כתב יד זה מתאר כמה פרוטוקולים לניהול סוכנים תרופתיים כדי דבורי דבש, כולל בשיטות לא פולשניות פשוט לדבורים חינם-עף, כמו גם הגירסות פולשני יותר המאפשרות טיפול מקומי מדויק של דבורים מאופקות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מניפולציה Neuropharmacological של מאופקים חינם-עף דבש דבורים,
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
דבורי דבש להפגין יכולת למידה מדהימה והתנהגות חברתית מתקדמת ותקשורת. בנוסף, המוח שלהם הוא קטן, קל לדמיין ללמוד. לכן, דבורים כבר זמן רב מודל מועדף בקרב neurobiologists ו neuroethologists ללימוד הבסיס העצבי של התנהגות חברתית טבעית. חשוב, עם זאת, כי השיטות הניסיוניות בשימוש ללמוד דבורים לא להפריע התנהגויות נלמדות. בגלל זה, זה כבר צורך לפתח מגוון של טכניקות מניפולציה תרופתית של דבורי דבש. במאמר זה אנו מדגימים שיטות לטיפול מאופקים או ללא עף דבורי דבש עם מגוון רחב של סוכנים תרופתיים. אלה כוללים הם בשיטות לא פולשניות כגון טיפולי בעל פה ו אקטואלי, כמו גם שיטות פולשניות יותר המאפשרות משלוח סמים מדויק או אופנה מערכתית או מקומית. לבסוף, אנו דנים את היתרונות והחסרונות של כל שיטה ולתארמשוכות נפוצות וכיצד להתגבר עליהם הכי טוב. נסיים דיון על החשיבות של התאמת שיטת הניסוי לשאלות הביולוגיות ולא להיפך.
מבוא
מאז קרל פון פריש הובהר שפת המחול שלהם 1, דבורי הדבש נותרו מין מחקר פופולרי עבור חוקרים בהתנהגות בעלי חיים ונוירוביולוגיה. בשנים האחרונות מספר עצום של תחומים חדשים צמחו בצומת של שני מישורים אלו, וכמה דיסציפלינות אחרות (למשל, ביולוגיה מולקולארית, גנומיקה, ומדעי מחשב) שהתעוררו לצידם. זה הוביל להתפתחות המהירה של תיאוריות ומודלים חדשים להבנת התנהגות שמקורו בפעילות בתוך מערכת העצבים. בגלל אורח החיים הייחודיים, הרפרטואר ההתנהגותי עשיר, וקלות המניפולציה ניסויית תרופתית, דבורים נותרו בחזית המהפכה הזו.
דבורי דבש נמצאים בשימוש בחקר שאלות הנוירוביולוגי בסיסיות כגון אלה למידה שבבסיס וזיכרון 2,3, קבלת החלטות 4, 5 חוש ריח, או חזותי עיבוד 6. בשנים האחרונות, כבדבורת EY יש גם שמשה כמודל נושאים לומדים שמורים בדרך כלל למחקרים רפואיים, כגון השפעת הסמים ממכרים 7 - 11, השינה 12, הזדקנות 13, או מנגנוני הרדמה 14.
בניגוד עבור אורגניזמים מודל גנטי הקלסיים (למשל, melanogaster ד, C. elegans, musculus מ), יש מעט מאוד כלים גנטיים זמינים עבור מניפולציה בתפקודים עצביים בקרב דבורי דבש, אם כי זה כרגע בשינוי 15. במקום זאת, מחקרי דבורת הדבש הסתמכו בעיקר על מניפולציות תרופתיות. זה היה מוצלח מאוד; עם זאת, המגוון של מחקר דבורה הוא כזה מגוון של שיטות ממשל תרופתי נדרש. מחקר עם דבורי דבש מתמודד עם שאלות מגוונות מאוד, הוא למד על ידי חוקרים מדיסציפלינות שונות ורקעים, ומשתמש במגוון גישות ניסיוניות. rese רבשאלות קשתות דורשות דבורים להיות או-טיסה חינם, אינטראקצית המושבה שלהם בחופשיות, או שניהם. זה יכול להקשות כדי לעקוב אחר בחיות מעבדה הפרט, ועושה איפוק או cannulation ישים.
