מאמר שיטה

איתור של Trypanosoma brucei מיתוג גליקופרוטאין Surface Variant ידי מגנטי Activated Cell מיון cytometry זרימה

DOI:

10.3791/54715

⸱

19 באוקטובר 2016

 ,  ,  , 
1Laboratory of Lymphocyte Biology, Rockefeller University, 2Department of Biology, Harvey Mudd College, 3Masters School

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טריפנוזומים אפריקאים הגדלים במבחנה עוברים שונות אנטיגנית בשיעור נמוך, כך שאוכלוסיות מורכבות מטפילים המבטאים סוג גליקופרוטאין פני שטח דומיננטי (VSG) ואוכלוסייה קטנה של וריאנטים "מתחלפים". פרוטוקול זה מתאר שיטה מהירה לאיתור וכימות אוכלוסיות אלה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trypanosoma brucei, טפיל פרוטוזואי הגורם לטריפנוזומיאזיס אפריקאי אנושי וחייתי (הידוע כמחלת שינה ונאגנה, בהתאמה) בין וקטור הצה צה לפונדקאי יונקים. הוא מתחמק ממערכת החיסון המארח של היונקים על ידי החלפה מעת לעת של גליקופרוטאין פני השטח הצפוף והמשתנה (VSG) המכסה את פני השטח שלו. זיהוי שונות אנטיגנית ב-Trypanosoma brucei יכול להיות מסורבל ואינטנסיבי כאחד. כאן, אנו מציגים שיטה לכימות מספר הטפילים ש'התחלפו' כדי לבטא VSG חדש באוכלוסייה נתונה. הטפילים מוכתמים תחילה בנוגדנים כנגד ה-VSG ההתחלתי, ולאחר מכן מוכתמים בנוגדנים משניים המחוברים לחרוז מגנטי. טפילים המבטאים את ה-VSG ההתחלתי מופרדים משאר האוכלוסייה על ידי העברת הטפילים על עמודה המחוברת למגנט. טפילים המבטאים את ה-VSG הדומיננטי המתחיל נשמרים על העמודה, בעוד שהזרימה מכילה טפילים המבטאים VSG חדש כמו גם כמה מזהמים המבטאים את ה-VSG ההתחלתי. אוכלוסיית זרימה זו מוכתמת שוב בנוגדנים המסומנים פלואורסצנטית כנגד ה-VSG ההתחלתי לסימון מזהמים, ופרופידיום יודיד (PI), המסמן תאים מתים. מספר ידוע של חרוזי ספירה מוחלטים הנראים על ידי זרימה ציטומטרית מתווספים לאוכלוסיית הזרימה. לאחר מכן ניתן להשתמש ביחס החרוזים למספר התאים שנאספו כדי להעריך את מספר התאים בדגימה כולה. ציטומטריית זרימה משמשת לכימות אוכלוסיית המתגים על ידי ספירת מספר התאים השליליים של PI שאינם מכתימים באופן חיובי עבור ה-VSG ההתחלתי והדומיננטי. לאחר מכן ניתן לחשב את שיעור המתגים באוכלוסייה באמצעות נתוני ציטומטריית הזרימה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הטפיל protozoan, Trypanosoma brucei, הוא סוכן סיבתי של מחלות המשפיעות בני אדם (דרך Trypanosoma brucei gambiense ו Trypanosoma brucei rhodesiense) ובעלי חיים (דרך Trypanosoma brucei brucei) ברחבי אפריקה שמדרום לסהרה. החיידק מועבר המארח יונק דרך הרוק של וקטור זבוב הצה צה. שני האדם מחלת השינה Animal לגרום לנטל כלכלי חמור באזורים אנדמיים, ומעטים סמים זמינים או בפיתוח לטיפול או מחלה. הבנת מנגנוני התחמקות חיסון היא קריטית להתפתחות של תרופות עבור trypanosomiasis. וריאציה אנטיגני של המשטח הצפוף, Variant גליקופרוטאין (VSG) המאפשר לכסות את הטפיל היא אחד האמצעי העיקרי שבאמצעותו ט brucei מתחמקת תגובת הנוגדנים היונקת. כ -2,000 וריאנטים של גן VSG קיימים בגנום trypanosome, אבל רק אחד הוא עבד בכל זמן נתון מאחד ~ 15 הבעהאתרי שיאון. "מיתוג" של VSG הביע יכול להתרחש גם על ידי העתקת גן VSG לתוך אתר הביטוי הפעיל, או על ידי הפעלת תעתיק של אתר ביטוי שותק בעבר (הנסקרת ב 1).

