הדור מהיר ויעיל של תאי גזע פלוריפוטנטיים רקומביננטי אנושי ידי recombinase בתיווך המרת קלטת ב AAVS1 לוקוס

סיכום

כאן אנו מדווחים על שיטת עריכת גן מהירה ויעילה מבוססת על RMCE שעבר על מקורות AAVS1 של תאי גזע אנושיים pluripotent (hPSCs) המשפרת על מערכות שתוארו לעיל. באמצעות טכניקה זו, קווי isogenic יכולים להיוצר במהירות ובאמינות ללימודים השוואתיים נכונים, הקלת מחקר בתיווך transgenesis עם hPSCs.

תקציר

אפילו עם המהפכה של טכנולוגיות מיקוד-גן בראשות CRISPR-Cas9, ושינוי גנטי בתאי גזע אנושיים pluripotent (hPSCs) עדיין זמן רב. מחקרים השוואתיים המשתמשים קווי רקומביננטי עם transgenes משולב לוקוסי נמל מבטחים יכולים להפיק תועלת גישות המשתמשות recombinases במיקוד ספציפי באתר, כמו Cre או FLPe, שהן יותר מהירים ופחות נוטות השפעות חוץ-יעד. כזה שיטות תוארו, למרות שהם לא להכות גן משמעותי מיקוד ברוב ההיבטים. שימוש nucleases אבץ-אצבע, יצרנו בעבר שורת תאים שני לוקוס AAVS1 של hPSCs המכיל GFP-hygromycin-tk להביע קלטת, מוקף רצפים FRT heterotypic. כאן אנו מתארים את ההליכים לבצע חילופי קלטת FLPe בתיווך recombinase (RMCE) באמצעות קו זה. ג אבell הקו טרנספקציה עם וקטור התורם RMCE, המכיל התנגדות puromycin promoterless, ועם FLPe recombinase. יישום של השנייה חיובי (puromycin) ושלילי תכנית הבחירה (FIAU) מוביל את הבחירה של RMCE ללא ואינטגרציות אקראיות. RMCE יוצרת קווי מהונדס polyclonal פלוריפוטנטיים מאופיינים במלואו ב -15 ד עם יעילות 100%. למרות שתואר מגבלות לאחרונה של מוקד AAVS1, הקלות של מערכת סוללת את הדרך עבור transgenesis hPSC במסגרות isogenic, הכרחי במחקרים השוואתיים, ומאפשרת למחצה תפוקה גבוהה מסכי גנטי רווח / הפסד של ניתוח פונקציה שאחרת להיות זמן רב מאוד.

מבוא

רקומבינציה הגנום הממוקדת יש להקל התקדמות מהירה בתחומים רבים של מחקר. בעכברים, הסינרגיה בין עריכת הגנום מחקר בתאי הגזע אפשרה הבנה מוגברת של המנגנון המורכב של תפקוד גן ואת ויסות גנים. התקדמות כזו צפויה בתאי גזע פלוריפוטנטיים אדם (hPSCs) וכן, אף ששנים רבות מאז הבידוד הראשון של בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs), ואנושי מאוחר מושרה בתאי גזע פלוריפוטנטיים (hiPSCs), עריכת הגן היוותה משוכה טכנית . התפתחויות אחרונות בהנדסת הגנום באמצעות nucleases-אבץ ממוקד nucleases אצבע (ZFNs), nucleases מפעיל דמוי מפעיל תמלול (Talen), או באשכולות interspaced בקביעות קצר חוזר palindromic / קשור-CRISPR חלבון 9 (CRISPR / Cas9) אפשרו לנו להתגבר אלה קשיים, מה שהופך ממוקד רקומבינציה תהליך יעיל ^{1 - 3.}

לוקוסים ספציפיים מעל יד הבית הגנום המאפשרים ביטוי transgene יציב, אמין, ואת בכל מקום בהעדר תופעות לוואי כמו Rosa26, Hprt1, או Col1A1, הפכו כלים חיוניים בביצוע מחקרים גנטיים. לוקוסים נמל מבטחים לאפשר ניתוח השוואה בין קווים שונים של עכברים בהקשרים isogenic. זה לא יכול להיות מושג באמצעות שיטות אינטגרציה אקראית סטנדרטיות, אשר משויכות מגבלות ידועות כמו mutagenesis insertional, תופעות תלויות במינון, או ביטוי transgene ססגוני. ג'ין בקלות עריכת וגמישות לוקוסים נמל מבטחים הוא גדל באמצעות recombinases במיקוד ספציפי באתר כמו Cre או Flippase (FLPe), אשר במיוחד לזהות רצפי היעד (loxP או FRT, בהתאמה) ו לזרז רקומבינציה יעיל בין מטרות זהות. בשל תכונותיו אלה, עריכת הגן בתיווך recombinase באמצעות רצפי loxP או FRT ב לוקוסים נמל מבטחים preintegrated הוא כלי נפוץ בשימוש בעכבר טרנסבראשית. בנוסף כניסת קלטת או כריתה בתיווך בין רצפי יעד זהים, השימוש באתרי loxP או FRT בקנה מאפשר חילופי קלטת בתיווך recombinase (RMCE) ^4.