כדי להכיל את המגוון של מחקר דבש דבורים, במגוון שיטות משלוח הסמים יש צורך, המאפשר ממשל חזק וגמיש תוך הקפדה כי pharmacokinetic ופרופילי pharmacodynamic, הפולשנות של השיטה, והאמינות שלו, להתאים את הפרדיגמה מדובר. בגלל הצרכים המגוונים הללו, רוב קבוצות מחקר פיתחו שיטות והתרופות ייחודי משלהם. עד כה, זה כבר כוח של קהילת מחקר דבורה; זה הוביל להתפתחות של מערכים של שיטות המאפשרות מתן התרופה הזהה בנסיבות שונות. מטרתנו כאן אינה לפתח שיטה סטנדרטית אחת עבור מניפולציות תרופתיות של דבורים, אלא כדי להדגיש שיטותהוכח להיות מוצלח במיוחד, וחוקר עזרה לאמץ אלה. אנו דנים את העקרונות הבסיסיים של איך הם עובדים, כמו גם היתרונות והחסרונות שלהם.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. מינהל התרופות עבור דבורים רתם
- טיפול אוראלי
- הכן 1.5 M תמיסת סוכרוז על ידי ערבוב 257 גרם של סוכרוז עם 500 מ"ל מים (זה קל יותר לפזר סכום זה של סוכרוז במים רותחים). אחסן תמיסת סוכרוז על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
הערה: פתרון סוכרוז מספק סביבת מסבירים מאוד עבור מיקרואורגניזמים מסוימים, וכך בקלות הופך מזוהם והקשה לעיכול לדבורים. ניתן aliquoted ומאוחסנים תמיסת סוכרוז גורפת ב -20 ° C עד השימוש. - החלט על מינון תרופה מתאים (ואיך להשיג את זה, מופנה בסעיף הדיון בהמשך), ולהכין פתרון כזה כי מינון התרופה המועדף הוא מומס 20 μL פתרון סוכרוז (למשל, כדי לספק 20 מיקרוגרם, לדלל סמים בבית יחס של 1 מ"ג / מ"ל). דבורים רתמו פי Felsenberg et al. (2011) 16. לעשות את הצעד הזה לפחות 12 שעות לפני הטיפול תרופתי על מנת להבטיח כי דבורים הם כבר לא הדגישו out מרתימה כאשר פתרון התרופה מוצג.
הערה: לקבלת תוצאות עקביות יותר, עדיף להרעיב דבורים (על ידי הצבת דבורים רתם באינקובטור ב 34 מעלות צלזיוס ו -70% לחות) O / N. - שימוש micropipette, לגעת טיפת המים סוכרוז 1.5 M לאנטנה של דבורה רתמה. כאשר החוטם מוארך, לגעת טיפת 20 μl של 1.5 M סוכרוז המכיל את התרופה ישירות החדק של הדבורה. ודא הדבורה צורכת הכל. כפי בקרת רכב לשימוש פתרון 1.5 M סוכרוז ללא תרופות הוסיפו.
הערה: כמות תמיסת סוכרוז אולי צריכה להיות מותאמת על בסיס תוכניות ניסיוניות. אם מיזוג appetitive מיועד, האכלת הדבורים רק לפני אימון תפריע "היענות הדבורים. - בטל או להפריש דבורים שאינם צורכים כל סוכרוז.
הערה: אם מספר רב של דבורים להיכשל לשתות את תמיסת סוכרוז, את לוח זמני ההאכלה אולי צריך להיות מותאמים.
- הכן 1.5 M תמיסת סוכרוז על ידי ערבוב 257 גרם של סוכרוז עם 500 מ"ל מים (זה קל יותר לפזר סכום זה של סוכרוז במים רותחים). אחסן תמיסת סוכרוז על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
- הזרקת לתוך בית החזה
- כן תרופת דבורת דבש Ringer 17 כדלקמן:
- מערבבים החיטוי 7.45 גרם NaCl, 0.448 גרם KCl, 0.812 גרם MgCl 2, 0.735 גרם CaCl 2, 54.72 סוכרוז גרם, 4.95 גרם D- גלוקוז, ו 2.48 HEPES גרם ל -1000 מ"ל של מים. היזהר בעת אחסון רינגר כפי שהוא מזוהם בקלות. Aliquot ולאחסן רינגר ב -20 ° C עד השימוש.
- ממס את התרופה בתמיסת רינגר ואז לדלל כך את הכמות הרצויה שוהה 5 μl. כדוגמה, אם הדבורים יטופלו עם 5 מיקרוגרם של תרופה, 1 גרם ניתן להמיס תחילה 1 מ"ל רינגר, לפני דילול 1: 1,000 ב רינגר לפתרון סופי של 1 מיקרוגרם / μl.
הערה: לחלופין, זמינה מסחרי PBS (פוספט שנאגר סאלין) יכולה לשמש במקום פתרון רינגר.
- ערכו microscalpel ידי ניתוק בפינה של סכין גילוח פיפיות עםבעל להב. צרף שבר הלהב לבעל להב כך שהוא עושה להב נחמד עם נקודת קצה חדה.
- תחת סטראו, בזהירות להשתמש microscalpel לחתוך חור 2 מ"מ מעל scutellum, לצד תהליך האגף האחורי של בית החזה של דבורה. הימנע חיתוך עמוק מדי, שכן הדבר עלול לפגוע שרירי תעופה, ולהיות זהיר כדי למנוע את צירי הכנף. באופן אידיאלי, לחתוך רק משלושה צדדים, כך הדש של לציפורן יכול להיות מאוחר יותר קפל לסגור את האתר של פציעה.
- שימוש micropipette, הפקדה 5 μlL Ringer (או PBS) המכיל את התרופה על גבי החור בבית החזה. בזהירות לפקח תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח את הירידה כולו נספג לתוך hemolymph. השתמש Ringer (או PBS) כביקורת רכב.
