מאמר שיטה

שימוש במחסנית סינון עבור הסינון של מי דוגמאות הפקת DNA הסביבה

25.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54741

⸱

25 בנובמבר 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ecology and Environmental Sciences, Natural History Museum and Institute, Chiba, 2Graduate School of Human Development and Environment, Kobe University, 3Faculty of Science and Technology, Ryukoku University, 4Okinawa Churashima Research Center, 5Graduate School of Simulation Studies, University of Hyogo

במאמר זה

סיכום

אנו מתארים פרוטוקול לסינון דגימות מים עם מחסנית מסנן וחילוץ DNA סביבתי (eDNA) מבלי לחתוך את המארז כדי להסיר את המסנן. פרוטוקול זה פותח עבור מטברקוד דנ"א מדגים, אולם הוא ישים גם לדנ"א סביבתי מאורגניזמים אחרים.

תקציר

מחקרים אחרונים הראו כי השימוש ב-DNA סביבתי (eDNA) מדגים מתאים ככלי ניטור לא פולשני. רוב המחקרים הללו השתמשו במסנני סיבי דיסק כדי לאסוף eDNA מדגימות מים, אם כי מספר מחקרים מיקרוביאליים בסביבות מימיות השתמשו במחסניות מסנן, מכיוון שלמחסנית יש יתרון של התאמה לכמויות מים גדולות וקלות שימוש כללית. כאן אנו מספקים פרוטוקול לסינון דגימות מים באמצעות מחסנית המסנן וחילוץ eDNA מהמסנן מבלי לחתוך את הבית. החלקים העיקריים של פרוטוקול זה מורכבים מ-1) סינון דגימות מים (נפחי מים ≤4 ליטר או >4 ליטר); (2) מיצוי DNA על המסנן באמצעות שייקר רולר המונח באינקובטור שחומם מראש; ו-(3) טיהור DNA באמצעות ערכה מסחרית. באמצעות שימוש בפרוטוקול זה ובפרוטוקולים ששימשו בעבר, אנו מבצעים ניתוח מטא-ברקוד של דנ"א סביבתי שנלקח ממכל אקווריום ענק (7,500 מ"ק) עם הרכב מינים ידוע, ומציגים את מספר המינים שזוהו לכל ספרייה משני הפרוטוקולים כתוצאות מייצגות. הפרוטוקול הזה פותח עבור מטה-ברקוד של דנ"א סביבתי מדגים, אולם הוא ישים גם לדנ"א סביבתי מאורגניזמים אחרים.

מבוא

DNA הסביבה (עדנה) בסביבות מימיות מתייחס לחומר גנטי המצוי בעמודת המים. מחקרים שנעשו לאחרונה הדגימו את התועלת של עדנה לאיתור דגים מסביבות מימיים שונים, כולל בריכות 1-3, נהרות 4-8, נחלים 9, ומי ים 10-14. רוב המחקרים האלה התמקדו גילוי של יחיד או כמה פולשני 1,4-6,8,14 ונדירים או מאוימים מינים 3,9, בעוד מחקרים שנעשו לאחרונה כמה ניסו זיהוי סימולטני של מינים רבים בקהילות הדגים המקומי 7,9, 12,13,15 ו mesocosms 11,12.

הגישה האחרונה נקראת "metabarcoding" ועדנה metabarcoding משתמש וקבוצה אחת או מספר של פריימרים PCR כדי coamplify אזור הגן על פני דגימות מגוונות טקסונומית. זה ואחריו כנת ספרייה עם אינדוקס בנוסף מתאם, ואת הספריות באינדקס מנותחות על ידי רצף מקביל תפוקה גבוההפּלַטפוֹרמָה. לאחרונה מייה et al. 12 פיתח פריימרים PCR אוניברסלי עבור metabarcoding עדנה מן הדגים (המכונה "MiFish"). פריימרים MiFish ולמקד לאזור hypervariable של הגן המיטוכונדריה 12S rRNA (163-185 נ"ב), אשר מכיל מידע מספיק כדי לזהות דגים למשפחה, הסוג ומינים טקסונומיות למעט במבניהם כמה קשורים זה לזה. עם השימוש של פריימרים אלו metabarcoding עדנה, מייה et al. 12 זוהה יותר מ -230 מינים ימיים סובטרופי מטנקים אקווריום עם שוניות אלמוגים והרכב מינים ליד האקווריום.