ב אדם, מנסה לזהות לוקוסים נמל מבטחים בוצעו. העכבר HPRT orthologous, למרות הקשר שלה עם הפסד של פונקציה לש-Nyhan תסמונת, ו ROSA26 כבר ממוקד hPSCs. HPRT נמסר להשתיק במהירות ביטוי transgene ב ESC, וכמו ROSA26, יכולתה לקיים ביטוי transgene ב תאים מובחנים סופני לא נחקר ^{5 - 7.} בגלל מוטצית null הומוזיגוטים של גן CCR5 נראה נסבלת היטב בבני אדם, ערך כפי נמל מבטחים הוערך. CCR5 היה ממוקד ודיווח לקיים ביטוי transgene יציב שורות תאים אנושיות שונות, כולל ESCs ^8,9. למרות זאת,האחרון לא היה מוכח ברמה המשובטת במהלך לתרבות לטווח ארוכה, וביטוי transgene בכל המקום לא הודגם צאצאי בדיל של השלוש השכבות הניבטות. AAVS1, אתר האינטגרציה הטבעי של 2 סוג נגיף Adeno Associated (AAV), נבדק כמו גם ב hESCs, בגלל התנגדות דיווח transgene השתקה ^10. מאוחר יותר, קבוצות רבות השתמשו מוקד AAVS1 ותארו ביטוי transgene יציב hPSCs המובחן, כמו גם צאצאי הבדיל שלהם של כל השלוש השכבות הניבטות, היא במבחנת in vivo ^2,8,11,12. התוצאות האחרונות בכל זאת Nuance ממצאים אלה, כמו מוקד AAVS1 נמצא להפעיל עיכוב transgene משתנה במבחנה hESCs המובחן וב hepatocyte צאצאי ^13.

מחקרי הקרנה נוספים באמצעות גישות אינטגרציה אקראיות ושיטות לקבוע אינטגרצית עותק יחידה בקשה חוקרים לדעת GENOשילוב מיקרופון אתרים עמידים השתקת transgene במהלך התרחבות hPSCs והבחנת ^14,15. בסך הכל, עד עכשיו, אף אתר גנומי יאומת מלא כנמל מבטחים hPSCs וצאצאיהם; זיהוי האתר מתאים ביטוי transgene יציב בכל מקום, לא רק hPSCs אלא גם progenies הבדיל שלהם במבחנה ובחי, עדיין פתרון. בין כל הלוקוסים למדו ולמרות מגבלותיה, AAVS1 נשאר מאופיין ביותר ורוב-המשמש למחקר בתאי גזע.

RMCE בוצע בהצלחה hPSCs בכמה לוקוסים אלה ^6,7,14,16, בעיקר באמצעות Cre recombinase, גם אם יש אינדיקציות לכך FLPe היא יעילה יותר מאשר Cre ^17. בכל המקרים הללו, עמידות לתרופות חיובית אחד קלטת שמשה לבחירת מושבות רקומביננטי. למרות מוצלח, נהלים אלה אינם מהווים מראש טכניים על gene- תקןנהלי עריכה באמצעות ZFNs, TALENs או CRISPR / Cas9, כהליך מבחר האנטיביוטיים יחידים אינו פוסלים ואינטגרציות אקראיות ודורשים הקרנת מושבה לזהות שיבוטים ממוקדים כראוי.

בהליך זה, אנו מתארים שיטות לבצע RMCE ב hPSCs שעברו על מקורות AAVS1 באמצעות שילוב של חיובי (בתוך הקלטת הנכנסת) ושלילי (בתוך קלטת preintegrated) בחירות המאפשרות עבור הדור של קווי מהונדס polyclonal ב ± 15 ימים עם יעיל 100% ונטולים אירועי אינטגרציה אקראיים. לכן, שיטה זו מייצגת התקדמות מעבר תיאר כרגע טכנולוגיות RMCE ב hPSCs.

פרוטוקול

1. הכנה של הקו הסלולרי מאסטר hPSC המכילים FRT עבור Transfection

1. שורות תאי מאסטר תרבות hESC / iPSC תחת נהלים קבועים או ביטול פיברובלסטים עכבר עוברי מומתים (iMEF) באמצעות hESC או בינוני iPSC ללא מזין, בהתאמה (לוח 1). הכן 2 (על ניזונים) או 1 (חינם-מזין) בארות של hPSCs בצלחת 6-היטב עבור כל תנאי הניסוי.
2. הקפד על תרבויות, וכאשר התאים מגיעים 60 - 70% confluency, iMEF עמידים לתרופות צלחת (iDR4). בקצרה, מעיל בארות הצורך של צלחת 12 גם עם 0.5 מ"ל של תמיסת הג'לטין 0.1% ו דגירה במשך 5 דקות ב RT. פלייט 125,000 iDR4s לכל היטב דגירה O / N עם המדיום iMEF (טבלה 1).

