ניסויי שדה לאקולוגית אבקה: המקרה של<em&gt; Lycoris sanguinea</em&gt; Var.<em&gt; sanguinea</em

סיכום

כדי לחשוף את האפקטיביות המאביק של מיני צמחים נתונים, מספר שיטות של ניסויי שדה פותחו. מחקר זה מדגים את השיטות הבסיסיות של ניסויי שדה לאקולוגית אבקה באמצעות מקרה המבחן של Lycoris sanguinea var. Sanguinea ומנגנון אבקת הרומן, אבקה שוברת ניצן.

תקציר

אינטראקציות בין צמח למאביקים נחקרו במשך כמאה שנים. במהלך תקופה זו, פותחו שיטות שדה רבות כדי להבהיר את יעילות ההאבקה של כל מאביק עבור פרחים שביקרו בהן. תצפיות מאביקים היו אחת השיטות הנפוצות ביותר לזיהוי מאביקים, וניסויי שקיות וכלובים נערכו כדי להראות את יעילותם של מאביקים ספציפיים. במחקר קודם של Lycoris sanguinea var. sanguinea, לא זוהו המאביקים היעילים שלו, תדירות הביקור של כל מבקר פרח ואסטרטגיות הרבייה שלו. מחקר זה מדווח על תצפית כי דבורים קטנות ביקרו בפרחים שנפתחו חלקית (ניצנים נשברים). למיטב ידיעתנו, תופעה זו לא דווחה בעבר. יתר על כן, מחקר זה חוקר את ההשערה שדבורים קטנות יכולות להאביק בשלב הפריחה הזה. מחקר זה מדגים את השיטות הבסיסיות של ניסויי שדה באקולוגיה של האבקה באמצעות L. sanguinea var. sanguinea. תצפיות מאביקים ווידאו דיגיטלי הראו את תדירות הביקור של כל מבקר פרחים. ניסויי שקיות וכלובים גילו כי ניתן להאביק את הפרחים הללו במלואם וכי האבקת ניצנים שבורת יכולה להיות חשובה להאבקה של מין צמח זה. היתרונות והחסרונות של כל שיטה נדונים, ומתוארים פיתוחים אחרונים, כולל ניסויי מעבדה.

מבוא

אינטראקציות צמח-מאביק הן דוגמאות מובהקות לחקר ביולוגיה ואקולוגיה אבולוציוני. היחסים ההדדיים בין פרחים ומאביקים נחשבים קדמו את פיזור angiosperm ^1,2 כתוצאה של ברירה טבעית, אם כי גורמים ביוטיים אביוטי אחרים יש גם השפיעו ^3,4,5. הוא חשב גם כי תכונות פרחוניות השתנו להסתגל המאביקים היעילים ביותר כדי לייצר יותר פרות וזרעים ^6. אמונות אלה נבנו על פי מחקרים גדולים על מדדים שונים, כגון יעילות אבקה, שכוללים פרשנויות שונות ^7.

צמחים בעלי פרחים אשר להכליל מערכות אבקה נצפים על ידי סוגים שונים של מאביקים ^8. בזאת, מבקר פרח הוגדר כזן חיה שבקר כדי לקבל פרס פרחוני, ומהאביקים הוגדרו מבקרים פרחוניים המאביקים.חלק מהמבקרים האלה לשאת גרגרי אבקה conspecific לסטיגמטה של ​​פרחים ביקרו ניתן לסווג מאביקים. מבקרים אחרים יכולים להיות גם קצת אבקת intraspecific; הם עלולים לנהל פחות האבקה בשל חוסר התאמה התנהגותית או מורפולוגיים בין מאביקים את הפרחים. הבדלים דומים אלה בתרומת רביית צמח יכולים לייצר בדרגות שונות של לחץ סלקטיבי על תכונות פרחוניות ⁹ ועלולים לגרום להסתעפות אדפטיבית של צמחים פורחים. לכן, למרות רכב הקהילה מהאביק ואת שפע המינים ביחס חשובים ^10, ההערכה המדויקת של כל האפקטיביות של מבקר היא גם קריטית כדי לקבוע את אדפטיבית ו / או תהליכי התפתחות של הצמחים.