למרות העבודה הרבה הוקדשה וריאציה אנטיגני להבנת בט' brucei, הגורמים המשפיעים מיתוג תדר עדיין הם הבינו היטב. מחקרים שנערכו עד כה כבר הקשה על ידי העובדה כי בעוד מיתוג מתרחש stochastically במבחנה, תדרי מיתוג נמצאים ברמות נמוכות מאוד, בסדר גודל של 1 בסביבות 10 6 תאים 2. זה מקשה למדוד אם עליות גורם כפל או מקטין תדר מיתוג, מאז המיתוג קשה לזהות מלכתחילה. לפני 2009, שיטות לבידוד בוררים באוכלוסיית נתונה היו ממושכות ועבודה אינטנסיבית. passaging אלה כללו trypanosomes באמצעות עכברים שחוסנו נגד VSG הדומיננטי ואז תאי קצירה3 כעבור יום, או לספור מאה תאים על ידי immunofluorescence 4,5. אסטרטגיה נוספת מסתמכת על בחירה עבור עמידות לתרופות לבודדת בוררת 6. בגלל trypanosomes אפריקה לגדל במבחנה הן בדרך כלל מורכבת אוכלוסייה גדולה להביע גרסה אחת גדולה, ואוכלוסייה קטנה בהרבה של בוררים להביע הגירסות חלופיות, אנו מתייחסים הגרסה הגדולה ברחבי נייר זה כמו VSG הדומיננטי, החל. בעשותו כן, אנו בשום פנים ואופן לא רוצה לרמוז גרסה מרכזי זה יש כושר יותר מאשר גרסאות אחרות באוכלוסייה.

כאן אנו מתארים שיטה שיכולה למדוד את מספר מהימן של trypanosomes להביע VSG הלא דומיננטית באוכלוסיה נתונה ב 3 - 4 שעות. שיטה זו שימושית במיוחד עבור כשרוצה לבדוק אם מניפולציה גנטית נתונה או טיפול תרופתי מגדילה את מספר תאי חליפה באוכלוסייה. במקום לפטור את אוכלוסיית התאים המבטאים את המטלותminant, החל VSG באמצעות תרופות או באמצעות אימונולוגית, תאים אלה בוטלו על ידי ציפוי אותם קודם עם חרוזים מגנטיים מצמידים את הנוגדן כנגד VSG הדומיננטי ואז לבודד אותם על עמודה מגנטית. אוכלוסיית החליף אז נאספה את זרימת הדרך ומוכתמת שוב עם נוגדן אנטי VSG שכותרתו fluorophore לזהות מזהמים. כימות מושגת על ידי הוספת מספר מוגדר של חרוזי ספירה מוחלטים לטעום כל כך שהיחס של חרוזי תאים ניתן לקבוע והשתמש לכמת את מספר הבוררים באוכלוסייה 7.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: לאורך כל ההליך, יש צורך לשמור על תאים על קרח. תקשורת קרה אמורה לשמש גם לאורך כל דרך.

קציר לדוגמא 1.

  1. לגדול trypanosomes הדם זן ליסטר 427 צפיפות של 0.5 - 1 מיליון / מ"ל. עדיף להתחיל תרבויות עם מספר קטן של טפילים. ספין למטה 50 x 10 6 תאים / המדגם עבור 10 דקות ב 1500 x ז. הקפד להשאיר 1 x 10 6 תאים בתרבית לשימוש מאוחר יותר להשתמש שולטת נוגדנים חיוביים ושליליים.
    הערה: פרוטוקול זה יכול לשמש גם על trypanosomes המבודד דם בעלי חיים (ראה דיון לפרטים נוספים).
  2. פיפטה או לשפוך את רוב supernatant (להשאיר כ -750 μl). מעבירים את התאים לצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל.
  3. ספין תאים ב 4 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות ב 5,200 XG ב microcentrifuge ולהסיר supernatant.