- במידת האפשר, הזז את דש לציפורן בחזרה מעל החור. לאחר 5-10 שעות, זה יהיה לצרף ולאטום.
הערה: כחלופה טכניקה זו, להזריק 1 μl ישירות לתוך בית החזה באמצעות מזרק זכוכית, לאחר פתיחת SMAll חור באמצע frenum (הקו הרוחבי באזור האחורי של scutellum) עם מחט מזרק (קוטר: 0.6 מ"מ, G: 23). זה עוקף את הצורך הראשון לחתוך את החזה עם אזמל הזריקה הוא קטן יותר, אך שיטה זו תעזוב את הזריקה חשופה.
- כן תרופת דבורת דבש Ringer 17 כדלקמן:
- הזרקת Ocellus
הערה: זוהי שיטה מתאימה להעברת מולקולות ברחבי הקפסולה הראש, לתוך hemolymph.- הכן תרופות כמו 1.2.1, אבל להתאים ריכוזי התרופה כך המינון הרצוי יהיה הכלול 1 μl של רינגר או PBS (נפח פחות יכול להיספג דרך חור ocellus שלא דרך בית החזה).
- כן microscalpel כמו 1.2.2. תחת סטראו, לנעול את ראש הדבורה רתמה במקום על ידי מילוי נקיק הצוואר בשעווה. השתמש שעוות היתוך בטמפרטורה נמוכה (למשל, שעוות שיניים) על מנת למנוע קולטני ריח מחושים מזיקים או תאים אחרים שעשויה להיות אניmportant להערכת התנהגות (למשל, למידת חוש ריח). אז בזהירות להסיר את העדשה של ocellus החציוני על ידי החדרת קצה microscalpel תחת העדשה בעדינות לשבור את העדשה ללא הקפסולה הראש.
הערה: אפשר גם למקם שעווה בזהירות מעל האנטנות כדי למנוע תנועה. - בזהירות פיפטה תרופה לתוך החור ocellus. חכו עד שכל נלקחת הקפסולה הראש. סר שעוות שיניים מ האנטנות ולאפשר הדבורה לנוח לזמן מה לפני המשך ההליך הניסיון. השתמש Ringer (או PBS) כביקורת רכב.
- הזרקה לתוך בדרך ocellar
הערה: מערכת ocellar מכילה סיבים גדולים, חיבור ברוב אזורי המוח המרכזי 18. שיטת טיפול זו מאפשרת החלת תרכובות למוח בלבד, אבל לא מיקוד אזורי משנה מסוים של המוח.- הכן דבורה כמו 1.3.2. ולהסיר את העדשה של ocellus החציוני עם tip של microscalpel כמו 1.3.3.
הערה: ניתן לעשות זאת עד 2 שעות לפני הזריקה. בהתבסס על הניסיון שלנו, דבורים הפד מסוגלים יותר להתמודד עם הניתוח הזה מאשר דבורים מורעבים - ממלאי מזרק זכוכית 10 μl מצויד מד קטן (למשל, 33, קוטר: מיקרומטר 210) מחט עם פתרון תרופה מוכנה כמו 1.3.1.
- באמצעות micromanipulator ידני, להכניס את קצה המזרק דרך הרשתית ocellar לתוך הקפסולה ראש עד לעומק של 50 מיקרומטר ו להזריק 250 nl של פתרון.
- לאחר השימוש, יש לשטוף את המזרק 3 פעמים עם מים מזוקקים, ולאחר מכן 3 פעמים עם אתנול 75%.
- הכן דבורה כמו 1.3.2. ולהסיר את העדשה של ocellus החציוני עם tip של microscalpel כמו 1.3.3.
- Microinjection לתוך מבנים מוחיים בפרט
הערה: בנוסף הטיפולים השיטתיים שהוזכרו לעיל, ניתן לבצע microinjections לתוך מבנים מוחיים בפרט. זה מאפשר מניפולציה תרופתית של אזורי מוח אחד או יותר, תוך השארה לאחרים מעושה. זה עובדהכי טוב עם אזורים במוח, כי הם קלים לזהות ממשטח המוח הקדמי (למשל, אונות מחושים, calyces גוף פטריות או אונות אנכיות, או האונות האופטיות), אבל באזורים אחרים היו ממוקד. שימו לב כי הכיוון (קדמית / אחורית, הגב / הגחון) מתייחס לציר הגוף, ליתר דיוק, מאשר כל צירי העצבים 19.- מכינים את התרופה רינגר או PBS באותו אופן כמו 1.2.1, הוספת ניאון (למשל, 0.5 מ"ג / מ"ל Dextran, Alexa 546 או 568 פלואוריד) או לצבוע nonfluorescent (למשל, 1 מתילן מ"מ כחול).