במחקר זה, ערכות כמותיות של יעילות מאביק, מוגדר ייצור הפרות וזרעים לכל תדירות ביקור, נקבעו ^11. המפרטies ותדירות כל מבקר פרחוני נצפו, ואפקטי רבייה על הפרחים ביקר נאמדו. ההקלטה של ​​ביקורים פרחוניים באמצעות תצפיות אנושיות היא שיטה קלסית באקולוגית אבקה. עם זאת, שיטה זו מטילה נטל גדול על משקיפים, אשר נדרשים להישאר מול הצמחים לקחת זהיר, מדידות לטווח ארוך. לאחרונה, הטכנולוגיות של צילומים והקלטה התפתחו במהירות, ומצלמות וידאו דיגיטלי בעלות הנמוכה אפשרו כניסתה של הקלטת וידאו לתצפיות מאביק ^12,13. שיטות אלה יכולים להקל על האיסוף של מידע בסיסי על מבקרים פרחוניים יכולות לעזור לפתח הבנה של אקולוגית ההאבקה של מיני צמחי יעד.

עם זאת, את תדרי הביקורים של המאביקים אינם בקורלציה בהכרח לאפקטיביות האבקה שלהם ^7,14, וזה חשוב כדי להעריך את ההשפעות האיכותיות של כל מאביקעל כושר פרח. האפקטיביות אבקה הוערכה באמצעות מספר גרגרי אבקה על ^15,16 סטיגמטה, ^17,18 צמיחת צינור האבקה ופרות ו / או זרעי ייצור ^19,20. לצוד ניסויים, שנערך באמצעות שקיות בלעדיות-מבקרות, הן השיטות הטיפוסיות לבדיקת תאימות עצמית, אוטוגמיה ^21,22, ואת הנוכחות של apomixes ^23. בנוסף, ההערכה אפקטיבית האבקה עבור המאביק מסוים מאסף המבקר כבר לבצע בתדירות גבוהה בסביבות שבן מבקרים פרחוניים אחרים הוגבלו (כלומר, כלוב תיל, נטו, או שקית עם רשת קטנה מספיק כדי לכלול מאביקים גדולים כי הוא סט על צמחים פורחים). לדוגמא, ניסויים לצוד עם שקיות רשת קטנות נערכו במטרה לחשוף את יכולת ההאבקה של נמלים או תריפסים ^24,25. יתר על כן, ניסויי הדרת ציפור באמצעות כלוב מתכת או נטו הראו המאביקים האפקטיביים של מיני אלוורה^26-28.

מטרות המחקר היו: 1) כדי להציג את השיטות בהן השתמשו במאמר הקודם ו -2) כדי לשפר את השיטות האלה לשימוש כללי במחקרים אחרים על מבקרים פרחוני, תדרים לביקור שלהם, והשפעתם על כושר צמח var sanguinea Lycoris.. sanguinea הוא אחד המינים הכלולים הסוג Lycoris, אשר מופץ באופן נרחב ברחבי יפן ומצמצם בקוריאה ²⁹ ויש לו בצורת משפך פרחים אדמדם כתום (איור 1 א). מחקר קודם גילה כי ל sanguinea var. sanguinea בקר מינים רבים של חרקים, כוללים מיני דבורה קטנים מזוהים ואת המינים הגדולים Amegilla Florea ^29. עם זאת, את האפקטיביות תדרי אבקת ביקורים של מבקרים אלה לא מזוהים. תצפיות מאביק לזיהוי מבקרים פרחוניים נערכו לראשונה. ביקור על ידי דבורים קטנים היה observed על פרחים שלא נפתחו עדיין לחלוטין (שבירת ניצנים; 1b הדמוי, ג). דבורים קטנים זזו במהירות סביב המאבקים undehisced ב הניצנים השבירים ואסף אבקה באמצעות הלסתות שלהם. ההשערה הייתה כי הדבורים הקטנים יכולים להיות מאביקים בשלב השביר-ניצן כי הפערים בין המאבקים ואת סטיגמטה הפרחים היו קטנים יותר מאורך הגוף של הדבורים. לכן, ניסויים לצוד נערכו על מנת לבחון את יכולת ההאבקה של דבורים קטנות בשלב השביר-הניצן, ובנוסף לבחון את אסטרטגיות רבייה של L. var sanguinea. sanguinea. ניצנים אלה היו שקיות אחרי הדבורים הקטנים בקרו, אשר אפשרו הערכה של יכולת ההאבקה של הדבורים. האנשים היו בכלוב עם ניצנים שטרם נפתחו. כלוב קטן-רשת שמש, שדרכו רק דבורים קטנים יכולים לעבור, המאפשר הערכה של יעילות האבקה של דבורים קטנות לאורך flowe כולובשלב טבעת.