תוך אופטימיזציה של פרוטוקול metabarcoding כדי להתאים מי ים טבעי עם רמות משתנות של ריכוז עדנה מן הדגים, יש לנו לב כי פריימרים MiFish נכשלו מדי פעם כדי להגביר את אזור היעד להכנת ספרייה שלאחר מכן. אחת הסיבות סבירות יותר עבור הגברת PCR מוצלחת זה הוא חוסר הכמות מספקת של template DNA הכלול בנפחים קטנים של מים מסוננים (כלומר 1-2 L). למרות ריכוז עדנה מקבוצת טקסונומיות ספציפית הוא לידיעה לפני ההגברה, סינון של כרכי מים גדולים (> 1-2 L) תהיה דרך פשוטה ויעילה כדי לאסוף יותר עדנה מן הסביבות המימיות עם שפע דגים נדיר ביומסה, כגון מערכות אקולוגיות תחת כיפת האוקיינוס ​​במעמקי הים.

ביחס מסננים סיבים דיסק כמקובל בשימוש במספר של מחקר עדנה דגי 16, מחסניות מסננות יש את היתרון של אדיב כרכי מים גדולים לפני סתימת 17. למעשה, מחקר שנערך לאחרונה הראה נפח גדול (> 20 L) סינון של דגימות מי ים החוף באמצעות מחסניות מסננות 18. בנוסף, הם בנפרד ארוזים וסטרילי, וכמה מדרגות העבודה הניסיונית יכולות להתבצע בית המסנן, ובכך להקטין את ההסתברות של זיהום מהמעבדה 19. האחרוןתכונה חיונית עדנה metabarcoding, שבו את הסיכון לזיהום נותר בין הניסוי הגדול אתגרים 20,21. למרות היתרונות הטכניים האלה של מחסניות מסננות, זה לא נעשה שימוש במחקרי עדנה של דגים עם שני חריגים 8,15.

כאן אנו מספקים פרוטוקול עבור סינון של דגימות מים עם מחסנית מסנן וסחיטת עדנה ממסנן שלה מבלי לחתוך את הדיור. כמו כן אנו מספקים שתי מערכות סינון מים חלופיות תלוי כרכי מים (L ≤4 או> 4 L). כדי להשוות את הביצועים של הפרוטוקול החדש שפותח ובפרוטוקול בעבר בשימוש באמצעות מסנן מזכוכית בקבוצת המחקר שלנו 12,14,22,23, אנו מבצעים עדנה metabarcoding ניתוח של מי ים מטנק אקווריום ענק (7,500 מ '3 ) עם הרכב מינים, ולהראות את מספר המינים שזוהו נגזרים משני הפרוטוקולים כתוצאות נציג. h פרוטוקול זהכפי שפותחו עבור metabarcoding עדנה מן הדגים, אך גם לגבי עדנה מאורגניזמים אחרים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: פרוטוקול זה אינו עוסק מי דגימה ושיטות metabarcoding. מים אפשר יהיה לטעום באופנים שונים בהתאם למטרות המחקר 16 ותראו מייה et al. 12 לפירוט אודות שיטות metabarcoding באמצעות פריימרים MiFish. ראוי לציין, כי המים שנדגמו צריכים להישמר מאוד קרים מסוננים בתוך כמה שעות, כדי למנוע שפלה של עדנה. כמו כן שימו לב כי פרוטוקול זה כרוך בשימוש של שייקר רוטרי באינקובטור, והאחרון חייב להיות גדול מספיק כדי להכיל את לשעבר. בנוסף, בצנטריפוגה שיכולה להכיל שני 15 מיליליטר ו 50 מ"ל צינורות חרוטים הם הכרחיים כדי להסיר את הנוזל הנותר מן מסנן סינון דואר לאסוף DNA שחולץ בתוך המחסנית, בהתאמה.

1. עיבוד ראש מתברג ושקית פלסטיק L 1

הערה: דלג על שלב זה אם נפח הסינון הוא> 4 L.