2. Transfection hPSC ידי Nucleofection

1. למחרת, טרום דגירה hESC / תרבויות iPSC עם התקשורת טריים, כולל 10 מיקרומטר חלבון קינאז Rho-משויך (ROCK) מעכב (Y-27632), עבור 1 ש 'ב 37 מעלות צלזיוס. Nשלוחה, לקחת פתרון transfection hESC מהמקרר טרום חמים לטמפרטורת החדר.
2. הכן 1 מ"ל של nucleofection ציפוי בינוני (טבלה 1) לכל מצב nucleofection. קח בינוני iMEF את בארות, לשטוף עם 1 מ"ל של PBS בטמפרטורת החדר, ולהוסיף 500 μL של nucleofection ציפוי בינוני. מעבירים את 500 μL אחרים צינורות סטרילי 1.5 מ"ל ולאחסן אותם ב 37 מעלות צלזיוס עד ציפוי. הערה: ניסוי טיפוסי RMCE מכיל שלושה תנאים שונים עם יחס מולקולרי של תורם RMCE: וקטורי pFLPe של 2: 0, 2: 1, ו -0: 1.
3. ניתוק hESC / iPSC לתוך ההשעיה תא בודד.
   1. תוריד את התקשורת, לשטוף אותו עם 2 מ"ל של PBS RT, ולהוסיף 1 טריפסין מ"ל 0.05% או Accutase על תרבויות hPSC מזין או ללא מזין, בהתאמה. דגירה של 7 (טריפסין) או ו 2 - 5 (Accutase) דקות ב 37 מעלות צלזיוס. לטיפול Accutase - תאים חייבים להישאר משוחררים, אבל מצורף.
   2. מוציאים בזהירות את צלחת מן החממה ללאllowing התאים לנתק, להסיר את סוכן דיסוציאציה על ידי שאיפה. הוסף 1 מ"ל התקשורת של hESC ו לנתק את התאים רופף על ידי שטיפה התקשורת בעדינות על פני צלחת, הימנעות הקצפה. ודא התאים נמצאים השעית תא בודדת.
   3. אוספים את התאים בתוך שפופרת מ"ל נקי וסטרילי 15 או 50. לשטוף את הבארות עם 1 מ"ל של התקשורת hESC לאסוף את התאים בצינור אותו 15 או 50 מ"ל. קח aliquot 50 μL לספירה (במהלך לשלב הבא) באמצעות מכשיר ספירת תאים. רשום את היקף האיסוף לחשב את מספר תאים כולל. ספין למטה התאים ב 300 XG במשך 5 דקות ב RT.
4. Resuspend התא גלולה כדי השעיה של 10 ⁶ תאים / מ"ל עם PBS באמצעות pipet 5 מ"ל סרולוגיות ו pipetting עדין. למנוע הקצפה. העבר 2 מ"ל לכל תנאי הניסוי (כ 2 x 10 ⁶ תאים) כדי לנקות, צינורות 15 מ"ל סטרילי.
5. בעוד צנטריפוגה, מראשלקלף את RMCE donor- פלסמידים pFLPe מתערבב בנפח מרבי של 10 μL.
   1. העבר 2.5 מיקרוגרם של pFLPe (6.5 Kb) לצינור נקי, סטרילי 1.5 מ"ל. הוספה 2: יחס מולקולרי 1 של וקטור תורם RMCE ¹³ לוקטור pFLPe. לדוגמא, כ -10 מיקרוגרם של וקטור תורם 12 Kb RMCE.
6. המשך עם nucleofection, הימנעות קצף בכל השלבים.
   הערה: חלק פרוטוקולי transfection hPSC להחיל צעד דלדול iMEF נוסף לפני שלב 2.4. עם זאת, בפועל, iMEF היא שבריר תא קטין ההשעיה האחת שאינו לשנות באופן משמעותי את יעילות transfection, ולא יהיה זה ליצור זיהום תאי רקומביננטי מאז הם בלתי שגשוג. בנוסף, זה חיוני כדי להמשיך במהירות במהלך תהליך transfection להגדיל כדאיות. מסיבות אלה, דלדול iMEF אינו מוחל.
   1. הסר את צלחת iDR4 ואת צינורות מ"ל 1.5 עם המדיום ציפוימן החממה. צינור אחד בכל פעם, pipet את PBS בזהירות מבלי להפריע גלולת התא. סר ככל האפשר. Resuspend גלולה עם 100 μL של פתרון transfection ידי pipetting בעדינות. מעבירים את ההשעיה תא אל הצינור 1.5 מ"ל המכיל את המיקסים פלסמיד ומערבבים בעדינות.
   2. מעבירים את תערובת תא-DNA כדי קובט transfector, לשים לב לא להכניס בועות. הציגו את קובט במכשיר Nucleofector וליישם תוכנית A13 (תאים בתרבית על ניזונים) או F16 (מזין-חינם).
      הערה: התקני שיטות transfection אחרים או Nucleofector עשויים לדרוש אופטימיזציה של תוכניות אלה או תנאי transfection.
   3. לכבוש מחדש את קובט, באמצעות טפטפות העברה חד פעמיות זמין בערכה nucleofection, לאסוף תוכן שלו באמצעות החלת 0.5 מ"ל של המדיום ציפוי aspirating כל נפח. התנהגות שלב זה מהר, אבל בעדינות בתנועה אחת.
   4. נפתח חכם צלחת ב -12-wצלחת ell המכיל את iDR4 ו 500 μL של ציפוי בינוני. חזור על שלבים 2.6.1 - 2.6.4 עבור תנאי הניסוי הבא.
7. מניח את צלחת התרבות על מדף בחממה והעבר אותו לאט קדימה ואחורה ומצד לצד כדי לפזר את השעית התא באופן שווה. דגירה זה במשך 24 שעות לפני שינוי התקשורת הבא כדי לאפשר לתאים להתאושש בנוכחות מעכבת ROCK 10 מיקרומטר (Y-27632).

