבדה. זה מאוד חשוב לכלול כל סוכן denaturing כגון SDS כדי למנוע ניתוק של קומפלקסים חלבונים oligomeric. זמן של אלקטרופורזה הוטב מדינות oligomeric השונות של חלבון MxA אדם. עם זאת, זה יכול להשתנות עבור חלבונים אחרים, תלוי בגודל של מתחם oligomeric כמו גם המגוון של פרדה שאמורה להיות מושגת על מנת לנתח את המורכבות. לכן, הזמן האופטימלי של אלקטרופורזה צריך להיקבע באופן אמפירי. עבור הרזולוציה המיטבית של oligomers להיות מנותח הזרם לא יעלה על 25 מילי-אמפר.

  1. להרכיב את הג'ל עמוד הלא denaturing בתא ג'ל. מלאו tהוא תא פנימי וחיצוני עם חיץ ריצה מראש צונן (טבלה 1).
  2. טרום להפעיל את הג'ל עם חיץ ריצה מראש צונן במהירות של 25 מיליאמפר לכל ג'ל במשך 15 דקות בחדר הקר על 4 מעלות צלזיוס.
  3. מערבבים 15 μl של lysates מוכן לעיל עם 5 μl של חיץ מדגם 4x (טבלה 1). אין להרתיח את המדגם.
  4. טען 15 μl של מדגם ורמת חלבון יליד הבחירה על הג'ל. הפעל את הג'ל על 25 מילי-אמפר עבור 4 שעות בחדר קר ב 4 ° C..
    הערה: עבור ניתוחים וכמותיות, פרוטוקול כימות חלבון (למשל ברדפורד חלבון assay 23) יכול להתבצע על מנת להבטיח טעינה של כמויות שוות של חלבון הכולל לכל נתיב.

3. כתם המערבי

הערה: מתוארת להלן הפרוטוקול של מערכת כתם מערבית רטובה. ניתן להשתמש בכל קרום סופג. הפעל פלואוריד polyvinylidene (PVDF) ממברנות מתנול 100% לפני איזון ב סופג buffer. טכניקת הכתם המערבית חצי היבשים יכולה לשמש לחלופין, אבל צריך להיות מותאם במיוחד מתחמי oligomeric גדולים.

  1. לפרק את הג'ל ובזהירות להעביר אותו למאגר SDS (טבלה 1).
  2. דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר תוך רעד בעדינות.
  3. כן 2 ספוגים, 4 גיליונות נייר תאי מסנן קרום סופג לכל ג'ל. משרים אותם סופג חיץ (טבלה 1).
  4. הרכב את הכריך כדלקמן (מלמטה למעלה): 1 ספוג, 2 גיליונות נייר תאיים מסנן, קרום, ג'ל, 2 גיליונות נייר תאיים מסנן, 1 ספוג.
  5. מכניסים את הכריך לתוך הטנק סופג. ודא כי הקרום פונה קוטב בתוספת בעוד ג'ל פונה קוטב מינוס.
  6. מלאו את מיכל סופג עם חיץ סופג מראש צונן.
  7. כתם ב 90 mA הלילה ב 4 מעלות צלזיוס במשך תוצאות העברת חלבון הטובות ביותר.
  8. לפרק את הכריך ולדמיין תקן החלבון ידי דוגרי קרום Poncפתרון S eau במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  9. Destain הממברנה על ידי שטיפה את Ponceau S בזהירות עם מים ללא יונים עד שאתה יכול לראות את הלהקות בבירור התקן החלבון.
  10. סמן את הלהקות של תקן החלבון באמצעות עט.
    הערה: שיורי Ponceau S יכול להפריע immunostaining. כדי למנוע זאת, הקרום ניתן destained עוד יותר על ידי דגירה ב 0.1 M NaOH 1 דקות ושטיפה לאחר מכן עם מים ללא יונים.
  11. חסום את הממברנה עם חסימת חיץ (ראו טבלה 1) לפחות שעה 1 בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
  12. דמיינו חלבון (ים) של עניין על ידי immunostaining באמצעות נוגדנים המכוונים נגד החלבון להיות מנותח.
    הערה: החלבון האנושי MxA היה דמיין באמצעות נוגדן polyclonal הארנב ספציפי אדם MX1 מדולל 1: 1,000 בחסימת מאגר (טבלת 1). פתרון נוגדן הודגר הלילה ב 4 ° C.. לחלופין, א חד השבטיNTI-MxA נוגדן (שיבוט 143) יכול לשמש (מידע לא מוצג) 24.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