  1. לקדוח חור דרך המרכז של ג בורגap (מצורף בשקית ניילון 1 L הפנויה) עם אותו קוטר (4.8 מ"מ) כמו הצינור מקרין מתוך מחבר luer נעילת זכר. באמצעות צבת אלכסונית, לקצר את הצינור של מחבר luer נעילת הזכר לגובה בלתי הולם (ca. 3 מ"מ) כדי למנוע סתימת כמות קטנה של מים בתוך הכובע לאחר סינון.
  2. החלת הדבקה מיוחדת עבור פוליאתילן (PE) ו פוליפרופילן (PP) הוא בתחתית המשטח של מחבר luer נעילת זכר בורג כובע, בהתאמה. יש להמתין מספר דקות עבור מליטת דבק טובה (עיין בהוראות היצרן).
  3. הכנס את מחבר luer נעילת זכר לתוך החור של מתברג. חכה עד מליטת דבק המלאה של שני חלקים (בדרך כלל> 24 שעות). לעקר את מכסה בורג עם מחבר luer נעילת זכר עם 10% אקונומיקה מסחרי (ca. תת-כלורי נתרן 0.6%) לפני השימוש.
  4. פאנץ שני חורים בשתי הפינות בתחתית שקית ניילון 1 L כדי לתלות אותו ממקור שאינו mesלוח h (שלב 3). ודאו בקוטר של החורים הוא גדול יותר מזה של השיניים בלוח הרשת.

2. אסיפה של מערכת הסינון

  1. צרף צינורות ואקום גבוה למחבר הקלט של משאבת aspirator ולצרף את הקצה השני של צינורות אל סעפת. הקפד כי T-שסתום אדום שלוש הסעפת נמצא "במצב הכבוי" (כלומר, אופקי).
  2. לבישת סט של כפפות נקיות, הכנס luer הנשי הולם ומחבר ואקום בקצות העליון והתחתון של צינורות גומי ואקום לסינון, בהתאמה.
  3. בזהירות לצרף את luer הנקבה ההולמת ליציאת לשקע של מחסנית המסנן ולצרף למחבר ואקום פקק סיליקון.

סינון 3. דגימות מים (≤4 L) באמצעות מסנן Cartridge

הערה: דלג על שלב זה אם נפח הסינון הוא> 4 L. זה מערכת סינון דורשת f לוח עומד עצמיאו לתלות את שקית פלסטיק ובה 1 ליטר של מים. פנל רשת, חודים מרובים, עמדו על הלוח, כולם הזמין מחנויות מקוונות, יהיו שימושיים להרכבת יחידה זו. חיטוי הכניסה ויציאה כמוס luer עבור המחסנית המסננת לפני השימוש.

  1. יוצקים את המים 1 L שנדגמו לתוך שקית ניילון ולסגור את מכסה בורג עם מחבר luer נעילת זכר.
  2. בזהירות לחבר יציאת כניסה של מחסנית המסנן התאספה עם מחבר luer נעילת הזכר של שקית הניילון. אל מעל להדק את מחבר luer נעילה; אחרת היחידה תדלוף פעם השאיבה מתחילה. ודא שכל החיבורים מחוברים היטב לפני שאני תולה את שקית הפלסטיק פאנל רשת.
  3. בזהירות לתלות את שקית הניילון עם המחסנית המסננת משתי שיניים בלוח הרשת וכנס פקק סיליקון לתוך יציאת כניסה של הסעפת.
  4. הפעל את aspirator. פתח את t-שסתום האדום לסינון. הפעל את הסעפת עד מחסנית המסנן היא יבשה, tתרנגולת להפוך את t-שסתום אדום למצב כבוי.
  5. חזור על 3.1-3.4 צעדים עד כמות המים הרצויה מסוננת.
    הערה: לקבלת 1 ליטר של מים שנלקחו שוניות אלמוגים סובטרופי, זה לוקח בערך שלוש דקות הסינון.
  6. מוציאים בזהירות את מחסנית מסנן משקית הניילון ואת מחבר ואקום.
  7. כיסוי או בשני הקצוות של מחסנית עם כמוסות luer הכניסה והיציאה.
  8. לייבל luer מחסנית כניסת הכובע כראוי באמצעות עט ממס הוכחה לייבוש מהיר וסימון הלא מריחה.
  9. אחסן את מחסנית המסנן ב -20 C לפני מיצוי DNA.