פרוטוקול

הערה: מאמר זה מבוסס על העבודה הקודמת שלנו ^30. חלקים מסוימים הם נדפסו באישור האגודה הבוטנית של יפן שפרינגר יפן.

1. תצפית של מבקרים פרחוניים

1. בחירה של שדות תצפית
   1. חפש את האזורים שבם החומרים הצמחיים מופצים, ולבחור את אתרי מחקר מועמד שימוש במשאבים אמינים, כגון ספרי תמונות, כתבי עת אקדמיות, וכו 'התאם את מספר אתרי מחקר כדי להתאים את מטרות המחקר (למשל, מגוון רחב של מקומות עבור ההשוואה של מבקרי פרח ברחבי יפן).
   2. בדקו את המיקומים של אוכלוסיות מועמד שנבחרו ואת המרחקים בין נקודות מוצא רלוונטיות, כגון מכוני מחקר ולינה, אם מחקר ארוך טווח הוא זקוק.
   3. בערך להעריך כל גודל אוכלוסייה על ידי ספירת מספר האנשים צמח באזור יחיד. בחר אוכלוסיות גדולות עבור ניסוי מניפולציותs באמצעות יחידים צמחים רבים.
   4. תצפית מראש של מבקרים פרחוניים
      1. החלט אילו מיועד לאנשים פרטיים בכל אזור יקוים באותה מרווח הזמן, תלוי צפיפות האוכלוסין. בחר 5-10 פרחים טריים-פתחו או שביר ניצנים כמו פרחי יעד, ולדחות אלה מושפלים שכבר נפתחו.
      2. הפעל את התצפית ויזואלית לתקופה של יום שלם, כי את הפרחים יכולים להיות בקרו מאביקים שונים בזמן שונה נע ^31,32.
      3. על סדיני ההקלטה, להקליט שם ​​המין של מבקרים פרחוניים ואת הזמן של כל ביקור לכל שעה לכל פרח.
      4. מקרוב לראות האם מבקרים פרחוניים לגעת מאבקים ו / או סטיגמטה; אם הם עושים, להקליט את המבקרים כמו מאביקים. אם המבקרים הפרחוניים רק לבקר את הפרחים ואל תיגעו איברי הרבייה, להקליט אותם, כמו מבקרים.
      5. שימוש נטו חרקים או aspirator בעבודת יד, ללכוד את המבקרים הפרחוניים לזהותלשמרם כמו דגימות (איור 1F). להרוג את המבקרים לכודים במהירות עם אתיל אצטט או לחץ אצבע אל החזה, ולשמר אותם בתוך התיק רך או בצינור או במקרה פלסטיק עם אתנול 100%.
      6. לאחר התצפית, לזהות את השמות הספציפיים של דגימות באמצעות תכונות מורפולוגיות או, במקרה של קשיים בזיהוי, לבקש את עזרתו של מומחים לכל קבוצת טקסונומיות.
2. תצפית בתחום
   1. מחקר בחר אתרים המבוססים על הנגישות שלהם, גודל אוכלוסייה, ומספר המבקרים פרחוניים. בחר תקופות זמן כולל מדגם מייצג של מבקרים פרחוניים בעונת הפריחה, ולקבוע תקופות תצפית על בסיס מטרות מחקר (למשל, עבור מחקר על תנודות ביקורים בתדירות ידי מבקרים פרחוניים, תקופות זמן רבות צריכות להיות מוגדרות).
   2. הכן את ציוד ההקלטה המתאים, כגון מצלמות וידאו דיגיטליות (למשל, עבור הקלטת הלילה, מצלמות וידאו עם פונקציית אינפרא אדומה אמורות לשמש).
   3. בחר את פרחי היעד באותו אופן כמו 1.1.4.
   4. תקן את מצלמות וידאו חצובות אלומיניום. הגדר את המצלמות עם חצובות מול אנשי היעד, במרחק של כ -50 סנטימטרים.
   5. בדוק ולשנות את כמות האור ואת המיקוד של חומרים על המסך מציג המצלמות לפני הצילומים.
   6. הפעל את תצפית ויזואלית והסרטה וידאו בו זמנית עבור אזורי הזמן המתאים מוערך על ידי תצפיות מראש (במקרה הנוכחי, תקופות התצפית היו במשך יותר משש שעות בממוצע, מכ 05:00 am כדי 13:00 ).
   7. זהה את שמות מינים של מבקרים ומאביקים, ולהקליט את שמם ואת פעמי הביקורים שלהם על סדיני ההקלטה.
   8. לכידה ולזהות את המבקרים ומאביקים באותו אופן כמו 1.1.4.5.
   9. חזור על שלבים 1.2.1 עד 1.2.7 לכל observatioתקופת n. הגדר את תקופות התצפית מבוססות על מטרות המחקר ונתונים בטחוניים מראש.
3. ניתוח נתונים לאחר תצפית
   1. זהה את שמות מינים של דגימות שנתפסו לאחר תצפית מאביק באותו אופן כמו 1.1.4.6.
   2. בדוק את קטעי וידאו לציין שמות מינים ושעות הביקור שלהם באותו אופן כמו עבור תצפית ויזואלית.
   3. חשב את תדרי ביקור לכל פרח לשעה של כל מבקר פרחוני מנתוני הקלטת תצפית וידאו ויזואלי. השוואת תדרים אלו סטטיסטיים בין האתרים והשנים של כל מבקר בשיטות סטטיסטיות מתאימות על סמך נתונים סטטיסטיים בסיסיים באמצעות תוכנה מתאימה, כגון R, SPSS, ו / או SAS ^33-35 (למשל, ניתוח דו כיוונית של שונות (ANOVA ) עם הבדל משמעותי הכנה של Tukey (HSD) בדיקה בתוכנת R).