3. בחירה חיובית ושלילית של תאים שעברו RMCE

1. תקשורת ותרבות שינוי יומי (1 מיליליטר / טוב), ו 2 - 3 ד שלאחר transfection, להתחיל בחירה עם 100 ננוגרם / מיליליטר של puromycin.
   הערה: ריכוזים אופטימליים של ריאגנטים בחירה חיוביים ושליליים צריכים להיקבע באופן ניסיוני עבור כל קו תא חדש שנוצר hPSC מאסטר. בצע עקום להרוג ^13, באמצעות שורת תאי הורים לקבוע את המינון הנמוך (ריכוז שבו רעילות חזותיות מינימאליות ניכרו לאחר 7ד של בחירה, אבל התרבות היא לא מגודל), מינון אופטימלי (הריכוז הנמוך ביותר בה כל התאים מתים לאחר 7 ד של מבחר), ומינון גבוה (ריכוז שגרם רעילות מאליו, להרוג את כל התאים לאחר 2 - 3 ד) הן puromycin ו Fialuridine (FIAU).
   1. לשאוב את המדיום hESC. לשטוף עם 1 מ"ל של PBS. הוסף בינוני hESC עם 100 ננוגרם / מ"ל ​​של puromycin.
2. שים צמיחת תאים כך שהמוות והצמיחה מאוזנים. שינוי בתקשורת עם puromycin יומי, לאחר שלב 3.1.1. כאשר שיעור צמיחה עוקף מוות של תאים, להגביר את ריכוז puromycin בבלוקים של 25 - 50 ng / mL עד למקסימום של 250 ng / mL. המשך מבחר puromycin עבור 5 - 7 ד.
3. 3 - 4 ד לאחר תחילת בחירת puromycin, סביב 6 יום-transfection פוסט, להתחיל בחירה עם 0.5 מיקרומטר FIAU. שנה את התקשורת מדי יום ולשמור FIAU לתקופה שלא תעלה על 7 ימים רצופים.

4. הרחבה ואפיון של קווי RMCE

1. לאחר השלמת בחירה, סביב D14 - 15, מושבות RMCE עמידות נוכחות ומהוות את קו RMCE חדש. פיצול בתפזורת יחס של 1: 2 בעקבות הליכים סטנדרטיים (מעבר 1, P1).
2. פלייט 2 בארות של צלחת 12-היטב (או לבטל מתקני האכלה, בהתאם תנאי התרבות הקבועים של הקו הסלולרי אב המקורי). השתמש גם אחד להתרחבות נוספת, אחסון, או ניסוי הגדרה (אין תיאור נוסף של הליכים אלה נעשה בפרוטוקול זה), והשני לאפיון.
3. כאשר תאים P1 מוכנים לפצל, לנתק הבאר לאפיון לתוך ההשעיה תא בודד כמתואר 2.4 לאסוף את התאים בתוך שפופרת 15 מ"ל. הערה: תאים השתמשו מן WT hPSC (ללא שינוי גנטי) ואדון תא קו כפקדים שליליים וחיוביים, בהתאמה, על האפיון.
4. ספין למטה XG ב 300 דקות 5 ב RT. Resuspend ב 1 מ"ל של PBS ולפצל המדגם בשני עבור cytometry זרימהו- DNA ניתוח ^13.
5. Cytometry זרימה ניתוח ¹³ (300 μL):
   1. להוסיף נסיוב עגל עובר תאי PBS עד לריכוז סופי של 5%. מעבירים את התאים לצינור FACS נקי עם מסננת תא ולשמור אותם על הקרח.
      הערה: כדאיויות תא גבוהות בתנאים אלה, אז זה אפשרי, אבל לא הכרחי, להשתמש כתם ניאון עבור תאים שאינם קיימא (למשל, 7-AAD או PI).
   2. פנה מיד ניתוח cytometer זרימה מנתח תא ולהקליט 20,000 - 30,000 אירועים. לניתוח, להגדיר את השערים מעל בתפרחת רקע GFP או TDT באמצעות מדגם הביקורת השלילית WT.
6. ניתוח דנ"א ¹³ (700 μL):
   1. מעבירים את התאים לצינור 1.5 מ"ל נקי. ספין למטה XG ב 300 במשך 5 דקות ב RT ו לשאוב supernatant. המשך מיצוי DNA באמצעות ערכה מסחרית ופעלו לפי הוראות היצרן. אחסן את הגלולה היבשה ב -20 מעלות צלזיוס במשך latניתוח אה.
7. מדוד ריכוז ה- DNA.
   1. כן PCR תגובות תקן בהתאם לתנאי באיור 3 ולוח 2 ¹³ דגימות ה- PCR לרוץ על ג'ל 2% agarose המכיל כתם ג'ל DNA 1x ב 150 V 15 -. 25 דק '. לנתח את הרצת מנתח ג'ל.