סינון 4. מים (> 4 L) דוגמאות באמצעות מסנן Cartridge

ההערה: דלג על שלב זה אם נפח מי הסינון הוא ≤4 ל מערכת סינון זה דורש בקבוק ספר 10 L מצויד שסתום טיפ של 10 מיליליטר פיפטה חד פעמי. בקוטר פנימי של קצה פיפטה 10 מ"ל (15.0 מ"מ) להתחדד של קצהבסוף צריך להתאים כדי בקוטר חיצוני של השסתום (15.0 מ"מ) יציאת כניסת של מחסנית מסנן, בהתאמה. חיבורי שניהם נשמרים באופן מאובטח במהלך הסינון בהתקף חיכוך. לעקר את קצה פיפטה עם 10% אקונומיקה מסחרי (חומצת נתרן בקירוב 0.6%) לפני השימוש.

  1. הכן את כמות מתאימה של מים שנדגמו בבקבוק הספר. בחוזקה והכנס את קצה פיפטה 10 מ"ל לתוך השסתום של הבקבוק הספר 10 L.
  2. בחוזקה להכניס את פתח היציאה של מחסנית המסנן לתוך סוף קצה פיפטה והכנס את פקק סיליקון לתוך יציאת הכניסה של הסעפת. הפעל את aspirator. פתח את t-שסתום האדום לסינון. הפעל את הסעפת עד מחסנית המסנן היא יבשה, ולאחר מכן להפעיל את T-שסתום אדום למצב הכבוי.
    הערה: לקבלת 10 ליטר של מי ים שנלקח שוניות אלמוגים סובטרופי חיצוניות, זה לוקח בערך 30-40 דקות עבור הסינון.
  3. מוציאים בזהירות את מחסנית מסנן משקית הניילון ואת מחבר ואקום. שווי הואהקצוות של מחסנית עם כמוסות luer הכניסה והיציאה. לייבל luer מחסנית כניסת הכובע כראוי באמצעות עט ממס הוכחה לייבוש מהיר וסימון הלא מריחה. אחסן את מחסנית המסנן ב -20 ° C לפני מיצוי DNA.

הפקת 5. עדנה מהמסננת

הערה: שלבי 4 ו -5, אנו משתמשים ערכה מסחרית, בעקבות פרוטוקול במידה רב "דם בעלי הגרעין" שמספק ערכה. לשם פשטות, אנו מתארים את ההליך לעיבוד מחסנית פרט. בפועל, אנו ממליצים עיבוד 8 (או את המספר המרבי של צנטריפוגות) או מסננים פחות בכל פעם.

  1. מחממים באינקובטור ל -56 מעלות צלזיוס.
  2. להכין צינור 2.0 מ"ל על ידי חיתוך כובע צירים מהצינור. מחק את הכובע.
    הערה: צינור זה משמש צינור איסוף עבור הנוזל הנותר במסנן.
  3. הסר את הכניסה (לא מוצא) luer כובע ממחסנית המסנן והכנס את i יציאת כניסהn כדי צינור האיסוף. בחוזקה לאטום חיבור בין צינור המחסנית ואיסוף באמצעות סרט עצמי איטום.
  4. הכנס את יחידת בשילוב למתאם צנטריפוגות במשך צינור חרוטי 15 מ"ל. צנטריפוגה מחסנית ב 5000 XG דקות 1 כדי להסיר את הנוזל הנותר במסנן.
  5. הסר את צינור איסוף ממחסנית מסנן וזורקים הצינור. Re-כובע נמל המפרצון של המחסנית.
  6. הכינו תערובת של 20 μl פתרון proteinase-K, 220 μl PBS (פוספט בופר; לא מסופק על ידי בערכה) ו -200 μl חיץ AL.
    הערה: המחסנית המסננת להכיל עד פי ארבעה כרכים של התערובת (. Ca 1.8 מיליליטר).
  7. הסר את הפקק ולהוסיף את התערובת (440 μl) לתוך המחסנית מסנן באמצעות קצה פיפטה. הכנס פיפטה לחלוטין ליציאת הכניסה כך קצה פיפטה גלוי בתוך המחסנית בדיוק מעל הממברנה.
  8. Re-כובע יציאת הכניסה ולמקם את המכונית המסננתtridge על שייקר רוטרי.
  9. מניחים את שייקר רוטרי בחממה שחומם מראש ב 56 C ולהדליק את שייקר במהירות של 20 סל"ד במשך 20 דקות.
  10. במהלך הדגירה, להכין צינור 2.0 מ"ל חדש, תווית הצינור כראוי באמצעות עט ממס הוכחה ולמקם אותו צינור חרוטי 50 מ"ל.
    הערה: לשעבר (2.0 מ"ל) וצינורות האחרון (50 מ"ל) משמשים לאיסוף DNA המחולץ ועבור החזקת הצינור 2.0 מ"ל, בהתאמה.
  11. לאחר הדגירה, להסיר את הפקק והכנס את הכניסה (לא לשקע) יציאה של המחסנית לתוך צינור 2.0 מיליליטר בתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר. סגור את צינור חרוטי 50 מ"ל עם ראש מתברג.
  12. צנטריפוגה צינור חרוטי 50 מ"ל ב 5000 XG במשך 1 דקות כדי לאסוף את ה- DNA חילוץ מהמחסנית. הוצא את המחסנית המסננת ואת צינור 2.0 מיליליטר באמצעות מלקחיים מעוקרים מכסה את הצינור. מחק את מחסנית המסנן.