הערה: תוספת של צבע פלואורסצנטי יאפשר אימות על המיקום הזרקת לאחר הניסוי נגמר (באמצעות מיקרוסקופ confocal, בעקבות לנתיחה המוח), ואילו צבעים nonfluorescent לאפשר ניטור ישיר במהלך הניסוי. - כדי להפוך טפטפות זכוכית להזרקה, הכנס נימי כוס בקוטר הנכון לתוך מלחציים בעל חולץ אלקטרודה (1.0 מ"מ עבור האחיזה הרגילהאה כלול עבור microinjector נזכרת ברשימת החומרים). התאימו את הגדרות משיכה וחומות לייצר טיפ 0.5 סנטימטרים כ (הגדרות תהיינה שונות עבור כל חולץ, גם אם אותו המודל משמש).
הערה: באופן אידיאלי, שתי טפטפות משך מהכוס אחד צריך להיות אותו אורך וצורה, כך הן יוכלו לשמש. - תחת סטראו, לשבור את הטיפים כדי להשיג בקוטר חיצוני של כ 10-15 מיקרומטר, על סמך הערכה ויזואלית באמצעות סולם על graticule מוכנס לתוך העין. השלבים בסולם מוגדרים על ידי היצרנית ניתן לתקן עבור ההגדלה.
- לאחר מכן, למלא את טפטפות זכוכית עם הפתרון להזריק. אם נימי זכוכית עם חוטים משמשות, למלא את פיפטה על ידי נחת הצד האחורי לתוך תמיסת התרופה, אחרת למלא קצה באמצעות טיפי microloader.
- הכנס את פיפטה זכוכית המלאה לתוך החזיק הנימים של microinjector, אשר נשלט על ידי מיל ידני או אלקטרוניcromanipulator.
- כייל את microinjector להזריק את העוצמה הרצויה (0.5-2 NL, תלוי בגודל של מבנה המוח ממוקד). לשם כך, להזריק ישירות לתוך צלחת קטנה פטרי המכילה שמן מינרלים ולמדוד את הקוטר של רביב עם graticule. שינוי הגדרות עד להשגת העוצמה הרצויה.
- תקן ראש הדבורה רתמה באמצעות שעוות שיניים רכה כמו 1.3.2, לפני החיתוך פתח אל החלק הקדמי של הקפסולה הראש, באמצעות microscalpel, עם שלושה חתכים: אחד ממש מתחת ocellus החציוני (גחון), אחד בכל הגבול של הזכות או עין שמאל אחת מעל האנטנה נובעת (הגבה). השתמש חתיכת שעוות שיניים להחזיק את דש פתח במקום.
- לחצו בעדינות בלוטות קנו נשימה שוכבת על החלק העליון של המוח הצידה באמצעות מלקחיים בסדר, ולאחר מכן לבצע קרע קטן לתוך neurilemma (קרום דק מאוד סביב המוח) מעל מבנה המוח הממוקד.
הערה: אם יטופלו דבורים רבות בו-זמנית, הליך זהניתן לבצע קודם לכן; עם זאת, יש להיזהר לא להשאיר דבורים במצב זה ארוך מדי (לא יותר מ -30 דקות), המוח שלהם עלול לייבש. - הכנס את הקצה לתוך האזור במוח הרצוי, ולהתאים עומק בניצב לפני השטח במוח (למשל, 60 מיקרומטר עבור calyces פטריות גוף). להזריק את הנפח הקבוע מראש. עבור אזורים במוח לרוחב, להזריק בילטרלי (כלומר לעשות זריקה אחת לכל מוחי). אם צבע nonfluorescent משמש, להבטיח את ההזרקה התרחשה באזור התקין עם תצפית בזמן ההזרקה. אם צבע פלואורסצנטי משמש לעשות את אותו הדבר תחת אור הניאון באמצעות סטראו עם מערכת צפיית קרינה.
- לאחר מכן, למקם את דש גב הפתוח מעל לראשו של הדבורה. ממיסים גביש של eicosane, המהווה כ 1 מ"מ קוטר, באמצעות חוט דק עטוף סביב קצה מלחם מיקרו (נמס הטמפרטורה היא 35-37 מעלות צלזיוס) ואת החותם את הקיצוצים. זה יקטין תמותה מאוד.
- שחרר אתדבורה מן הרתמה לניתוח התנהגותי (אך ראה דיון), או לשמור בתוך הרתמה לניסויים על דבורים מרוסנות - למשל, רפלקס רחבת חוטם (PER) בדיקה 20.
- אם צבע פלואורסצנטי שימש, להבטיח כי הזרקת פקדה את האזור של עניין לאחר הניסוי נגמר באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר confocal (איור. 1).
הערה: תכונה זו שימושית במיוחד כאשר המיקוד אזורי מוח עמוקים יותר (איפה זה יהיה קשה לראות לצבוע nonfluorescent במהלך שלב ההזרקה).
- מכינים את התרופה רינגר או PBS באותו אופן כמו 1.2.1, הוספת ניאון (למשל, 0.5 מ"ג / מ"ל Dextran, Alexa 546 או 568 פלואוריד) או לצבוע nonfluorescent (למשל, 1 מתילן מ"מ כחול).