באמצעות עמוד הלא denaturing, ניתחנו את המדינה oligomeric של סוג בר האנושי MxA, את MxA מוטציות ממשק dimeric (R640A) ו MxA (L617D) וכן מוטציה ממשק monomeric MxA (M527D) מ lysates תא 12. התאים היו lysed במאגר המכיל 1% octylphenoxypolyethoxyethanol (NP-40) ו iodoacetamide כדי להבטיח חלבון solubilization והגנה על קבוצות תיאול בחינם (ראה איור 1). כפי שתוארו קודם לכן, מלח מטבוליטים קטנים הוסרו על ידי דיאליזה 19. הפרדת חלבון בוצעה על ידי עמוד הלא den...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כאן אנו מתארים שיטה פשוטה המאפשרת הקביעה המהירה של מדינת oligomeric של חלבונים לידי ביטוי בתאי יונקים ידי עמוד הלא denaturing ואחריו ניתוח כתם מערבי. היתרון העיקרי של גישה זו היא כי המדינה oligomeric של חלבון נתון ניתן לקבוע מן lysates התא כולו ללא טיהור חלבון לפני. זו עשויה להיות חשובה עבור חלבוני oligomerize או להפעיל תפקידם בשיתוף עם גורמי עזר. בנוסף, החלבונים הם עדיין במצב הטבעי שלהם ואם חילוץ נוסף מן הג'ל, הפעילות האנזימטית או פונקציות חלבון אחרות ניתן לקביעה, בקורלציה למ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו מומנה על ידי מענק מהקרן הלאומית השוויצרית למדע (מענק מס' 31003A_143834) ל-JP.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
יחידות דיאליזה Slide-A-Lyzer MINI, 10K MWCO, 0.5 מ"לThermo Fisher Scientific69570שיווי משקל מקדים במאגר דיאליזה (אם רוצים להסיר גליצרול)
ניתן לייצור עצמי על פי Fiala et al. 2011
4– 15% ג'ל חלבון טרומי Mini-PROTEAN TGX, 10 בארות,Bio-Rad456-1083הפעלה מוקדמת במאגר רץ להתאמת מערכת החיץ
cOmplete, Mini, ללא EDTA 11836170001להשתמש בטבליה אחת לכל 50 מ"ל
PBS, pH 7.4  בקבוק 500 מ"ל GibcoThermo Fisher Scientific14190-094
Ponceau S solutionSigma-AldrichP7170<חזק>רעיל ללבוש כפפות ולהגן על העיניים
NativeMark Unstained Protein Standard  50 µ lInvitrogenP/N 57030עומס 5 ומיקרו; l/well
תאי A549ATCCATCC CCL185גדלים במצע גידול (ראה <חזק>טבלה 1)
תאי VeroATCCATCC CCL81גדלים במדיום גידול (ראה <חזק>טבלה 1)
נוגדן נגד Mx1Novus BiologicalsH00004599_D01Pהשתמש בדילול של 1:1,000
ECL אנטי-ארנב IgG, נוגדן שלם מקושר לחזרת פרוקסידאז (מ חמור)GE-HealthcareNA934Vשימוש בדילול של 1:10,000
0.5% טריפסין-EDTA (1x)              Life Technologiesתרמו פישר15400-054
יודואצטמיד    5 גרםSigma-AldrichI-6125מלאי  100 מ"מ
BromphenolblueSigma-AldrichB0126-25G
DMEM +4.5 גרם/ליטר גלוק,+L-Glut,+טכנולוגיות חיים פירובטתרמו פישר סיינטיפיק41966-029
עט  סטרפטוקוקוס 100 x        100 מ"ל                            לייף טכנולוג'יזתרמו פישר סיינטיפיק15140 - 130
גלוטמקס 100x סטוק, 100 מ"ל        Life TechnologiesThermo Fisher Scientific350500-038
סרום בקר עוברי, דיאליזה, מקור ארה"ב 500 מ"ל Gibco Lot: 42G9552KThermo Fisher Scientific10270-106
נייר סינון תאיתBio-Rad1703965
PVDF blotting  ממברנהGE-Healthcare10600022
Tris(hydroxymethyl)aminomethaneBiosolve0020092391BS
נתרן פלואוריד (NaF)Sigma AldrichS-7920
NP-40Calbiochem492015
cOmplete, Mini, נטול EDTA 
Tween 20Calbiochem6555204
CHAPS תמיסה 10%AmrescoN907
DL-Dithiothreitol (DTT)Sigma Aldrich43819
GlycineBiosolve0007132391BS
נתרן אורתוואנדאט (Na3VO4)סיגמא אולדריץ'450243
גליצרולסיגמא אולדריץG7757
β-גליצרופוספטסיגמא אולדריץ'G9422
אבקת חלבMigros/Switzerland
מתנולMillipore1.06009
נתרן קלוריד (NaCl)סיגמא אולדריץ'71380
מגנזיום כלוריד (MgCl2)אמרסקו288
נתרן דודציל סולפט (SDS)סיגמא אולדריץ'L4509
נתרן הידרוקסיד (NaOH)סיגמא אולדריץ'S-8045
11836170001'