טיהור 6. של ה- DNA החילוץ

הערה: אנו elute עדנה עם 100 μl חיץ AE במקום 200 μl שצוין במדריך של הערכה המסחרית.

  1. הוסף 200 μl אתנול (96-100%) ל- DNA חילוץ בצינור 2.0 מ"ל מהשלב לעיל (בערך 440 μl), ומערבבים היטב על ידי vortexing.
  2. Pipet את התערובת לתוך עמוד ספין להציב צינור איסוף 2 מ"ל. צנטריפוגה ב 5000 XG דקות 1. מחק את הזרימה דרך צינור האיסוף.
  3. מניח את טור ספין צינור איסוף חדש 2 מיליליטר, ולהוסיף 500 μl חיץ AW1, צנטריפוגות דקות 1 ב 5000 x ז. מחק את הזרימה דרך צינור האיסוף.
  4. מניח את טור ספין צינור איסוף חדש 2 מיליליטר, להוסיף AW2 חיץ 500 μl, ו צנטריפוגות במשך 3 דקות ב 20,000 x ז. מחק את הזרימה דרך צינור האיסוף.
  5. הכין צינור 1.5 מיליליטר חדש (בתנאי שלא על ידי בערכה) ואת התווית הצינור כראוי באמצעות עט עמיד למים עבור ייבוש מהיר ולא מורח תיוג. מעבירים את t טור ספיןo הצינור 1.5 מ"ל.
  6. Elute את ה- DNA על ידי הוספת 100 חיץ μl AE למרכז הממברנה טור ספין. דגירה של 1 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן צנטריפוגות ב 6000 XG דקות 1.
  7. מחק את טור הספין מכסה את הצינור. אחסן את ה- DNA מטוהרים ב -20 ° C.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

מבחינה טכנית, קשה לבודד ולכמת עדנה דגים רק מן עדנה בתפזורת חילוץ, משום פריימרים MiFish coamplify באזור היעד מכמה חוליות שאינם דגים, כגון עופות ויונקים, עם מוצרי ה- PCR של באותו גודל (ca. 170 נ"ב 12). במקום לכימות דגי עדנה, אנו מבצעים MiFish metabarcoding ניתוח של עדנה מטנק האקווריום עם הרכב מינים באמצעות שתי שיטות שונות של סינון מיצוי DNA, ולהשוות את המספרים של מינים שזוהו במהלך ספרייה משני הפרוטוקולים. ניסוי פשוט זה נועד ל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

במחקרים רבים metabarcoding באמצעות דגימות סביבתיות כגון מים ואדמה, טיפול סינון לתפקיד מחסנית המסנן הוא בדרך כלל כדלקמן 24,25: 1) חיתוך פתוח או פיצוח דיור עם כלי יד (חותך צינורות או צבת); 2) הסרת המסנן מהמחסנית; ו -3) חיתוך המסנן לחתיכות קטנות עם סכין גילוח להפקת DNA. כדי להימנע מסורבל ונדרש זמן רב נהלים כאלה שמועדים זיהום במעבדה, ניסינו מספר שיטות DNA חילוץ בתוך הדיור של המחסנית המסננת באמצעות ערכה מסחרית בשימוש נרחב, לא יקרה, פתח בהצלחה בפרוטוקול הנוכחי עם נוחים מניתוח...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