2. תיוג מגנטי

  1. Resuspend התאים 150 בינוני תרבות μl (wi HMI-9סרום ה למשל) + נוגדן אנטי VSG העיקרי בבית הדילול המתאים.
    הערה: הנוגדן אנטי VSG נעשה בבית והשתמש בכל דילול של 1:50. חשוב להשתמש נוגדן אנטי VSG ראשית שאינה שכותרתו עם fluorophore.
  2. תאים וורטקס בעזרת מערבולת מתאם-60 במהירות 6 - 8 בחדר קר על 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לשטוף עם 800 - 1,000 μl קר HMI-9 עם סרום.
  3. ספין על 4 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות ב 5,200 XG ו לשאוב supernatant. לשטוף עם 1 מ"ל HMI-9 עם סרום ספין כנ"ל. לשאוב supernatant. Resuspend גלולה ב 100 μl של HMI-9 עם סרום.
  4. להוסיף 110 μl של תא מגנט מיון מופעל microbeads (MSC). השתמש ועכבר אנטי, ארנבת אנטי, או חרוזים אנטי ביוטין בהתאם נוגדן אנטי VSG העיקרי. לערבב היטב. תאים וורטקס בחדר קר על 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  5. בעוד תאי vortexing, להגדיר עמודה / מדגם הפרדה מגנטי מופעל אחד על מגנט הפרדה. הקפד קיימת מחדשceptacle (אנו משתמשים צינור צנטריפוגות 15 מ"ל) תחת העמודה לאסוף את הזרימה דרך. הגדרת מנגנון בחדר קר.
  6. הוסף 2 מ"ל של HMI-9 עם סרום לעמודה הממשלה. לאחר תחול מקום צינור צנטריפוגות 15 מ"ל תחת העמודה לאסוף זרימה דרך מכל מדגם.
  7. לאחר דגירה 10 דקות בשלב 2.4, להוסיף 800-1,000 μl קר HMI-9 עם סרום. ספין על 4 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות ב 5,200 XG ולהסיר supernatant להסיר נוגדן מאוגד. לשטוף עם 1 מ"ל של HMI-9 עם להשאיר בסרום וחזור 100 μl של supernatant.
  8. פליק צינור צנטריפוגות במרץ חזותי לבדוק את הצינור כדי לוודא כי היא הגלולה resuspended לחלוטין. הוסף 1 מ"ל של HMI-9 עם סרום ו פיפטה למעלה ולמטה כדי לוודא שתאי הם resuspended היטב.

3. הפרדה מגנטית

  1. ודא שהעמודים דרוך כמתואר לעיל. החל תאים לעמודה. אסוף זרימה דרך עם תאים המבטאים את VS הלא הדומיננטיג 1 מ"ל של מדיום + trypanosomes בדרך כלל לוקח 6 - 7 דקות לזרום דרך העמודה.
  2. 2x לשטוף עם 1 מ"ל של HMI-9 עם סרום ולאסוף זרימה דרך באותו צינור כמו בשלב 3.1.
  3. זרימה דרך Divide (3 מ"ל) לשני צינורות 1.5 מ"ל microcentrifuge.
    הערה: אלה ניתן לשלב מאוחר יותר או חצי יכול לשמש כדי לבודד RNA, וכו '
  4. הסר עמודה מגנט. הוסף 3 מ"ל של HMI-9 עם סרום לעמודה לצלול טור לתוך צינור צנטריפוגה 15 מ"ל להשיג תאים המבטאים את ההתחלה, דומיננטי VSG. הסר 300 μl של חומר eluted לצורך ניתוח מאוחר יותר. שמור את התאים הללו על קרח.
  5. לשימוש בתור חיובי כביקורת שלילית, לקחת כ 1 מיליון תאי מתרבות המוצא של תאים מלאים גדלו ב 37 ° C (מדינות שאינן צפויות לעבור תדיר) ו פיפטה אותם לתוך צינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge.
    הערה: תאי בקרה חיוביים יהיו מוכתמים עם נוגדן fluorophore שכותרתו בשלב 4.1. הרמ"א תאי הבקרה השליליב רבב בכל שאר הפרוטוקול.
  6. זרימה דרך ספין דגימות מדגם מלא נוגדנים חיוביים על 4 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות ב 5,200 XG ולהסיר supernatant.
    הערה: עוד 300 μl aliquot של תאים eluted ניתן להשתמש כביקורת חיובית מכתים אנטי VSG.