תוצאות

שימוש ZNFs AAVS1 -specific, מאופיינות במלואו שורות תאי מאסטר hESC / iPSC המכילות רצפי heterotypic יעד FRT נוצרו ותארו ^13. שורות תאים מאסטר FRT המכילים מתוחזק pluripotency ויושרה הגנום לאחר הטיפול ZFN ביציבות הביע GFP במבחנה in vivo. RMCE מבוצע על ידי cotransfection של שורות תאי הורים עם FLPe recombinase וקטורים התורמים RMCE (איור 1 א). וקטורים RMCE כולל סדרות FRT זהים לאלה בקו תא אב AAVS1 איגוף את הגן איור 1B מפקחת RMCE באמצעות constitutively להביע TDT PZ:.. F3-P CAGGS tdTPH-F לאחר transfection, hPSC ליצור קבוצות קטנות של תאים מתחלקות באופן שווה במהלך שכבת MEF iDR4, ו transfected hPSC מבטאות הן GFP וכן TDT חולף (איור 1 ב ', ד 2). תאים מותר להתאושש במשך 2 - 3ד-transfection פוסט לפני תחילת הבחירה. מבחר חיובי ראשון התחיל להשתמש במינון נמוך של puromycin כדי להעדיף הכנסת תורם RMCE. Puromycin מוחל בעדינות בהתחלה, בגלל מוות של תאים מסיבית ראשוני עלול להוביל תאים בודדים שעברו רקומבינציה, מה שהופך אותם מסוגל לשרוד את התהליך. בימים שלאחר מכן, ריכוז puromycin צריכה יועלה בשלבים עד המינון האופטימלי כדי לאפשר לתאים רקומביננטי לגדול לתוך מושבות קטנות תוך התאים nonrecombined למות בהדרגה.

3 - 4 ד לאחר ייזום סלקציה חיובית (סביב D 6-transfection פוסט), סלקציה שלילית תחילתה כדי לבחור רק לאירועים רקומבינציה בתיווך FRT. RMCE גורמת לאובדן של קינאז thymidine (טק) הגן התאבדות ולכן הרגישות Fialuridine (FIAU). סלקציה שלילית מיושמת בשלב זה, שבו קבוצות קטנות של 2 - 4 GFP ^- / TDT ⁺ (RMCE) תאיםמסוגל לעמוד ריכוזים אופטימליים של FIAU (איור 1 ב ', ד' 6), מונע שילוב אקראי, כי באירועים מסוג זה, גן טק שעבר על מקורות AAVS1 נותר ללא שינוי. מופע של סימולטני FRT בתיווך והאינטגרציה אקראית סבירה, כפי שהוכח על ידי בהעדר אירועי אינטגרציה האקראיים מאוחר יותר במהלך האפיון (איור 2 ב).

ה- GFP RMCE מעורבת ^- / TDT ⁺ מושבות להמשיך לצמוח, בזמן שנעשים יותר הומוגנית, כך שעד D 9 - 10 שלאחר transfection, לא איזה מושבות RMCE מעורבת שנבחרו באופן מלא ניתן למצוא (איור 1B). GFP ^- מושבות / TDT ⁺ RMCE נוכח רק כאשר הן תורם RMCE ו FLPe (2: 1) משמשים, בעוד RMCE אינו מתרחש בהיעדר FLPe (2: 0). מבחר מלא עם FIAU עד יום 13 - 15 transfection פוסט מעורר GFP הומוגנית ^- / TDT ⁺ culturדואר. RMCE מניב בממוצע 12.8 ± 6.8 (n = 6) Puro ^R / מושבות FIAU ^R ב 15 ימים ^13. Cytometry זרימת האפיון של קו RMCE החדש שנוצר באופן מלאכותי (מושבות RMCE Puro ^R / FIAU ^R בשילוב באוכלוסיית תא nonclonal) מאשרת כי 100% של התאים להציג את GFP RMCE ^- / TDT ⁺ פנוטיפ (איור 2 א). כאשר התורמים RMCE ללא ביטוי המכונן של כתב ניאון משמשים, קו ^R Puro וכתוצאה / FIAU ^R RMCE hPSC הוא הומוגנית GFP ^-.

אפיון PCR של קו RMCE nonclonal מדגים את חילופי קלטת המלאים (ללא עקבות של הקלטת של הקו הסלולרי המאסטר יכול להיות מזוהה) וכי תכנית הבחירה בשימוש יוצר קווי אינטגרציה נטולה אקראיים (הן של תורם RMCE ואת FLPe להביע וקטור) (איור 2 ב). תוצאות אלו הוכחו עוד יותר על ידי sכתם outhern ובנוסף, הראו כי קווי RMCE להישאר פלוריפוטנטיים ^13. זה עושה את זה כבר לא נחוץ כדי לבצע גם את ההערכה רחבה הגנום של אינטגרציה אקראית או מבחן pluripotency במהלך ניסויי RMCE שיגרתי. לסיכום, שימוש בפרוטוקול זה, שורות תאים מהונדסות hPSC שעברו על מקורות AAVS1 ללא אינטגרציה אקראית יכולות להיוצר בקלות 15 ד עם יעילות 100% וללא הצורך של אפיון נרחב.