2. שיטות ותרופות עבור דבורים חינם-עף
- טיפול אוראלי
- כן תרופה באותו אופן כמו צעדים 1.1.1-1.1.2. הוסף פתרון התרופה מזין ומניחים במקרר לאחסון.
הערה: כל מזין יעשה, כגון מכסה בקבוק הפוך או צנצנת ההפוכה על נייר טישו. - לאמן דבורים מזין הכבידה המכיל 1 M או 0.5M סוכרוז פתרון על ידי הצבת מזין קרוב אל הכוורת. לאחר דבורים להתחיל ליקוט במתקן ההאכלה, בהדרגה להזיז אותו רחוק עד שהוא במרחק נוח כדי למנוע עקץ (מינימום 5 מ ').
- דבורי צביעה-סימן כדי לעקוב אחר דבורי דבש פרט. ערכו רשימה של כל שילובי צבעים אשר ישמשו. כאשר אדמות דבורה במתקן ההאכלה, בזהירות לסמן בטן שלה עם שני צבעים, ורושמים ברשימה שהשילוב נלקח.
- להחליף את המזין הכביד עבור מזין המכיל את פתרון הסמים / סוכרוז. שים לב הדבורים המסומנים הפוקדים את המזין. לא יתפוס אף דבורה לא מסומנת ביקור המזין כמו דבורים הם מגייסים פורים, ומספרים של דבורי ביקור המזין המסומם יכול לצאת מכלל שליטה במהירות. זה בעייתי במיוחד אם אותו הניסוי הוא להתבצע על ימים רצופים, כמו דבורים נאיביים אולי כבר לא יהיו נאיביים.
הערה: כחלופת אימון דבורי פרט מזין, המחבר קודםהים טפח בהצלחת מי סוכרוז- שלב תרופת כוורת שלמה 21 - 23.
- כן תרופה באותו אופן כמו צעדים 1.1.1-1.1.2. הוסף פתרון התרופה מזין ומניחים במקרר לאחסון.
- טיפול מקומי
הערה: המטרה היא לפזר את המתחם של עניין ממס שיכול לחדור לציפורן חרקים דונגי. ניתן להשתמש ממסים שונים למטרה זו. הנפוץ ביותר כוללים אצטון, dimethylformamide (DMF) ו dimethylsulphoxide (DMSO).- הערך אילו ממס עובד הכי טוב במתחם בהישג יד. אם הפנוטיפ חזק צפוי ממנת יתר (למשל, שיתוק או מוות), דבורי פינוק (שלב 2.2.2) עם מינון גבוה (למשל, 20 מיקרוגרם קוק 7) מומסת כל אחד הממסים השונים לנטר בקפידה זמן עד שיתוק או מוות.
- באמצעות microcapillary 1 μL (או microsyringe, אשר יכול להיות מצויד על מנפק חוזר מתאים) בעל microcapillary, לצייר 1 μl של פתרון התרופה (למשל, 381; g / μl של קוק) לתוך הנימים. לגרש את הירידה, ובזהירות לצייר אותו על החזה של דבורה ניכרת. מכסים כמו גדול איזור אפשרי עם הפתרון, ולא להשאיר טיפה מוצקה, כמו הדבורה עשויה מכן מטפח את זה. היזהר שלא לאפשר במתחם לפנות לאגף צירים, או זו עשויה למשוך אותו אל מחוץ החזה ולאורך כנפיים במקום זה יתאדה מבלי להיטמע לתוך hemolymph.
הערה: בהתאם יעדי המחקר, שיטה זו יכולה לשמש גם על מנת להחדיר תרופות אל הבטן של הדבורה. עם זאת, תרופות להגיע CNS מהר ובכמויות גדולות כאשר נמרח על שיטת 24 .זה החזה עובד באותה מידה עם רתם כמו דבורים חינם טוס.
- טיפול Volatilized
- ממיסים סמים (בעבר בשיטה זו נעשה שימוש כדי לספק קוקאין דבורי הדבש 10) באתנול 100%. כדי להבטיח מסיסות, לא להשתמש hydrochloride או צורות מלח שניות שלהתרופה במידת האפשר. בעת ביצוע דילול להכין אותו כך שהסכום שיימסר דבורה שוהה 100 μl. השתמש אתנול טהור כביקורת רכב.
- כדי ליצור נימה, השתמש בפרוצדורה זהה כמו מק-קלאנג והירש 25.
- בקצרה הסביר: לסכם תחילי ניכרום בחוזקה סביב מסמר ולצרף שני חוטי חשמל (אחד בכל קצה של חוט להט). הסר את המסמר. סליל nichrome נותר המכונה הנימה.
- השחל את שני חוטים דרך חורים שנקדחו בקפידה במכסה של צינור צנטריפוגות 50 מיליליטר, שאמורה להיות עמיד לטמפרטורה הנבחרת. מדביקים את החוטים במקום עם סיליקון נוזלי.
הערה: פעולה זו תהפוך את הצינור אטום. זה חיוני כדי להימנע מחשיפה משנית הנסיין ולהבטיח כי הדבורים מטופלות עם המינון המתאים.