מקורות

  1. Baisamy, L., Jurisch, N., Diviani, D. Leucine zipper-mediated homo-oligomerization regulates the Rho-GEF activity of AKAP-Lbc. J Biol Chem. 280, 15405-15412 (2005).
  2. Chen, C. P., Posy, S., Ben-Shaul, A., Shapiro, L., Honig, B. H. Specificity of cell-cell adhesion by classical cadherins: Critical role for low-affinity dimerization through beta-strand swapping. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 8531-8536 (2005).
  3. Jackson-Fisher, A. J., Chitikila, C., Mitra, M., Pugh, B. F. A role for TBP dimerization in preventing unregulated gene expression. Mol Cell. 3, 717-727 (1999).
  4. Torshin, I. Activating oligomerization as intermediate level of signal transduction: analysis of protein-protein contacts and active sites in several glycolytic enzymes. Front Biosci. 4, 557-570 (1999).
  5. Goodsell, D. S., Olson, A. J. Structural symmetry and protein function. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 29, 105-153 (2000).
  6. Flydal, M. I., Martinez, A. Phenylalanine hydroxylase: function, structure, and regulation. IUBMB Life. 65, 341-349 (2013).
  7. Haller, O., Kochs, G. Human MxA protein: an interferon-induced dynamin-like GTPase with broad antiviral activity. J Interferon Cytokine Res. 31, 79-87 (2011).
  8. Haller, O., Staeheli, P., Schwemmle, M., Kochs, G. Mx GTPases: dynamin-like antiviral machines of innate immunity. Trends Microbiol. 23, 154-163 (2015).
  9. Di Paolo, C., Hefti, H. P., Meli, M., Landis, H., Pavlovic, J. Intramolecular backfolding of the carboxyl-terminal end of MxA protein is a prerequisite for its oligomerization. J Biol Chem. 274, 32071-32078 (1999).
  10. Janzen, C., Kochs, G., Haller, O. A monomeric GTPase-negative MxA mutant with antiviral activity. J Virol. 74, 8202-8206 (2000).
  11. Gao, S., et al. Structure of myxovirus resistance protein a reveals intra- and intermolecular domain interactions required for the antiviral function. Immunity. 35, 514-525 (2011).
  12. Nigg, P. E., Pavlovic, J. Oligomerization and GTP-binding Requirements of MxA for Viral Target Recognition and Antiviral Activity against Influenza A Virus. J Biol Chem. 290, 29893-29906 (2015).
  13. Gao, S., et al. Structural basis of oligomerization in the stalk region of dynamin-like MxA. Nature. 465, 502-506 (2010).
  14. Ghosh, I., Hamilton, A. D., Regan, L. Antiparallel leucine zipper-directed protein reassembly: Application to the green fluorescent protein. J Am Chem Soc. 122, 5658-5659 (2000).
  15. Patching, S. G. Surface plasmon resonance spectroscopy for characterisation of membrane protein-ligand interactions and its potential for drug discovery. Biochim Biophys Acta. 1838, 43-55 (2014).