2. ניסויים Bagging וקייג

1. הכנות Bagging וניסויי קייג
   1. עבור הניסויים לצוד, להכין שקיות שיש בגדלים רשת קטנה (~ 0.5-1 מ"מ) ולהשתמש בהם כדי למנוע ביקורים פרח לחלוטין (למשל, שקיות בד לא ארוג שימשו הניסויים לצוד בשנים 2011 ו -2012).
   2. עבור הניסויים כלוב, להכין לוחות חוט או רשת פלסטיק בקוטר המאפשר היעד מבקרים קטן לעבור אך אינו כולל הגדולות שבהן, ולהתחבר לוחות רשת אלה כדי ליצור כלוב. ודא כי אין פערים גדולים יותר מאשר קוטר הרשת. התאם את הגודל והצורה של כלובי מבוסס על מיני צמחים היעד ומספרים בודדים.
2. ניסויי bagging
   1. בחר 30 אנשים לכל טיפול שאין להם נזקי אוכלי עשב או מסביבה חמורה. לקבלת טיפול, לבחור פרח בודד מכל צמח פרט, או להשתמש פרחים בודדים על צמח אחד.
   2. תיק tהוא למקד פרחים בשטח לאחר תיוגם עם קלטת (מספר סידורי האלפבית; איור 1G). היזהר שלא לגעת מאבקים או סטיגמטה בתוך השקיות כדי למנוע את האפשרות של אבקה עצמית.
   3. בזהירות לתקן שקיות אל הפרחים באמצעות מחרוזת או חוט רך (איור 1 ד).
   4. בזהירות להגדיר פרחים בודדים זקוף עם תומך באמצעות חוט או חוט רך לתמוך יחידים נגד הטיה או קריסה תחת המשקל של שקיות או הרוח, לפי הצורך. טוויסט או ללפף חוט או חוט בשקט סביב הגבעול של אדם היעד, כדי לא ליצור נזק.
   5. טיפולי בניסויים לצוד
      1. לטיפול "השליטה", להדביק את התוויות על פרחי היעד לנהל שום טיפול. אפשר למבקרים פרחוניים לבקר בחופשיות.
      2. לטיפול "Outcrossing", לכסות את הניצנים עד שהם פרחים, ולאחר מכן להסיר את המאבקים של פרחים ארזו. שים קצת polleדגני n מיחידים מרובים על סטיגמטה.
      3. לטיפול "Selfing", לכסות את הניצנים עד הפרחים פתוחים, ולשים אבקה מאותו הפרחים על סטיגמטה שלהם. מכסה פרחי מטופלים אלה שוב.
      4. לטיפול "Auto-העצמי", לכסות את הניצנים עם שקיות עד סוף עונת הפריחה.
      5. לטיפול "ניצן חם", לזהות הניצנים השבירים כי כבר בקרו ולבחון את הכניסה או יציאה של דבורים קטנות (1b הדמוי, ג). הסר את המאבקים של הניצנים השבירים למנוע תצהירי אבקה חזרו על אותו הפרח אחרי הביקור ידי דבורים קטנים, ואת תיק ניצנים אלה במהירות כדי למנוע ביקורים נוספים.
      6. לטיפול "הפריחה", תיק הניצנים עד לשלב הפתיחה כדי למנוע ביקורים בשלב השביר-הניצן. לאחר מכן, להסיר את השקיות ולאפשר למבקרים לאסוף צוף ואבקה.
      7. לטיפול "באד",להסיר את המאבקים בין ניצנים שעוד לא פתחו outcross אותם באופן מלאכותי. ניצנים אלה תיק במהירות כדי למנוע ביקורי פרח.
3. ניסויי קייג