איור 1: סקירה כללית סכמטי של RMCE (א) ציר זמן של תכנית בחירת RMCE.. משמאל: הקו הסלולרי מאסטר (MCL), מחסה קלטת ולצדו-FRT (משולשים) המבטאים GFP ו hygromycin-tk (צמוד על ידי פפטידים ביקוע עצמית 2A), הוא transfected ידי nucleofection (NF) עם וקטור FLPe להביע ו וקטור תורם RMCE, WHich מכיל גן התנגדות promoterless puromycin (acceptor שחבור - SA- Puro ^R) וקלטת ניסיוני משתנית (X). מימין: קו RMCE חדש (RMCEL) המתקבל לאחר השלמת הבחירה עם puromycin (משולש אדום) FIAU (הקו הכחול). (ב) RMCE באמצעות תורם TDT להביע מכונן יחסים שונים של דנ"א תורם FLPe DNA (0: 1, 2: 1, 2: 0) פיקוח על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי (GFP - פלואורסצנטי ירוק, TDT - קרינה אדומה) בשעה שונה נקודות זמן. D 2 ו -6: סולם ברים מייצגים 100 מיקרומטר. D 10: ברי סולם מייצגים 200 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2:. אפיון RMCE הקווים (א) קביעת RMCE ידי cytometry זרימה. GFP וביטוי TDT מוצגים עבור קו WT, שורת תאי מאסטר (MCL), וקו RMCE החדש שנוצר באופן מלאכותי ב 15 D-nucleofection פוסט באמצעות וקטור TDT-ביטוי מכונן (CAGGS TDT), או תורם עם GFP מונע על ידי אמרגן GOOSECOID (GSCp GFP, סמן האנדודרם סופי) או האמרגן AAT (APOeAATp GFP, סמן hepatocyte). (ב) אישור של RMCE (5 '/ 3' JA RMCEL), בהעדר את הקלטת (MCL) של שורת תאים מאסטר (5 '/ 3' JA MCL), וחוסר אינטגרציה אקראית (5 '/ 3 "/ FLPe RI ) על ידי PCR באמצעות זוגות פריימר מתואר. DNA מ WT, MCL, קווי RMCE (1 - 5), וקטור התורם RMCE (+ RI), וקטור להביע FLPe, ולא שליטה התבנית (NTC) היו בשימוש. איור שונה מן (Ordovas et al., 2015) ^13. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

בתוך-page = "1">
דור איור 3. של הקו הסלולרי מאסטר RMCE-מתאים ההשוואה של גן מיקוד עם RMCE ב AAVS1 שמאל:. גן מיקוד שימוש בתאים ללא שינוי WT כי הם cotransfected עם תורם (קלטת מתוארת באיור 1A עבור הדור של הקו הסלולרי המאסטר , MCL) ואת ZFNs מותאם ספציפית. התהליך כדי להשלים את האפיון המלא לוקח עד 3 חודשים. מימין: RMCE מבוצע על ידי cotransfection של התורם עם וקטורי FLPe, וקו מאופיין במלואו נוצר 15 ד. יעילות מיקוד גנים AAVS1 הוא ממחקרים קודמים ^1,2. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

ays "> כְּלֵי תִקְשׁוֹרֶת רכיבי ריכוז סופי מדיום hESC DMEM-F12, HEPES 80% בינוני החלפת סרום 20% L-Glutamine 146 מ"ג / מ"ל MEM שאינו חיוני אמינו פתרון חומצות (100x) 1x 2-mercaptoethanol 0.1 מ"מ פניצילין / סטרפטומיצין 0.1% FGF יסוד של אדם 4 ng / mL מדיום תרבות iMEF גלוקוז DMEM הגבוה בסרום שור עוברי (FBS) 15% פניצילין, סטרפטומיצין 0.1% L-גלוטמין 200 מ"מ 4 מ"מ אמינו MEM שאינו חיוניפתרון חומצות (100x) 2x 2-mercaptoethanol 0.1 מ"מ בינוני ציפוי מדיום hESC 100% מעכב ROCK (Y-27632) 10 מיקרומטר

הרכב מדיה בטבלה 1..