- חבר את החוט שמוביל הנימה למקור חשמל. שימוש תרמי כדי למדוד את הטמפרטורה שלהנימה, ניסוי עם שילובי מתח שונה / נוכחיים עד אחד שתוצאתו פרופיל טמפרטורה מתאים התרופה שבמחלוקת, באופן אידיאלי, אחד המאפשר עבור 10 שניות של חימום או פחות. זה מאוד חשוב, עיין ספרות רלוונטית (למשל, על מנת קוק לנדוף זה צריך להיות מחומם ל לפחות 200 ° C, אך בטמפרטורות מעל 350 מעלות צלזיוס הוא נשבר למתחמים משני 26).
- בזהירות פיפטה 100 μl של תרופה המכילה פתרון אתנול על הנימה. מורח את הנוזל על פני שטח נימה ככל האפשר כמו זה יהיה להגביר את יעילות אידוי. השאר את הנימה החשופה בטמפרטורת חדר עד שכל אתנול התאדה.
הערה: אם אתנול הוא לא התאדה מספיק, דבורים יטופלו הן תרופת הבחירה ואתנול. דבורים רגישים במיוחד אתנול, וכמה יש תרופות אינטראקציות סינרגיסטי עם אתנול, אשר יהיה לשעבר הטיהתוצאות perimental. - לאחר אתנול התאדה לחלוטין (משקע תרופה בדרך כלל ניתן לראות על הנימה היבשה תחת מיקרוסקופ), לתפוס דבורה חינם-עף בתוך שפופרת 50 מיליליטר. בזהירות ולסגור את המכסה המכיל הנימה.
- הפעילו את המחשב במשך 10 שניות, כבה את החשמל ומתן עוד 50 שניות (כדי לאפשר במתחם volatilized להתקרר ובכך לדחוס או פיקדון). שחרר את הדבורה.
הערה: בעוד שיטת טיפול זו עובדת מצוינת עבור דבורים חינם-עף, ניתן להשתמש בו רק בצורה יעילה עם דבורים רתמו. כל שעליך לעשות הוא לחבר את דבורה רתם בתוך שפופרת 50 מ"ל. רענן נימה כמתואר 2.3.4 בין דבורים. עבור תפוקה גבוהה יותר, כמה חוטים יכולים לשמש במקביל.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
מבחר תוצאות נציגי השיטות שתוארו לעיל נראה לעין, בעיקר על מנת להוכיח כי השיטות לאפשר סוכנים תרופתיים כדי להגיע למוח להשפיע על התנהגות דבורת דבש.
השפעות ספציפיות על תהליכים מוחיים ניתן להשיג בקלות לאחר הזרקת חזה.
בגלל סוכנים תרופתיים מוזרק דרך החזה עשוי...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
השיטות שתוארו לעיל מאפשרות טיפול פשוט, יעיל ויציב של כל אחד חופשי-עף או דבורי דבש רתמו. שיטות אלו עולות בקנה האחד עם פרדיגמות ניסוי רבים ושאלות ביולוגיות (טבלה 1). כל השיטות-טיסה חינם ניתן ליישם בקלות לדבורים רתמו. ההפך הוא פחות מוצלח, לעומת זאת, מאז איפוק זמני ושיטות טיפול פולשני לעתים קרובות יכולים להתפשר היכולת עפה של הדבורים.
השיטות הוצגו מנקודת מבט מוח ממוקד. זה לא בשל מגבלות מובנות של הטכני...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
פרויקט זה מומן על ידי DP0986021 המענקים של ARC ו-NHMRC 585442. ABB נתמכת על ידי מלגת ARC Future (FT140100452). JAP נתמך על ידי מלגת iMQRES המוענקת על ידי אוניברסיטת Macquarie ועל ידי DAAD-Doktorandenstipendium המוענק על ידי שירות החילופין האקדמי הגרמני. JMD נתמך על ידי CNRS ואוניברסיטת פול סבטייר.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| סוכרוז | סיגמא-אולדריץ' | S8501 | כל ספק יעשה |
| נתרן כלורי | סיגמא-אולדריץ' | S7653 | |
| אשלגן כלורי | סיגמא-אולדריץ' | P9333 | |
| מגנזיום כלוריד הקסהידרט | סיגמא-אולדריץ' | M2670 | |
| סידן כלוריד דיהידרט | סיגמא-אולדריץ' | C8106 | |
| דקסטרוז מונוהידראט | סיגמא-אולדריץ' | 49159 | |
| חוצץ פוספט מלח (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| שעוות הגנה | Dentaurum | 124-305-00 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| dimethylformamide | Sigma-Aldrich | D4551 | |
| 95% אתנול | Sigma-Aldrich | 493511 | |
| נימי זכוכית | WPI | 1B100F-3 | |
| 23 G מחט NanoFil | WPI | NF33BV-2 | |
| עדין מאוד forsceps | Dumont | 0208-55-PO | |
| אלקטרודה חולץ | SRI | 2001 | |
| FemtoJet מיקרו-מזרק | Eppendorf | 5247 000.01 | |
| Eicosane | Sigma-Aldrich | 219274 | |
| מיקרומניפולטור ידני | Brinkmann Instrumentenbau | MM-33 | |
| מיקרומניפולטור אלקטרוני | Luigs & Neumann Feinmechanik + Elektortechnik | יחידת ג'וניור XYZ | |
| סטריאומיקרוסקופ | Leica | M80 | |
| מלחם ברזל הלחמה | Weller | WESD51 | |
| Dextran, Alexa Fluor 546, 10,000 | MW ThermoFisher Scientific | D-22911 | |
