מאמר שיטה

שיטה יעילה עבור הסינתזה של Peptoids עם מעורב ליזין מסוג / ארגינין-סוג מונומרים וערכה של אנטי-leishmanial פעילותם

DOI:

10.3791/54750

⸱

2 בנובמבר 2016

 ,  , 
1Department of Chemistry, Durham University, 2School of Medicine, Pharmacy and Health, Durham University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מוצג פרוטוקול לסינתזה של פפטואידים בעלי פונקציונליות קטיונית מעורבת באותו רצף (מונומרים מסוג ליזין וארגינין). מתוארת גם בדיקה עוקבת של תרכובות אלה נגד Leishmania mexicana, הטפילים הפרוטוזואיים הגורמים ללישמניאזיס עורית.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר את הסינתזה הידנית של פאזה מוצקה של פפטואידים ליניאריים המכילים שני מונומרים קטיוניים בעלי תפקוד שונה. בהליך זה ניתן לכלול מונומרים פפטואידים 'ליזין' פונקציונליים אמינו ופונקציונליים של גואנידו 'ארגינין' באותו רצף פפטואידי. הליך זה משתמש בהגנה על שרף (N-(1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohexylidene)ethyl) או Dde, תנאים אורתוגונליים להגנת Boc של מונומרים ליזין. ביטול ההגנה שלאחר מכן מאפשר תגובת גואנידינילציה יעילה על שרף ליצור את שאריות הארגינין. ההליך תואם את שיטת הסוב-מונומר הנפוצה לסינתזה פפטואידית, המאפשרת לייצר פפטואידים פשוטים באמצעות ציוד מעבדה נפוץ וריאגנטים זמינים מסחרית. מתוארת הסינתזה, הטיהור והאפיון המייצגים של שני פפטואידים מעורבים. מתוארת גם הערכת תרכובות אלו כנוגדי זיהום פוטנציאליים במבחני סקר נגד לישמניה. הטפיל הפרוטוזואי L. mexicana הוא גורם סיבתי ללישמניאזיס עורית, מחלה טרופית מוזנחת הפוגעת בעד 12 מיליון אנשים ברחבי העולם.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Peptoids (או פולי N -substituted glycines) הם קבוצה של-mimetics פפטיד המציעים תכונות דומות לאלו של פפטידים וככזה נחקרות יותר ויותר עבור יישומים רפואיים וחומרים. בשנת פפטידים, שרשרת הצד של כל חומצת אמינו מחוברת פחמן-α של עמוד השדרה האמידה; ב peptoids הרשתות בצד מוזזים על אטום החנקן של עמוד השדרה. באופן מכריע, זה נותן peptoids עמידות גבוהה יותר בפני proteolysis.

Peptoids מסונתז נפוץ בשיטת submonomer חלוץ ידי צוקרמן et al., שם מונומרים peptoid יכולים להיבנות על ידי haloacetylation הרציף של פונקציונליות אמינה צורף תמיכה מוצקה והעקירה הבאה של ההלוגן באמצעות אמין עיקרי. 1 הקבוצה שלנו פתחה לאחרונה הסתגלות לשיטה submonomer זו כדי לאפשר שאריות peptoid lysine- ו ארגינין-סוג להיכלל בתוך אותו רצף peptoid עבור first זמן. 2 גישה זו מוצק שלב ידנית peptoid סינתזה משתמשת ריאגנטים זמינים מסחרי וציוד מעבדה משותף, מה שהופך אותו לנגיש עבור רוב המעבדות. Peptoids הוכח צריך פעילויות מבטיחות נגד מגוון רחב של חיידקים גראם שליליים, מיני חיידקים ופטריות חיוביים גראם כי הם דומה פפטידים מיקרוביאלית ידועים רבים. 3-9

בעבודתנו, peptoids שמש תרכובות אנטי זיהומיות חדשות לטיפול של leishmaniasis המחלה הטרופי המוזנחת. Leishmaniasis 5,10 שכיח יותר מ -80 מדינות ברחבי העולם, ההערכה היא כי למעלה מ -12 מיליון בני אדם נדבקים באופן גלובלי. 11 המחלה נגרמת על ידי טפילים protozoan המועברות על ידי נשיכה של sandfly. מינים שושנת יריחו יכול לגרום leishmaniasis עורית, תנאי המוביל הצטלקות ופגיעה ריריות, או לנו זרים הקרביים מסכני חייםhmaniasis, הגורם לניזק איבר קטלני. אין חיסון זמין כעת למחלה זו וטיפולים קיימים להסתמך על מספר קטן של תרופות שיש להן תופעות לוואי חמורות. בנוסף, התנגדות לתרופות קיימות היא בעיה מתעוררת ורציני טיפולים חדשים כל כך זקוק נואשים לטיפול leishmaniasis ביעילות בעתיד. 12-16

ביישומים מיקרוביאלית אלה, peptoids נועדו לעתים קרובות להיות amphipathic בתערובת של קטיוני מונומרים הידרופובי. 3,4 זה יכול לתת peptoids מידה מסוימת של סלקטיביות לכיוון תאים חיידקיים, להפחית רעילות לתאי יונקים, וכדי לשפר את פעילותם מובילי מולקולרית . 17-20 רוב peptoids אנטי זיהומיות בספרות מכילות שרשרות צד קטיוני כי מורכבות בלעדיות של מונומרים מהסוג ליזין או פונקציונלי אמינו או שאריות מסוג ארגינין. מפלצות פפטיד-peptoid, שבו הרשתות קטיוני מורכבות אליזין או ארגינין חומצות מינו, גם היה מסונתז כדי לבחון את השפעת קבוצות קטיוני על פעילות ורעילות. 21-25