מחקר זה נתמך כמחקר בסיסי על ידי CREST מסוכנות המדע והטכנולוגיה היפנית (JST) ועל ידי מענקים מ-JSPS/MEXT KAKENHI (מספר 26291083) וקרן Canon ל-M.M. למממנים לא היה תפקיד בתכנון המחקר, איסוף וניתוח נתונים, החלטה לפרסם או הכנת כתב היד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
לוח רשתIris OhyamaMPP-3060-BE
חוד מתכתIris OhyamaMR12F
מעמד ללוח הרשתאין מותג4184-9507זמין מאמזון יפן
שקית ניילון 1 ליטר עם מכסה בורגYanagiDP16-TN1000
מחבר נעילת לואר זכרISIS11620
קצה פיפטה 10 מ"לEppendorf0030 000.765
בקבוק ספר 10 ליטר עם שסתוםכאחד1-2169-01
מסנן Sterivex-HVMilliporeSVHVL10RCמסומן כ"מחסנית מסנן" בכל ה-ms ומשמש בפרוטוקול
התאמת לואר זכרכאחד1-7379-04
התאמת לואר נקבהכאחד5-1043-14   
כובע לואר כניסהISISVRMP6
שקע כובע לוארISISVRFP6
צינורות ואקום גבוהיםכמו אחד6-590-01
מחבר ואקוםכאחד6-663-02
פקק סיליקוןכאחד1-7650-07
סעפתכאחד2-258-01
אספירטור-GAS-1כאחד1-7483-21
DNeasy דם & ערכת רקמות (250)Qiagen69506
PowerWater Sterivex ערכת בידוד DNAMO BIO14600-50-NFמסומנת כ"ערכה אופציונלית" בצנטריפוגה
שולחניתms Kubotaדגם 4000מהירות מרבית 6,000 סל"ד
רוטור זווית קבועהמתאם KubotaAT-508C
לצינור חרוטי 15 מ"לKubota055-1280
פתרון ייצוב RNAlaterThermo Fisher ScientificAM7020
ParafilmPM992מסומן כ"סרט איטום עצמי"