   1. מכסה את הפרטים צמחו המטרה שכלוביהם מוכנים. התאם את עמדות פרחים בכלוב ביד כדי למנוע תצהירי קשר ואבקה בין סטיגמטה השונה (איור 1E).
   2. לטיפול "הכלוב", בחר את האנשים עם ניצנים סגורים ולשים תוויות עליהם לזיהוי פרחים שנבחר. קייג 'אנשים עם ניצנים שכותרתו לדחות את השפעות מלפני הקמת כלובי (כלומר, חרקים פרחוני לא יכולים לבקר ניצנים שלא נפתחו, ורק את ההשפעות של חרקים לבקר לאחר ההקצאה של כלובים ניתן לאמוד).
   3. צרף הכלובים בחוזקה אל הקרקע באמצעות מוטות ברזל כדי למנוע כניסת מבקרים בין בסיס כלוב הקרקע.
4. ניתוח נתונים אפter Bagging וניסויי קייג
   1. לאסוף את כל הפרחים שכותרתו בסוף בעונת הפריחה (האיור 1G) על ידי הגזירה הפרידו אנשים האימהיים. שמור על מדגם שכותרתו בנפרד על מנת למנוע זיהום שלהם.
   2. לבדוק את קיומו או אי קיומו של פרות להגדיר על כל אחד המסומן flower.Record מספרי הזרע של כל פרי במקרה של הגדרת פרות.
   3. חשב את היחס בין מספרים פירות לכל פרח (יחס שנקבע פירות, מוגדר כמספר של פירות מחולק במספר פרחים) ושל מספרים זרע לכל פירות בשלים (יחס זרע-סט, מוגדר כמספר של זרעים מחולק במספר של ביציות) באמצעות כל המספרים שנרשמו.
   4. סטטיסטית להשוות את יחסי-סט זרע התועלת שבזה ובין הטיפולים בשיטות המתאימות ותוכנה, כגון אלה המפורטים ב 1.3.3 (למשל, חד סטרי ANOVA עם HSD של Tukey או הבדיקה המדויקת של פישר R תוכנה ^33).
   5. החקירות של חומרים באמצעות תוצאות הניסויים לצוד
      1. כדי לבדוק את הצורך מהאביקים חיים, סטטיסטית להשוות את התוצאות בין "שליטה" ו "Auto-עצמי" טיפולים.
      2. כדי להעריך את מידת הגבלת אבקה, להשוות את "השליטה" וטיפולים "Outcrossing".
      3. כדי לבדוק תאימות עצמית, להשוות את "Outcrossing" ו "Selfing" טיפולים.
   6. ערכות של השפעות של אבקה שוברת ניצן
      1. השווה את הטיפולים "שליטה" ו "באד" כדי לקבוע אם הסטיגמטה של ​​הניצנים השבירים הם reproductively בוגר והאם הערך של הטיפול "השליטה" יכול לשמש עבור השליטה בשלב השביר-הניצן.
      2. השווה את "עצמי האוטומטית" ו "ניצן שובר" טיפולים כדי לקבוע אם צלחת רבייה של פרחי האבקה עם דבורים קטנים השבירבשלב -bud סטטיסטי גבוה מזו של צמחי ביצוע אוטוגמיה (כלומר, על מנת לבחון את קיומה של אבקה שוברת ניצן). לאחר מכן, להשוות בין שני הטיפולים האלה עם "השליטה" כדי להעריך את יעילות ההאבקה של אבקה שוברת ניצן.
      3. השווה את "הניצן החם," "קייג '," ו "פריחה" טיפולים להעריך את שפעות רבייה של אבקה שוברת ניצן.