assay	קָדִימָה		לַהֲפוֹך		amplicon	מחזור PCR
5'JA MCL	CACTTTGAGCTCTACTGGCTTC		CGTTACTATGGGAACATACGTCA		1.1 Kb	95 ºC, 5 '- [95 ºC, 30' '- 68 ºC (-0.5 ºC / מחזור), 1' 30 ''] x15 - [95 ºC, 30 '' - 58 ºC, 30 '' - 72 ºC, 1 '30' '] X25 - 72 ºC, 5'
3'JA MCL	TAACTGAAACACGGAAGGAG		AAGGCAGCCTGGTAGACA		1.4 Kb	95 ºC, 5 '- [95 ºC, 30' '- 68 ºC (-0.5 ºC / מחזור), 1' 30 ''] x15 - [95 ºC, 30 '' - 58 ºC, 30 '' - 72 ºC, 1 '30' '] X25 - 72 ºC, 5'
5'JA RMCEL	CACTTTGAGCTCTACTGGCTTC		CATGTTAGAAGACTTCCTCTGC		1.1 Kb	95 ºC, 5 '- [95 ºC, 30' '- 68 ºC (-0.5 ºC / מחזור), 1' 30 ''] x15 - [95 ºC, 30 '' - 58 ºC, 30 '' -72 ºC, 1 '30' '] X25 - 72 ºC, 5'
3'JA RMCEL	TTCACTGCATTCTAGTTGTGG		AAGGCAGCCTGGTAGACA		1.5 Kb	95 ºC, 5 '- [95 ºC, 30' '- 68 ºC (-0.5 ºC / מחזור), 1' 30 ''] x15 - [95 ºC, 30 '' - 58 ºC, 30 '' - 72 ºC, 1 '30' '] X25 - 72 ºC, 5'
תורמי 5'RI	GTACTTTGGGGTTGTCCAG		TTGTAAAACGACGGCCAG		0.5 Kb	95 ºC, 5 '- [95 ºC, 30' '- 60 ºC, 30' '- 72 ºC, 30' '] X25 - 72 ºC, 5'
תורמי 3'RI	CCTGAGTTCTAACTTTGGCTC		ACACAGGAAACAGCTATGAC		0.5 Kb
RI FLPe	CCTAGCTACTTTCATCAATTGTG		GTATGCTTCCTTCAGCACTAC		0.65 Kb	95 ºC, 5 '- [95 ºC, 30' '- 60 ºC, 30' '- 72 ºC, 30' '] X25 - 72 ºC, 5'

טבלה 2. סטים פריימר המשמש Genotyping PCR. שונה מן Ordovas et al., 2015 ^13.

דיון

ג'ין שיטות העריכה ב לוקוסים נמל מבטחים להישאר כלי הכרחי כדי לפתח transgenesis ב hPSCs. למרות שדמות Safe Harbor, AAVS1 נחקרה לאחרונה עבור יישומים מסוימים ^13,18, מוקד זה כרגע נשאר הטוב ביותר מאופיין בקווי תא נגזרות אנושיים. מודעות מגבלותיה ב hPSCs יכול לעזור לקבל נתונים מהימנים. לכן, AAVS1 עדיין צפוי להיות אתר שימושי, למשל, ללימודי gain- והפסד של פונקציה או מושרה / ביטוי המכונן של גורמים המחייבים בהקשר isogenic בתוך ובין רקע גנטי נחושה.

מוקד AAVS1 היוותה מטרה קבוצות רבות באמצעות ZFNs, Talen או CRISPR / Cas9 ^1,2,19. nucleases אלה להגדיל באופן משמעותי את היעילות של רקומבינציה הומולוגי מוקד נחוש. עם זאת, התהליך של הבדיקה באופן מלא לאפיין שיבוטים ממוקדים כראוי, ללא integ האקראימנה ולשמור pluripotency הגנום שלמות יכול להימשך עד 3 חודשים (בעזרת כלי עריכת גן מותאמים) (איור 3). שני האחרונים יכולים להיגרם על ידי מוטציות אפשריות שנוצרו על ידי פעילות nuclease מחוץ היעד. מערכת RMCE משמשת כאן, לעומת זאת, מציעה שיטה מהירה, יעילה, ואלגנטית להשיג מטרה זו רק שבועות, פעם רצפי יעד recombinase-ספציפי preintegrated לתוך מוקד AAVS1. שימוש סלקציה חיובית / שלילית תכנית בחירה מתאימה הם הגורמים המרכזיים שתרמו לפישוט עריכת גני לוקוס AAVS1 ידי RMCE.

אפיון Genotypic של קווי המהונדס החדשים מצטמצם משמעותי (לא הקרנה משובטת יש צורך), ואפיון הקשורים לפעילות nuclease מחוץ היעד מוצג לוותר בשל הספציפי של FLPe עבור FRTs. האפיון ניתן להפחית גם בניסויים RMCE שגרתית על ידי הוכחתאובדן מוחלט של ביטוי ה- GFP מקו תא אב (איור 2 א), כי חילוף קלטת מלאה וחוסר האינטגרציה אקראית כבר הוכחו באופן מספק על ידי PCR (תרשים 2B) ו כתם דרום ^13. שימוש סלקציה חיובית / שלילית גם מהווה את ההבדל העיקרי עם דיווחים קודמים. כמה קבוצות כי שתואר לעיל RMCE ב hPSCs, בין אם AAVS1 או לוקוסים אחרים, מועסקים רק צעד סלקציה חיובית אחת ^7,14,16. זה אינו מהווה יתרון טכני עיקרי על עריכת הגן בצעה עם nucleases, כי הקרנת מושבה צריכה להתבצע באופן שווה על מנת להפגין שילוב והיעדרות נכונים של שילוב אקראי ברמה המשובטת.