  16. Kenworthy, A. K. Imaging protein-protein interactions using fluorescence resonance energy transfer microscopy. Methods. 24, 289-296 (2001).
  17. Wyatt, P. J. Light-Scattering and the Absolute Characterization of Macromolecules. Analytica Chimica Acta. 272 (93), 1-40 (1993).
  18. Howlett, G. J., Minton, A. P., Rivas, G. Analytical ultracentrifugation for the study of protein association and assembly. Curr Opin Chem Biol. 10, 430-436 (2006).
  19. Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates. J Vis Exp. , (2011).
  20. Zou, H., Li, Y., Liu, X., Wang, X. An APAF-1.cytochrome c multimeric complex is a functional apoptosome that activates procaspase-9. J Biol Chem. 274, 11549-11556 (1999).
  21. Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal Biochem. 217, 220-230 (1994).
  22. Walker, J. M. Nondenaturing polyacrylamide gel electrophoresis of proteins. Methods Mol Biol. 32, 17-22 (1994).
  23. Stoscheck, C. M. Quantitation of protein. Methods Enzymol. 182, 50-68 (1990).
  24. Wisskirchen, C., Ludersdorfer, T. H., Muller, D. A., Moritz, E., Pavlovic, J. Interferon-induced antiviral protein MxA interacts with the cellular RNA helicases UAP56 and URH49. J Biol Chem. 286, 34743-34751 (2011).
  25. Stertz, S., et al. Interferon-induced, antiviral human MxA protein localizes to a distinct subcompartment of the smooth endoplasmic reticulum. J Interferon Cytokine Res. 26, 650-660 (2006).
  26. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochim Biophys Acta. 1666, 105-117 (2004).
  27. Kochs, G., Haener, M., Aebi, U., Haller, O. Self-assembly of human MxA GTPase into highly ordered dynamin-like oligomers. J Biol Chem. 277, 14172-14176 (2002).
  28. Kochs, G., Haller, O. GTP-bound human MxA protein interacts with the nucleocapsids of Thogoto virus (Orthomyxoviridae). J Biol Chem. 274, 4370-4376 (1999).
  29. Reichelt, M., Stertz, S., Krijnse-Locker, J., Haller, O., Kochs, G. Missorting of LaCrosse virus nucleocapsid protein by the interferon-induced MxA GTPase involves smooth ER membranes. Traffic. 5, 772-784 (2004).
  30. Wisskirchen, C., Ludersdorfer, T. H., Muller, D. A., Moritz, E., Pavlovic, J. The cellular RNA helicase UAP56 is required for prevention of double-stranded RNA formation during influenza A virus infection. J Virol. 85, 8646-8655 (2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

אוליגומריזציה של MxAPAGE לא דנטורטיביאנליזת Western Blotהגנה באמצעות יודו-אצטמידהכנת ליזאט תאיםשיווי משקל של בופר דיאליזהאפיון קומפלקס חלבוניםהערכת פעילות אנטי-ויראליתזיהוי MxA אנדוגניאנליזת היווצרות טטראמרים
אפיון של קומפלקסים חלבונים Multi-למקטע של MxA האדם שימוש ללא denaturing polyacrylamide ג'ל אלקטרופורזה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.