מכתים 4. לזהות מזהמים בוררים

  1. זרימה דרך גלולת דגימות ותא בקרה חיובית ב 100 μl של HMI-9 עם סרום + עיקרי, שכותרתו fluorophore, נוגדן אנטי VSG על הדילול המתאים.
    הערה: הנוגדן אנטי VSG שכותרתו נעשה בבית והשתמש בדילול של 1: 1,000. Fluorophore שכותרתו, אנטי VSG יכול להיות מאותו מקור כמו הנוגדן ללא תווית בהפרדת MACS step.There צריך להיות 3 מ"ל של מדגם זרימה דרך בשני צינורות microcentrifuge לאחר שלב 3.5.
  2. כדי לנתח את כל הזרימה דרך על ידי זרימת cytometry, לשלב את הכדורים בשני צינורות microcentrifuge בעוד מחדש susממתינים דגימות 100 μl של HMI-9 עם נוגדן בסרום + אנטי VSG. לערבב היטב.
  3. תאים וורטקס בחדר קר על 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. להוסיף 800 - 1,000 μl קר HMI-9 עם סרום. ספין דגימות ב 4 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות ב 5,200 XG ולהסיר supernatant להסיר נוגדן מאוגד.
  4. שטפו תאים עם 1 מ"ל של HMI-9 עם סרום. ספין דגימות ב 4 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות ב 5,200 XG ולהסיר supernatant. במהלך הספין האחרון, לסובב את דגימות eluted משלב 3.4 ואת מדגם ביקורת השלילי.
  5. Resuspend כל דגימות הזרימה דרך eluted ב: 148.5 μl HMI-9 עם סרום, 25 μl חרוזים ספירה מוחלטת 1.5 μl יודיד Propidium מכתימים פתרון (175 סך μl). Resuspend דגימות בקרת נוגדנים חיוביות ושליליות 175 μl HMI-9 עם סרום. הקפד לרשום את מספר חרוזי ספירה מוחלטים / 25 μl עבור במגרש המסוים בשימוש.
  6. הפעל את כל הדגימות באמצעות cytometer זרימה ולאסוף נתונים. תאים מתים כתם כמו PI +. מזהמים להכתים כמו PI - VSG +. בוררים להכתים כמו PI - VSG - 8.
  7. חישוב מיתוג תדרים באמצעות זרימת cytometry נתונים.
    הערה: לקבלת הוראות כיצד לחשב תדרים מיתוג, עיין בקובץ משלים Flow Cytometry Calculations.docx ולוח 1.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השיטה המתוארת כאן שמשה על מנת להוכיח כי הפסקות פעמי גדיל בתוך אתר ביטוי VSG הגדיל את מספר בוררים באוכלוסייה 8. כאן, אנו מציגים תוצאות נציגים מתוך אוכלוסייה של trypanosomes זה היה יכול להיגרם באופן דומה כדי ליצור הפסקה פעמי גדיל באתר הביטוי. אנו משווים trypanosomes אלה לאלה שלא היה מושרה ליצור הפסקה פעמי גדיל. איור 1 מציג את זרימת נציג cytometry מגרש מתאי un-induced המושרים שנאספו הזרימה דרך מעמודת מיון התא המגנטית מופעל....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עם כל כבוד טכניקה ניסויית, המרכיב הקריטי ביותר של פרוטוקול השמירה על כל הדגימות קרות. Trypanosomes במהירות מאוד להפנים נוגדן מאוגד השטח שלהם 9, אך תהליך זה הוא תנועתיות תלויה, ואינו להשפיע על assay כל עוד התאים נשמרים על 4 מעלות צלזיוס. כל הדגימות תמיד צריך להיות כל הזמן על הקרח, ואת pipetting צריך להיעשות במהירות כדי לצמצם את החשיפה לסביבה מעבדה C 25 °. קרת HMI-9 עם סרום צריך להיות זמין בתחילת הניסוי צריך להישמר על קרח לאורך כל דרך. בידוד של trypanosomes ידי הפעלת אותם...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ברצוננו להודות צלב ג'ורג 'עבור ייעוץ כללי על הביולוגיה trypanosome. עבודה זו נתמכה גם על ידי ביל ומלינדה גייטס GCE מענק DS, מלגת מחקר לתארים מתקדמים NSF (dge-1,325,261) כדי MRM ו NIH / NIAID (מענק # AI085973) כדי FNP. אנו מודים גלדריאל בקתה-כורים לשימוש של הזן המכיל את אתר I-SCEI גן וההכרה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
נוגדן נגד VSG ללא תוויתn/an/aנוגדן VSG מיוצר בבית
פלואורופור עם תווית נוגדן נגד VSGn/an/aנוגדן VSG מיוצר בבית
HMI-9 מדיהn/an/aHMI-9 מיוצר בבית
Propidium IodideBD Pharmingen556463
CountBright חרוזי ספירה מוחלטתThermofisher מדעיC36950
עמודות LDMiltenyi Biotech130-042-901
מגנט MACSMiltenyi Biotech130-042-303
MACS מפריד מגנטיMiltenyi Biotech130-042-302
מתאם מערבולת-60ThermoFisher מדעיAM10014
ציטומטר זרימהקולטרn/a
תוכנת ניתוח ציטומטר זרימהFloJon/a

