מאמר שיטה

ואלקטרופורזיס פשוט עבור כימות של שחרור מלכודת לכלבים נויטרופילים תאיים

8.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54726

⸱

21 בנובמבר 2016

 ,  , 
1Department of Veterinary Microbiology and Preventative Medicine, College of Veterinary Medicine, Iowa State University, 2MRC Centre for Inflammation Research, University of Edinburgh, 3Department of Veterinary Clinical Sciences, College of Veterinary Medicine, Iowa State University

במאמר זה

סיכום

מלכודות תאי נויטרופילים (נטס) הן רשתות של DNA, ההיסטונים וחלבונים נויטרופילים. למרות מרכיב של התגובה החיסונית המולדת, רשתות מעורבות אוטואימוניות פקק. פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה עבור בידוד נויטרופילים כלבי וכימות של רשתות באמצעות assay קרינת microplate.

תקציר

מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות הן רשתות של DNA, היסטונים וחלבוני נויטרופילים המשתחררים בתגובה לגירויים זיהומיים ודלקתיים. למרות שהם מרכיב של התגובה החיסונית המולדת, NETs מעורבים במגוון תהליכי מחלה כולל אוטואימוניות ופקקת. פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה לבידוד נויטרופילים של כלבים וכימות של NETs באמצעות בדיקת פלואורסצנטיות מיקרו-לוחית. הדם נאסף בטכניקות ניקור ורידים קונבנציונליות. נויטרופילים מבודדים באמצעות שקיעת דקסטרן ושיפוע צפיפות באמצעות תנאים מותאמים לדם כלבים. לאחר מתן זמן לחיבור לבארות של צלחת 96 בארות, נויטרופילים מטופלים באגוניסטים מעוררי NET כגון phorbol-12-myristate-13-acetate או גורם מפעיל טסיות דם. שחרור ה-DNA נמדד על ידי הקרינה של צבע חומצת גרעין אטום לתאים. בדיקה זו היא שיטה פשוטה וזולה לכימות שחרור NET, אך יש לאשר היווצרות NET ולא סיבות אחרות למוות תאי בשיטות חלופיות.

מבוא

ישנם מעל 70 מיליון כלבים בארה"ב בלבד 1. כמו בני משפחה מוערך, החיות האלה זוכים לעיתים קרובות חיתוך טיפול רפואי קצה. פחות בגלל שהם חולקים הסביבה שלנו, כלבים יכולים לספק תובנות בפתוגנזה וטיפול של מחלות אנושיות 1. עם זאת, אם תרגום תגליות ברפואה אנושית לתוך טיפולים וטרינריים או להיפך, חשוב לאפיין ביסודיות מיני וריאציות אפילו במערכות שמורות ביותר כמו התגובה החיסונית המולדת. דוגמאות של הבדלים בין הכלבים לבין מערכת חיסון מולדת אנושית כוללות ביטוי גבוה CD4 על נויטרופילים כלב 2; בהעדר homolog תפקודית של IPAF חיישן flagellin ציטופלסמית בכלבים 3 ואת הביטוי של הכלאה caspase 1/4 ב טורפים 4.

מלכודות תאי נויטרופילים (רשתות) הם מרכיבים גילה יחסית לאחרונה של חסינות מולדת 5. הנטס הוא רשתהים של דנ"א, חלבונים גרעיניים ופרטניים פרסמו בתגובת מגוון רחב של גירויים דלקתיים או זיהומיות 6. NET מבנים דמויי הודגמו פני מינים רבים, כולל תרנגולות 7, דגים 8, רכיכות 9 ו acoelomates 10, אבל יש וריאציות מינים. לדוגמה, נויטרופילים murine להגיב לאט יותר לגירויים NETosis מ נויטרופילים אדם, ויוצרים פחות מפוזר 11 נטס. ישנו גוף גדול של עדויות מינים רבים כי רשתות ללכוד חיידקים, ועוד שנויות במחלוקת עשויה להיות מעורבות ישירות להרוג פתוגנים 12,13. עם זאת, רכיבים NET גם לשפר נזק לרקמות, לקדם פקקת ולפעול עצמיים 14,15. האיזון בין ההשפעות החיוביות המזיקות של רשתות עשוי להשתנות בין מחלות שונות ומינים שונים, דבר המצביע חשוב לחקור רשתות הן המין ומצבו של עניין.