תוצאות

חמש אוכלוסיות נבחרו לתצפיות המאביק. בשלב טרום התצפית, ביקורים של מינים שונים של חרקים לפרחי פתיחה ודבורים קטנים ניצנים שבירים אושרו. תצפיות מבקר פרחוניות גילו כי רוב המבקרים עד החמישה כל אתרי המחקר היו פרטים של מיני הדבורים הקטנים japonicum Lasioglossum. תקליט הביקור הכולל הראה כי יחסי הביקור של מין זה היו יותר מ -90% בשלושה אתרים (איור 2). לעומת זאת, היחס בין האורח השני-בשכיחותו, Amegilla Florea, היו נמוכים מ -10...

דיון

תצפיות וניסויי פרח לצוד הועסקו במחקר זה לחשוף את תדרי ביקור ואת הצלחת הרבייה הנשית של צמחים, בהתאמה. בשנת הדפנים (1992) ^38, שיטת הקלטת הייתה יעילה כי זה יכול להקליט את העיתוי ומשך המבקרים לניתוח ולמנוע הטיה צופה. עם זאת, באותה העת, שיטה זו נדרשת ציוד יקר, ועל פי ההתבוננות היו מוגבלת על ידי חיי סוללה. לאחרונה, עלות הציוד להפקת תיעוד וידאו ירדה, והשיטה הטכנולוגית הזו יכולה להיות מועסקת במחקר מאביק אחר. במחקר זה, את התדרים הביקור היו שונים משמעותית בין תצפיות ויזואלית וויד...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
גיליון הקלטה	כל	חרקים NA
	כל	פוטר NA
	כל	NA
אתיל אצטט	כל	NA
100% אתנול	כל	NA
	כל
	כל	NA
רך שקית	כל
	כל
חצובה	כל
	כל
או לוחות רשת פלסטיק	כל
	כל
כל	תומכי	מקל NA
	כל	של NA
או חוטים	של כל	NA
pincette(s)	כל	NA

רשת צינור פלסטיק מארז פלסטיק NA מצלמת וידאו דיגיטלית NA NA שקיות NA חוט NA חוטי ברזל NA סרט תיוג NA מיתרים רכים