מקורות

  1. Takahara, T., Minamoto, T., Doi, H. Using environmental DNA to estimate the distribution of an invasive fish species in ponds. PLoS ONE. 8, e56584(2013).
  2. Takahara, T., Minamoto, T., Yamanaka, H., Doi, H., Kawabata, Z. Estimation of fish biomass using environmental DNA. PLoS ONE. 7, e35868(2012).
  3. Sigsgaard, E. E., Carl, H., Møller, P. R., Thomsen, P. F. Monitoring the near-extinct European weather loach in Denmark based on environmental DNA from water samples. Biol. Conserv. 183, 48-52 (2015).
  4. Jerde, C. L., et al. Detection of Asian carp DNA as part of a Great Lakes basin-wide surveillance program. Can. J. Fish. Aquat. Sci. 70, 522-526 (2013).
  5. Jerde, C. L., Mahon, A. R., Chadderton, W. L., Lodge, D. M. "Sight-unseen" detection of rare aquatic species using environmental DNA. Conserv. Lett. 4, 150-157 (2011).
  6. Mahon, A. R., et al. Validation of eDNA surveillance sensitivity for detection of Asian carps in controlled and field experiments. PLoS ONE. 8, e58316(2013).
  7. Minamoto, T., Yamanaka, H., Takahara, T., Honjo, M. N., Kawabata, Z. Surveillance of fish species composition using environmental DNA. Limnology. 13, 193-197 (2012).
  8. Keskin, E. Detection of invasive freshwater fish species using environmental DNA survey. Biochem. Syst. Ecol. 56, 68-74 (2014).
  9. Wilcox, T. M., et al. Robust detection of rare species using environmental DNA: the importance of primer specificity. PLoS ONE. 8, e59520(2013).
  10. Thomsen, P. F., et al. Detection of a diverse marine fish fauna using environmental DNA from seawater samples. PLoS ONE. 7, e41732(2012).
  11. Kelly, R. P., et al. Harnessing DNA to improve environmental management. Science. 344, 1455-1456 (2014).
  12. Miya, M., et al. Mifish, a set of universal PCR primers for metabarcoding environmental DNA from fishes: detection of more than 230 subtropical marine species. Roy. Soc. Open Sci. 2, 150088(2015).
  13. Port, J. A., et al. Assessing vertebrate biodiversity in a kelp forest ecosystem using environmental DNA. Mol. Ecol. 25, 527-541 (2015).
  14. Yamamoto, S., et al. Environmental DNA provides a 'snapshot' of fish distribution: a case study of Japanese jack mackerel in Maizuru Bay, Sea of Japan. PLoS ONE. 11, e0149786(2016).
  15. Valentini, A., et al. Next generation monitoring of aquatic biodiversity using environmental DNA metabarcoding. Mol. Ecol. 25, 929-942 (2016).
  16. Rees, H. C., Maddison, B. C., Middleditch, D. J., Patmore, J. R., Gough, K. C. Review: The detection of aquatic animal species using environmental DNA - a review of eDNA as a survey tool in ecology. J. Appl. Ecol. 51, 1450-1459 (2014).
  17. Stewart, F. J. Microbial metagenomics, Metatranscriptomics, and metaprotenomics Vol. 531 Methods in Enzymology. DeLong, E. E. 10, Elsevier. Ch. 10 187-218 (2013).
  18. Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples. J Vis Exp. (28), e1161(2009).
  19. Smalla, K. Molecular Microbial Ecology Manual. Akkermans, D. L., Elsas, J. D., Bruijn, F. J. , Springer. 13-22 (1995).
  20. Thomsen, P. F., Willerslev, E. Environmental DNA - An emerging tool in conservation for monitoring past and present biodiversity. Biol. Conserv. 183, 4-18 (2014).
  21. Pedersen, M. W., et al. Ancient and modern environmental DNA. Phil. Trans. R. Soc. B. 370, 20130383(2015).
  22. Fukumoto, S., Ushimaru, A., Minamoto, T. A basin scale application of environmental DNA assessment for rare endemic species and closely related exotic species in rivers: a case study of giant salamanders in Japan. J. Appl. Ecol. 52, 358-365 (2015).
  23. Yamanaka, H., Minamoto, T. The use of environmental DNA of fishes as an efficient method of determining habitat connectivity. Ecol. Indicators. 62, 147-153 (2016).
  24. Moss, J. A., et al. Ciliated protists from the nepheloid layer and water column of sites affected by the Deepwater Horizon oil spill in the Northeastern Gulf of Mexico. Deep Sea Res. Pt I. 106, 85-96 (2015).
  25. Hilton, J. A., Satinsky, B. M., Doherty, M., Zielinski, B., Zehr, J. P. Metatranscriptomics of N2-fixing cyanobacteria in the Amazon River plume. The ISME journal. 9, 1557-1569 (2015).
  26. Deiner, K., Walser, J. -C., Mächler, E., Altermatt, F. Choice of capture and extraction methods affect detection of freshwater biodiversity from environmental DNA. Biol. Conserv. 183, 53-63 (2015).
  27. Eichmiller, J. J., Miller, L. M., Sorensen, P. W. Optimizing techniques to capture and extract environmental DNA for detection and quantification of fish. Mol. Ecol. Res. 16, 56-68 (2016).
  28. Lemarchand, K., Pollet, T., Lessard, V., Badri, M. A. Sample Preparation Techniques for Soil, Plant, and Animal Samples'Springer Protocols Handbooks. Micic, M. , Springer. 325-339 (2016).
  29. Turner, C. R., et al. Particle size distribution and optimal capture of aqueous macrobial eDNA. Methods Ecol. Evol. 5, 676-684 (2014).
  30. Barnes, M. A., Turner, C. R. The ecology of environmental DNA and implications for conservation genetics. Conserv. Genet. 17, 1-17 (2016).
  31. Sorokulova, I., Olsen, E., Vodyanoy, V. Biopolymers for sample collection, protection, and preservation. Appl. Microbiol. Biotechnol. 99, 5397-5406 (2015).
  32. Renshaw, M. A., Olds, B. P., Jerde, C. L., McVeigh, M. M., Lodge, D. M. The room temperature preservation of filtered environmental DNA samples and assimilation into a Phenol-Chloroform-Isoamyl alcohol DNA extraction. Mol. Ecol. Res. 2014, (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

DNALuer

מאמרים קשורים