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Horn, D. Antigenic variation in African trypanosomes. Molecular & Biochemical Parasitology. 195 (2), 123-129 (2014).
  2. Lamont, G. S., Tucker, R. S., Cross, G. A. Analysis of antigen switching rates in Trypanosoma brucei. Parasitology. 92 (Pt 2), 355-367 (1986).
  3. Rudenko, G., McCulloch, R., Dirks-Mulder, A., Borst, P. Telomere exchange can be an important mechanism of variant surface glycoprotein gene switching in Trypanosoma brucei. Mol Biochem Parasitol. 80 (1), 65-75 (1996).
  4. Turner, C. M., Barry, J. D. High frequency of antigenic variation in Trypanosoma brucei rhodesiense infections. Parasitology. 99 (Pt 1), 67-75 (1989).
  5. Miller, E. N., Turner, M. J. Analysis of antigenic types appearing in first relapse populations of clones of Trypanosoma brucei. Parasitology. 82 (1), 63-80 (1981).
  6. Horn, D., Cross, G. A. Analysis of Trypanosoma brucei vsg expression site switching in vitro. Mol Biochem Parasitol. 84 (2), 189-201 (1997).
  7. Figueiredo, L. M., Janzen, C. J., Cross, G. A. M. A histone methyltransferase modulates antigenic variation in African trypanosomes. PLoS Biol. 6 (7), e161(2008).
  8. Boothroyd, C. E., Dreesen, O., et al. A yeast-endonuclease-generated DNA break induces antigenic switching in Trypanosoma brucei. Nature. 459 (7244), 278-281 (2009).
  9. Engstler, M., Pfohl, T., et al. Hydrodynamic Flow-Mediated Protein Sorting on the Cell Surface of Trypanosomes. Cell. 131 (3), 505-515 (2007).
  10. Mugnier, M. R., Cross, G. A. M., Papavasiliou, F. N. The in vivo dynamics of antigenic variation in Trypanosoma brucei. Science. 347 (6229), 1470-1473 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

VSG

מאמרים קשורים