| Dextran, Alexa Fluor 568, 10,000 MW | ThermoFisher Scientific | D-22912 | |
| צלחת פטרי קטנה | Sigma-Aldrich | P5481 | |
| Sigma-Aldrich | M5904 | ||
| 50 מ"ל צינור צנטריפוגה | ThermoFisher Scientific | 339652 | |
| מלקחיים | אוסטרלי אספקה | ||
| מחזיק ומפסק להב | אספקה אנטומולוגית אוסטרלית | E130 | |
| סכין גילוח | פיפיות נוצהThermoFisher Scientific | 50-949-135 | |
| ניכרום | כל ספק יעשה | ||
| חוטי | כל ספק יעשה | ||
| צבע | דגם Tamiya ארה" | ב תלוי בצבע | |
| מתקן חוזר | חברת המילטון | PB-600-1 | |
| מזרק זכוכית | WPI | NANOFIL | |
| מערכת צפייה פלורסנט | Nightsea | SFR-GR | |
| graticule | ProSciTech | S8014-24 | |
| מיקרו-נימי עם מחזיק | Drummond | 1-000-0010 | |
| סיליקון | כל ספק יעשה | ||
| צמד תרמי | Digitech | QM-1324 | |
| Micropipette | Eppendorf |
מקורות
- Frisch, K. . von B. ees Their Vision, Chemical Senses, and Language. , Cornell University Press. Itacha, NY. (1971).
- Giurfa, M. The amazing mini-brain: lessons from a honey bee. Bee World. 84 (1), 5-18 (2003).
- Giurfa, M. Behavioral and neural analysis of associative learning in the honeybee: a taste from the magic well. J. Comp. Physiol. 193 (8), 801-824 (2007).
- Perry, C. J., Barron, A. B. Honey bees selectively avoid difficult choices. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (47), 19155-19159 (2013).
- Giurfa, M., Sandoz, J. -C. Invertebrate learning and memory: Fifty years of olfactory conditioning of the proboscis extension response in honeybees. Learn. Mem. 19 (2), 54-66 (2012).
- Srinivasan, M. V. Honey bees as a model for vision, perception, and cognition. Annu. Rev. Entomol. 55, 267-284 (2010).
- Søvik, E., Cornish, J. L., Barron, A. B. Cocaine tolerance in honey bees. PLoS One. 8 (5), e64920(2013).
- Søvik, E., Barron, A. B. Invertebrate models in addiction research. Brain. Behav. Evol. 82 (3), 153-165 (2013).
- Søvik, E. Reward processing and responses to drugs of abuse in the honey bee, Apis mellifera. , Macquarie University. Australia. November (2013).
- Søvik, E., Even, N., Radford, C. W., Barron, A. B. Cocaine affects foraging behaviour and biogenic amine modulated behavioural reflexes in honey bees. Peer J. 2, e662(2014).
- Abramson, C. I., Stone, S. M., et al. The development of an ethanol model using social insects I: behavior studies of the honey bee (Apis mellifera L.). Alcohol. Clin. Exp. Res. 24, 1153-1166 (2000).
- Sauer, S., Kinkelin, M., Herrmann, E., Kaiser, W. The dynamics of sleep-like behaviour in honey bees. J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sensory, Neural, Behav. Physiol. 189 (8), 599-607 (2003).
- Münch, D., Kreibich, C. D., Amdam, G. V. Aging and its modulation in a long-lived worker caste of the honey bee. J. Exp. Biol. 216 (Pt 9), 1638-1649 (2013).
- Cheeseman, J. F., Winnebeck, E. C., et al. General anesthesia alters time perception by phase shifting the circadian clock. Proc. Natl. Acad. Sci. , (2012).
- Schulte, C., Theilenberg, E., Müller-Borg, M., Gempe, T., Beye, M. Highly efficient integration and expression of piggyBac-derived cassettes in the honeybee (Apis mellifera). Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111 (24), 9003-9008 (2014).
- Felsenberg, J., Gehring, K. B., Antemann, V., Eisenhardt, D. Behavioural pharmacology in classical conditioning of the proboscis extension response in honeybees (Apis mellifera). J. Vis. Exp. (47), e2282(2011).
- Burger, H., Ayasse, M., Dötterl, S., Kreissl, S., Galizia, C. G. Perception of floral volatiles involved in host-plant finding behaviour: Comparison of a bee specialist and generalist. J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sensory, Neural, Behav. Physiol. 199 (9), 751-761 (2013).