הנה אנחנומתאר פרוטוקול פשוט גרימה ומדידת שחרור נטס על ידי נויטרופילים כלבים. שיטה זו דומה לאלה המשמשים לבודד נויטרופילים 16 ולגרום NETosis במינים אחרים, אך התנאים כגון ריכוז אגוניסט וזמן הדגירה ממוטבים עבור נויטרופילים כלבים. Assay לשחרור DNA כימות NET דומה אף תואר במינים אחרים אבל השיטה המוצגת כאן גם מותאמת במיוחד עבור כלבים 8,17,18.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הניסויים בוצעו עם רשות הרמה האתית טיפול בבעלי חיים מוסדיים אוניברסיטת איווה סטייט ועדת שימוש.

איסוף דם 1.

  1. צייר 9 מ"ל של דם מתוך saphenous, וריד כאפאליך או הצוואר ישירות לתוך קרישה (למשל, חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA), 1.8 מ"ג K 2 EDTA / מ"ל דם) vacutainers, או לתוך מזרק עם העברה מיידית צינורות דם המכיל EDTA. בעדינות לגלגל או להפוך את צינורות הדם כדי להבטיח ערבוב הנאות של דם קרישה אנטי.

2. בידוד נויטרופילים

  1. בתוך צינור חרוטי 50 מ"ל, לערבב דם עם נפח שווה של dextran-500 טמפרטורה 3% בחדר סטרילי (מורכב מלוחים סטרילי 0.9%) על ידי היפוך עדין. השאירו עומד זקוף עבור 18-20 דקות בטמפרטורת החדר. מעביר את השכבה העליונה בצבע הקש לצינור טרי עד שהוא כבר לא יכול להיות שנאסף ללא זיהום על ידי שכבת האדום התחתונה. אריתרוציטים ב היכול להיות מושלך דואר צינור מקורי.
  2. צנטריפוגה supernatant XG ב 500 במשך 10 דקות ב 4 °. צייר ותשאיר supernatant. באופן ידני מחדש להשעות את התא גלולה ב בופר פוספט סטרילי בטמפרטורה 10 מ"ל חדר (PBS). שים לב vortexing לא אמור לשמש מחדש להשעות נויטרופילים בכל שלב של פרוטוקול זה. ידני ציור off, ולא ניגר supernatants מומלץ גם ברחבי הפרוטוקול כדי למקסם תשואת תא.
  3. הוסף 10 מ"ל של פתרון ההפרדה תא בטמפרטורת החדר polysucrose ונתרן diatrizoate (למשל, Histopaque 1077) כדי צינור חרוטי 50 מ"ל. בזהירות שכבת פתרון התא המכיל מעל פתרון הפרדת תא. שים לב פתרון הפרדת תא באמצעות אשר לא equilibrated לטמפרטורת חדר עשוי להפחית תשואת תא.
  4. צנטריפוגה XG ב 300 במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם הבלם משם.
  5. כפי נויטרופילים הם בשכבה הנמוכה ביותר של שיפוע, לצייר את וזורקים upper 3 שכבות, מורכב שכבה עליונה של פלזמה וטסיות, סרט לבן דק של תאי mononuclear ושכבה ברורה של מדיום שיפוע צפיפות.
  6. כדי lyse כל אריתרוציטים הנותרים, מחדש להשעות את הגלולה נויטרופילים 10 מ"ל מים בטמפרטורת החדר.
  7. לאחר 30 שניות, לשחזר טוניות על ידי הוספת 10 מ"ל של נתרן כלורי 1.8% טמפרטורה סטרילי בחדר ומערבבים על ידי היפוך עדין.
  8. צנטריפוגה XG ב 500 במשך 5 דקות ב 4 ° C.. צייר את supernatant וזורקים.
  9. אם הגלולה היא עדיין אדומה, לחזור על שלב תמוגה. אם הגלולה היא לבנה (או אם תמוגה היום כבר פעמים), בעדינות מחדש להשעות תאים 10 מיליליטר של PBS סטרילית.
  10. ספירת תאים באמצעות מונה אוטומטי או hemocytometer. תשואות אופייניות הן לפחות 10 6 תאים לכל מיליליטר של דם.
  11. צנטריפוגה XG ב 500 במשך 5 דקות ב 4 ° C.. צייר את supernatant וזורקים.
  12. מחדש להשעות תאים לריכוז הרצוי ב PBS בטמפרטורת חדר סטרילי. For את assay לשחרור DNA כמתואר בסעיף 2, resuspend ב 5 x 10 6 תאים לכל מיליליטר.
  13. אם תרצה, להעביר נפח קטן של תאים ישירות או באמצעות cytocentrifuge לשקופית זכוכית. אפשר תאים להתייבש כתם באמצעות ערכת קיבעון והכתים מהירה פי מייצר 'הוראות. אם בידוד נויטרופילים הצליח, כאשר בחן במיקרוסקופ לפחות 95% של תאי בעלי גרעין צריכים להיות גרנולוציטים (נויטרופילים, בזופילים, אאוזינופילים) עם זיהום כדורי מינימאלי.