שימוש במערכת RMCE זה מספר שורות hESC / iPSC דורש preintegration של הקלטת FRT המכיל המתואר מוקד AAVS1 של כל קו עצמאי. עם זאת, ברגע שנוצר,המהירות והפשטות שלה מאפשרים לפתח מסכי תפוקה גנטיים למחצה גבוהה במסגרות isogenic מוגדרת עבור יישומים שהוזכרו לעיל כי אחר יהיה מאוד זמן רב טכני. בנוסף, כל הווקטורים RMCE בנויים בתוך וקטור מיקוד הגן PZ AAVS1 משמשים למיקוד לוקוס עם ZFNs, אבל TALENs או CRISPR / Cas9 דווחו גם. הדואליות של וקטור RMCE שימושית מאוד כדי ליצור קווים מרובים עבור transgene נחושה hPSCs עם או בלי FRT. לדוגמה, אחד פגע הפגינו מוצלח מסך גנטי נחוש שביצעו RMCE יזדקק באופן אידיאלי להיבדק בקווים hPSC מרובים כדי לאשר את התוצאות. בהעדר שורות תאי מאסטר המרובים RMCE-מתאים, גן ישיר מיקוד של הלהיט באמצעות nucleases יכול להתבצע. השירות של הדמות הכפולה של וקטורי RMCE הוכח על ידי הקבוצה שלנו ^20. במחקר זה, תיקון גן בוצע נגזרות חולותדמנציה פרונטו-טמפורלית (FTD) iPSCs הנושאות מוטציה גורמת PROGRANULIN (PGRN) חסר הבעה. שלמת ג'ין ידי החדרה בתיווך ZFNs שעברו על מקורות AAVS1 של קלטת כי משוחזר רמות PGRN, תקנה את הפנוטיפ הפגום corticogenesis הקשורים בנוכחות המוטציה. בנוסף, קו דומה נוצר על ידי RMCE ב hESCs WT לשמש מלאה לביטוי PGRN אקסוגניים.

בהעדר מושבות רקומביננטי, לבדוק יעילות transfection של וקטור התורם RMCE. יעילות transfection מעולה עד 30% מניבות את התוצאות המצוינות לעיל. יעילות transfection תחתונה להקטין יעילות רקומבינציה. לבסוף, מערכת RMCE נוצרה ב לוקוס AAVS1, אבל זה חל על כל מוקד אחר.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
DR4 עכבר פיברובלסטים עובריים (MEF)	AMS bio	GSC-6204G	תרבית hPSC על מזינים
CF-1 MEF, טיפול במיטומיצין-C	AMS Bio	GSC-6001M
EmbryoMax 0.1% תמיסת ג'לטין	Millipore	ES-006-B	ציפוי iMEF
DMEM/F-12, HEPES	Gibco	31330-038
החלפת סרום נוקאאוט	Gibco	10828-028
L-Glutamine	Sigma Aldrich	G8540	עבור hESC בינוני
L-גלוטמין, 200 מ"מ	Gibco	25030-081	עבור iMEF בינוני
2-מרקפטואתנול, 50  mM	Gibco	31350-010
MEM תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות (100x)	Gibco	11140-035
פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/mL)	Gibco	15140122
Human Basic FGF	Peprotech	100-18C
Y-27632 בתמיסה	VWR	688001-500
DMEM גלוקוז גבוה	Gibco	41965-039
סרום בקר עוברי (FBS)	סיגמא אולדריץ'	F7524
טריפסין-EDTA (0.05%), פנול אדום	Gibco	25300-054	תרבית hPSC על מזינים
Matrigel, hESC מוסמך	VWR	734-1440
mTeSR1 ערכה בינונית מלאה	טכנולוגיות תאי גזע	05850	לתרבית ללא מזין
StemPro Accutase מגיב דיסוציאציה של תאים	Gibco	A1110501	לתרבית ללא מזין
Y-27632 בתמיסה	VWR	56726
ערכת נוקלאופקטור תאי גזע אנושיים 2	Lonza	VVPH-5022
Puromycine Dihydrochloride	Gibco	A11138-03
FIAU (Fialuridine)	ABX	2910
Hygromycin B	Sigma Aldrich	H3274
pFLPe			שונה ל- pCAGGS-FLPe (MES4488, Open Biosystems) להסרת
תורמי פורומיצין RMCE	-		שונה מתורם pZ AAVS1 puromycin vector (PZD0020-1KT, Sigma Aldrich) 13
5 מ"ל מבחנה פוליסטירן תחתונה עגולה, עם מסננת תאים	Falcon	352235
PureLink ערכת DNA גנומי	Invitrogen
GoTaq Flexi DNA פולימראז	Promega	M8298
Agarose	Sigma	A9539
SYBR בטוח DNA כתם ג'ל	Invitrogen	S33102
Nucleofector 2b מכשיר	Lonza (Amaxa)	AAB-1001
NucleoCounter NC-100	Chemometec	NC-100
BD FACS Canto	BD מדעי הביולוגיה	337175
NucleoCassette	Chemometec	941-0002