- Pan, K. C., Goodman, L. J. Ocellar projections within the central nervous system of the worker honey bee, Apis mellifera. Cell Tissue Res. 176 (4), 505-527 (1977).
- Ito, K., Shinomiya, K., et al. A systematic nomenclature for the insect brain. Neuron. 81, 755-765 (2014).
- Bitterman, M. E., Menzel, R., Fietz, A., Schäfer, S. Classical conditioning of proboscis extension in honeybees (Apis mellifera). J. Comp. Psychol. 97 (2), 107-119 (1983).
- Barron, A. B., Robinson, G. E. Selective modulation of task performance by octopamine in honey bee (Apis mellifera) division of labour. J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sens. Neural. Behav. Physiol. 191 (7), 659-668 (2005).
- Schulz, D. J., Sullivan, J. P., Robinson, G. E. Juvenile Hormone and Octopamine in the Regulation of Division of Labor in Honey Bee Colonies. Horm. Behav. 42 (2), 222-231 (2002).
- Schulz, D. J., Elekonich, M. M., Robinson, G. E. Biogenic amines in the antennal lobes and the initiation and maintenance of foraging behavior in honey bees. J. Neurobiol. 54 (2), 406-416 (2003).
- Barron, A. B., Vander Meer, R. K., Maleszka, J., Robinson, G. E., Maleszka, R. Comparing injection, feeding and topical application methods for treatment of honeybees with octopamine. J. Insect Physiol. 53 (2), 187-194 (2007).
- McClung, C., Hirsh, J. Stereotypic behavioral responses to free-base cocaine and the development of behavioral sensitization in Drosophila. Curr. Biol. 8 (2), 109-112 (1998).
- Martin, B. R., Lue, L. P., Boni, J. P. Pyrolysis and volatilization of cocaine. J. Anal. Toxicol. 13 (3), 158-162 (1989).
- Lefer, D., Perisse, E., Hourcade, B., Sandoz, J. -C., Devaud, J. -M. Two waves of transcription are required for long-term memory in the honeybee. Learn. Mem. 20 (1), 29-33 (2012).
- Urlacher, E., Soustelle, L., et al. Honey Bee Allatostatins Target Galanin/Somatostatin-Like Receptors and Modulate Learning: A Conserved Function? PLoS One. 11 (1), e0146248(2016).
- Stollhoff, N., Menzel, R., Eisenhardt, D. Spontaneous recovery from extinction depends on the reconsolidation of the acquisition memory in an appetitive learning paradigm in the honeybee (Apis mellifera). J. Neurosci. 25 (18), 4485-4492 (2005).
- Barron, A. B., Maleszka, R., Helliwell, P. G., Robinson, G. E. Effects of cocaine on honey bee dance behaviour. J. Exp. Biol. 212 (2), 163-168 (2009).
- Devaud, J. -M., Papouin, T., Carcaud, J., Sandoz, J. -C., Grünewald, B., Giurfa, M. Neural substrate for higher-order learning in an insect: Mushroom bodies are necessary for configural discriminations. Proc. Natl. Acad. Sci. , 1-9 (2015).
- Vergoz, V., Roussel, E., Sandoz, J. -C., Giurfa, M. Aversive learning in honeybees revealed by the olfactory conditioning of the sting extension reflex. PLoS One. 2 (3), e288(2007).
- Henry, M., Béguin, M., et al. A common pesticide decreases foraging success and survival in honey bees. Science. 336 (6079), 348-350 (2012).
- Søvik, E., Perry, C. J., LaMora, A., Barron, A. B., Ben-Shahar, Y. Negative impact of manganese on honeybee foraging. Biol. Lett. 11 (3), 20140989(2015).
- Farooqui, T., Vaessin, H., Smith, B. H. Octopamine receptors in the honeybee (Apis mellifera) brain and their disruption by RNA-mediated interference. J. Insect Physiol. 50 (8), 701-713 (2004).
- Guo, X., Su, S., et al. Recipe for a Busy Bee: MicroRNAs in Honey Bee Caste Determination. PLoS One. 8 (12), e81661(2013).
- Cristino, A. S., Barchuk, A. R., et al. Neuroligin-associated microRNA-932 targets actin and regulates memory in the honeybee. Nat. Commun. 5, 5529(2014).
- Vargaftig, B. B., Coignet, J. L., de Vos, C. J., Grijsen, H., Bonta, I. L. Mianserin hydrochloride: Peripheral and central effects in relation to antagonism against 5-hydroxytryptamine and tryptamine. Eur. J. Pharmacol. 16 (3), 336-346 (1971).
- Beggs, K. T., Tyndall, J. D. A., Mercer, A. R. Honey bee dopamine and octopamine receptors linked to intracellular calcium signaling have a close phylogenetic and pharmacological relationship. PLoS One. 6 (11), (2011).
- Matsumoto, Y., Menzel, R., Sandoz, J. -C., Giurfa, M. Revisiting olfactory classical conditioning of the proboscis extension response in honey bees: a step toward standardized procedures. J. Neurosci. Methods. 211 (1), 159-167 (2012).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
