מלכודות תאי נויטרופילים (נטס) הן רשתות של DNA, ההיסטונים וחלבונים נויטרופילים. למרות מרכיב של התגובה החיסונית המולדת, רשתות מעורבות אוטואימוניות פקק. פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה עבור בידוד נויטרופילים כלבי וכימות של רשתות באמצעות assay קרינת microplate.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
ואלקטרופורזיס פשוט עבור כימות של שחרור מלכודת לכלבים נויטרופילים תאיים
במאמר זה
סיכום
תקציר
מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות הן רשתות של DNA, היסטונים וחלבוני נויטרופילים המשתחררים בתגובה לגירויים זיהומיים ודלקתיים. למרות שהם מרכיב של התגובה החיסונית המולדת, NETs מעורבים במגוון תהליכי מחלה כולל אוטואימוניות ופקקת. פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה לבידוד נויטרופילים של כלבים וכימות של NETs באמצעות בדיקת פלואורסצנטיות מיקרו-לוחית. הדם נאסף בטכניקות ניקור ורידים קונבנציונליות. נויטרופילים מבודדים באמצעות שקיעת דקסטרן ושיפוע צפיפות באמצעות תנאים מותאמים לדם כלבים. לאחר מתן זמן לחיבור לבארות של צלחת 96 בארות, נויטרופילים מטופלים באגוניסטים מעוררי NET כגון phorbol-12-myristate-13-acetate או גורם מפעיל טסיות דם. שחרור ה-DNA נמדד על ידי הקרינה של צבע חומצת גרעין אטום לתאים. בדיקה זו היא שיטה פשוטה וזולה לכימות שחרור NET, אך יש לאשר היווצרות NET ולא סיבות אחרות למוות תאי בשיטות חלופיות.
מבוא
ישנם מעל 70 מיליון כלבים בארה"ב בלבד 1. כמו בני משפחה מוערך, החיות האלה זוכים לעיתים קרובות חיתוך טיפול רפואי קצה. פחות בגלל שהם חולקים הסביבה שלנו, כלבים יכולים לספק תובנות בפתוגנזה וטיפול של מחלות אנושיות 1. עם זאת, אם תרגום תגליות ברפואה אנושית לתוך טיפולים וטרינריים או להיפך, חשוב לאפיין ביסודיות מיני וריאציות אפילו במערכות שמורות ביותר כמו התגובה החיסונית המולדת. דוגמאות של הבדלים בין הכלבים לבין מערכת חיסון מולדת אנושית כוללות ביטוי גבוה CD4 על נויטרופילים כלב 2; בהעדר homolog תפקודית של IPAF חיישן flagellin ציטופלסמית בכלבים 3 ואת הביטוי של הכלאה caspase 1/4 ב טורפים 4.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הניסויים בוצעו עם רשות הרמה האתית טיפול בבעלי חיים מוסדיים אוניברסיטת איווה סטייט ועדת שימוש.
איסוף דם 1.
- צייר 9 מ"ל של דם מתוך saphenous, וריד כאפאליך או הצוואר ישירות לתוך קרישה (למשל, חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA), 1.8 מ"ג K 2 EDTA / מ"ל דם) vacutainers, או לתוך מזרק עם העברה מיידית צינורות דם המכיל EDTA. בעדינות לגלגל או להפוך את צינורות הדם כדי להבטיח ערבוב הנאות של דם קרישה אנטי.
2....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
שימוש בפרוטוקול זה, לא אמור להיות שינוי לקפל חזק קרינה לאחר הגירוי נויטרופילים עם הבקרות החיוביות, PMA ו PAF. כמו באיור 1B, גירוי של נויטרופילים כלבים עם 31 מיקרומטר PAF עבור 1 תוצאות hr לעלייה 4.0 פי ממוצע הקרינה לעומת תאים שאינם מגורה (טווח 2.0-5.8, n = 5 כלבים) 18. PMA ברמה של 0.1 מיקרומטר (איור 1 א) היא אגוניסט איטי שאינו לגרום לעליית הקרינה עד שעה 2 אבל בסופו של דבר מייצרת גידול של פי דומה קרינה (ממ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
את assay לשחרור DNA שהוצג הוא assay לכימות בקלות עבור DNA התאי. השיטה הותאמה מן בטכניקות דומות המשמשות להערכת היווצרות NET במינים אחרים, אך במהירויות צנטריפוגה, ריכוזי אגוניסט ושעות דגירה שונו כדי לייעל את השיטה לשימוש עם נויטרופילים כלבי 8,17,18. התאמות דומות יכולות להיעשות כדי להתאים את השיטה עבור מינים אחרים. Assay הוא פשוט ולא יקר בהשוואה לשיטות אחרות למדידת NETosis כגון cytometry זרימה או ניתוח תמונה. השיטה גם אינה דורשת נוגדנים כנגד מרכיבי NET, כך הוא אידיאלי לשימ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
החוקרים אין לי מה לחשוף.
תודות
המחברים מודים בתודה לד"ר ג'יימס רות', ויליאם נאוסיף וקאיוקו קימורה ולמר טום סקאדו על הסיוע בפיתוח פרוטוקולי הנויטרופילים לכלבים. RDG נתמך על ידי מלגת Wellcome Trust ref: WT093767MA.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| צינור דם מלא מפלסטיק עם ציפוי תרסיס K2EDTA | BD | 367835 | |
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| Dextran-500 | Precise chemical and Scientific Corp. | ||
| פוספט חוצץ | מלח ThermoFisher מדעי | 20012043 | |
| סרום עגל בקר עוברי, מומת בחום | ThermoFisher מדעי | 10100139 | |
| RPMI Media 1640, ללא פנול אדום או L-גלוטמין | ThermoFisher מדעי | 32404-014 | צריך להיות נקי מפנול אדום |
| 96 צלחת פוליסטירן סטרילית עם תחתית שטוחה היטב | פלקון | ||
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| גורם מפעיל טסיות | דם Sigma-Aldrich | P4904 | |
| SYTOX כתם חומצת גרעין ירוקה | ThermoFisher Scientific | S7020 | |
| Synergy 2 קורא רב-מצבי | BioTek | NA |
מקורות
- Schiffman, J. D., Breen, M. Comparative oncology: what dogs and other species can teach us about humans with cancer. Philos Trans Rl Soc B Biol Sci. 370, 1673(2015).
- Williams, D. L. Studies of canine leucocyte antigens: a significant a....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