3. DNA שחרור Assay

  1. הגדרת assay לשחרור DNA מיד לאחר בידוד נויטרופילים.
  2. אם clumping התא נמצא בבדיקה של פתרון המניות על ידי מיקרוסקופ אור, להעביר את ההשעיה תא דרך פילטר סטרילי 70 מיקרומטר סטרילי מיד לפני הגדרת assay.
  3. זה טוב במבחן צלחת גם 96 סטרילי, להוסיף 5 x 10 4 תאים / טוב; אגוניסט ו תזכיר פארק רוזוולריאל מכון-1640 (RPMI) בינוני ללא פנול אדום בתוספת 0.5% חום מומת העובר עגל בסרום לנפח סופי של 100-200 μl. לכלול לפחות שתי בארות ריקות לכל אגוניסט כשהפתרון המניות נויטרופילים מוחלף נפח שווה של PBS. שים לב להגדרת בארות ריקות עבור כל אגוניסט חשוב פוסלי זיהום הדנ"א של אגוניסט או הפרעה באמצעות אגוניסט עם assay הקרינה.
  4. לדגור על 39 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות בתוך פחמן דו חמצני חממה (4%).
  5. הוספת אגוניסטים בריכוזים רצויים לבין צבע חומצות גרעין תא חדיר. הערת הריכוז האופטימלי של צבע התא חדיר ינוע בין צבעי חומצות גרעין שונים. שולטת ללא מגורה שבו אגוניסטים מוחלפים נפח שווה של התקשורת צריכה להיכלל בכל ניסוי.
    הערה: רצוי לדלל אגוניסטים בנפחים דומים של מדיום התרבות כדי לשמור על תנאים עקביים בין בארות. כרכים היטב סופי של 200 &# 181; l שמש בהצלחה ואם זה משתנה, גם הכרכים צריכים להישאר זהים לכל התנאים. Phorbol-12-myristate-13-אצטט (PMA) (הריכוז הסופי ≥0.1 מיקרומטר) או גורם הפעלת טסיות (PAF) (הריכוז הסופי ≥31 מיקרומטר) יכול לשמש שולטת חיובית. אגוניסטים יש למדוד לפחות בשני עותקים.
  6. לדגור על C ° 39. מדוד הקרינה באמצעות קורא microplate לאחר 2 שעות או במרווחים הרצויים. שים לב מרווחי זמן אופטימלי ישתנו בהתאם אגוניסטים בשימוש.
    הערה: אורך הגל יהיה תלוי לצבוע מועסקים.
  7. פחת קרינה ריקה לפני חישוב קרינה ממוצעת.
  8. כדי לאפשר השוואה בין פרט לפרט ובין צלחות, לחשב שינוי לקפל קרינה על ידי חלוקת הקרינה הממוצעת של בארות מגורות על ידי הקרינה הממוצעת של בארות שאינן מגורה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

שימוש בפרוטוקול זה, לא אמור להיות שינוי לקפל חזק קרינה לאחר הגירוי נויטרופילים עם הבקרות החיוביות, PMA ו PAF. כמו באיור 1B, גירוי של נויטרופילים כלבים עם 31 מיקרומטר PAF עבור 1 תוצאות hr לעלייה 4.0 פי ממוצע הקרינה לעומת תאים שאינם מגורה (טווח 2.0-5.8, n = 5 כלבים) 18. PMA ברמה של 0.1 מיקרומטר (איור 1 א) היא אגוניסט איטי שאינו לגרום לעליית הקרינה עד שעה 2 אבל בסופו של דבר מייצרת גידול של פי דומה קרינה (ממ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

את assay לשחרור DNA שהוצג הוא assay לכימות בקלות עבור DNA התאי. השיטה הותאמה מן בטכניקות דומות המשמשות להערכת היווצרות NET במינים אחרים, אך במהירויות צנטריפוגה, ריכוזי אגוניסט ושעות דגירה שונו כדי לייעל את השיטה לשימוש עם נויטרופילים כלבי 8,17,18. התאמות דומות יכולות להיעשות כדי להתאים את השיטה עבור מינים אחרים. Assay הוא פשוט ולא יקר בהשוואה לשיטות אחרות למדידת NETosis כגון cytometry זרימה או ניתוח תמונה. השיטה גם אינה דורשת נוגדנים כנגד מרכיבי NET, כך הוא אידיאלי לשימ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

החוקרים אין לי מה לחשוף.

תודות

המחברים מודים בתודה לד"ר ג'יימס רות', ויליאם נאוסיף וקאיוקו קימורה ולמר טום סקאדו על הסיוע בפיתוח פרוטוקולי הנויטרופילים לכלבים. RDG נתמך על ידי מלגת Wellcome Trust ref: WT093767MA.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צינור דם מלא מפלסטיק עם ציפוי תרסיס K2EDTABD367835
Histopaque-1077Sigma-Aldrich10771
Dextran-500Precise chemical and Scientific Corp.
פוספט חוצץמלח ThermoFisher מדעי20012043
סרום עגל בקר עוברי, מומת בחוםThermoFisher מדעי10100139
RPMI Media 1640, ללא פנול אדום או L-גלוטמיןThermoFisher מדעי32404-014צריך להיות נקי מפנול אדום
96 צלחת פוליסטירן סטרילית עם תחתית שטוחה היטבפלקון
Phorbol 12-myristate 13-acetateSigma-AldrichP1585
גורם מפעיל טסיותדם Sigma-AldrichP4904
SYTOX כתם חומצת גרעין ירוקהThermoFisher ScientificS7020
Synergy 2 קורא רב-מצביBioTekNA
AN228410353072

מקורות

  1. Schiffman, J. D., Breen, M. Comparative oncology: what dogs and other species can teach us about humans with cancer. Philos Trans Rl Soc B Biol Sci. 370, 1673(2015).
  2. Williams, D. L. Studies of canine leucocyte antigens: a significant advance in canine immunology. Vet J. 153 (1), 31-39 (1997).
  3. Eckhart, L., et al. Duplication of the caspase-12 prodomain and inactivation of NLRC4/IPAF in the dog. Biochem Biophys Res Commun. 384 (2), 226-230 (2009).
  4. Eckhart, L., et al. Identification of novel mammalian caspases reveals an important role of gene loss in shaping the human caspase repertoire. Mol Biol Evol. 25 (5), 831-841 (2008).
  5. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  6. Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin. J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).
  7. Chuammitri, P., et al. Chicken heterophil extracellular traps (HETs): novel defense mechanism of chicken heterophils. Vet Immunol Immunopathol. 129 (1-2), 126-131 (2009).
  8. Palić, D., Ostojić, J., Andreasen, C. B., Roth, J. A. Fish cast NETs: neutrophil extracellular traps are released from fish neutrophils. Dev Comp Immunol. 31 (8), 805-816 (2007).
  9. Poirier, A. C., Schmitt, P., Rosa, R. D., Vanhove, A. S., Kieffer-Jaquinod, S., Rubio, T. P., et al. Antimicrobial histones and DNA traps in invertebrate immunity: evidences in Crassostrea gigas. J Biol Chem. 289 (36), 24821-24831 (2014).
  10. Robb, C. T., Dyrynda, E. A., Gray, R. D., Rossi, A. G., Smith, V. J. Invertebrate extracellular phagocyte traps show that chromatin is an ancient defense weapon. Nat Commun. 5, 4627(2014).
  11. Kaplan, M. J., Radic, M. Neutrophil extracellular traps: double-edged swords of innate immunity. J Immunol. 189 (6), 2689-2695 (2012).
  12. Menegazzi, R., Decleva, E., Dri, P. Killing by neutrophil extracellular traps: fact or folklore? Blood. 119 (5), 1214-1216 (2012).
  13. Parker, H., Albrett, A. M., Kettle, A. J., Winterbourn, C. C. Myeloperoxidase associated with neutrophil extracellular traps is active and mediates bacterial killing in the presence of hydrogen peroxide. J Leukoc Biol. 91 (3), 369-376 (2012).
  14. Martinod, K., Wagner, D. D. Thrombosis: tangled up in NETs. Blood. 123 (18), 2768-2776 (2014).
  15. Pratesi, F., et al. Antibodies from patients with rheumatoid arthritis target citrullinated histone 4 contained in neutrophils extracellular traps. Ann Rheum Dis. 73 (7), 1414-1422 (2014).
  16. Nauseef, W. M. Isolation of human neutrophils from venous blood. Methods Mol Biol. 1124, 13-18 (2014).
  17. Gray, R. D., et al. Activation of conventional protein kinase C (PKC) is critical in the generation of human neutrophil extracellular traps. J Inflamm (Lond). 10 (1), 12(2013).
  18. Jeffery, U., et al. Dogs cast NETs too: Canine neutrophil extracellular traps in health and immune-mediated hemolytic anemia. Vet Immunol Immunopathol. 168 (3-4), 262-268 (2015).
  19. McCracken, J. M., Allen, L. A. Regulation of human neutrophil apoptosis and lifespan in health and disease. J Cell Death. 7, 15-23 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

NETosis

מאמרים קשורים