ניתן peptoids פולי-ליזין מסונתז בקלות באמצעות אמינים בוק מוגן זמינים מסחרית. Peptoids פולי-ארגינין דיווח יכול להתבצע באמצעות שיטה המשתמשת pyrazole-1-carboxamidine כסוכן guanidinylation. 18 עם זאת, זה יכול להתבצע רק לאחר peptoid כבר בקע מן השרף והגנת בוק על רשתות בצד סיר, כך כל שאריות ליזין מסוג בתוך הרצף הופכות שאריות ארגינין. במאמץ כדי לכוונן את מאפייני כימי וביולוגי של תרכובות, פיתחנו שיטה המאפשרת פונקציונליות קטיוני כפול (למשל, N ליס ו- N Arg) להיכלל בכל סדרה נתונה peptoid בפעם הראשונה. 2

בזאת, אנו מתארים את הסינתזה, טיהור ואפיון של two peptoids הרומן שמכילים הן שאריות lysine- ו ארגינין-סוג באותו רצף. השיטה משתמשת מאונך N -Boc ו- N -Dde הגנה על שרף עם pyrazole-1-carboxamidine בתור מגיב guanidinylation. ההערכה הביולוגית של peptoids אלה מתוארת גם מבחני cytotoxicity נגד שושנת יריחו מקסיקנה, הגורם הסיבתי של leishmaniasis עורית. זה מספק שיטה מעשית לגשת peptoids עם פונקציונליות קטיוני כפולה ועל מנת להעריך את פעילותם הביולוגית. צפוי כי שיטה זו תסייע לסינתזה של peptoids amphipathic ידי הקהילה peptoid בעתיד.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סינתזה מוצק שלב 1. Peptoids

הערה: Peptoids מסונתז באופן ידני באמצעות הליך submonomer של סינתזת peptoid מוצק שלב. שיטה זו מאפשרת יעילת צימוד גבוה ותשואות מוצר סופיות טובות. סינתזה על-שלב מוצק גם מאפשרת מגיבים עודפים להסירו בקלות בסוף כל שלב ואת השיטה שונתה כאן כדי לאפשר מונומרים קטיוני פונקציונליים שונים (כלומר, ארגינין-סוג שאריות ליזין-סוג) להיכלל בתוך אותו רצף. 1,2

  1. סינתזה של peptoid ליניארי
    זהירות: ביצוע ערכות בטיחות לפני שמתחיל סינתזה. לבצע את כל התגובות במנדף וללבוש ציוד מגן אישי נאות כנדרשים (כפפות ניטריל כלומר, חד פעמיות, משקפי מגן וחלוק מעבדה). תשמרי על עצמך במיוחד כאשר באמצעות ריאגנטים ממיסים הבאים. Dimethylformamide (DMF) היא teratogen שחשודים דichloromethane (DCM) הוא קרצינוגן. N, -diisopropylcarbodiimide 'N (DIC) piperidine הם מסוכנים קשה בעיניים, בעור, באמצעות שאיפה הנשימה ועלול לגרום לרגישות בעור. הידרזין הוא קרצינוגן חשד, קטלני אם נשאף וגורם כוויות חמורות בעור או בעיניים. חומצת Bromoacetic גם מסוכן לעור, לעיניים ואת דרכי הנשימה ועלולה לגרום לכוויות במגע. חומצת trifluoroacetic (TFA) היא נוזל נדיף והוא יכול לגרום לכוויות חמורות כל כך להישמר מהם. כפפות עמוסות כבדות מומלצות.
    1. להוסיף 0.12 גרם מוגן Fmoc שרף רינק האמיד (0.1 מילימול, טעינה טיפוסית 0.7 מילימול / g) לכלי תגובת פוליפרופילן 20 מיליליטר כתרים עם שני פריץ. הוסף 5 מ"ל dimethylformamide (DMF) להתנפח שרף ולהשאיר את כלי לעמוד במשך 60 דקות לפחות בטמפרטורת החדר. מסנן את DMF באמצעות פלטפורמת ואקום מיצוי מוצק שלב.
    2. כדי deprotect קבוצת Fmoc על השרף הנפוח, להוסיף 2 מיליליטר פתרון piperidine (20% ב נ DMF / v). מניח את הכלי עלפלטפורמה שייקר בטמפרטורת החדר (450 סל"ד) ולנער במשך 5 דקות. הסר את הפתרון באמצעות תחנת ואקום.
      1. חזור Fmoc deprotection עם פתרון 2 מ"ל piperidine ולנער במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. מסננים את הפתרון כמו קודם.
    3. שטוף את השרף על ידי הוספת DMF 2 מיליליטר והערבוב שרף במשך 30 שניות. מסננים את DMF וחזור עוד שלוש פעמים.
    4. עבור acetylation, להוסיף 1 מ"ל של תמיסת חומצה bromoacetic (0.6 M ב DMF) ו -0.2 מ"ל N, פתרון -diisopropylcarbodiimide 'N (DIC, 50% ב DMF V / V). השאירו כלי התגובה לרעוד במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. מסננים את הפתרון ולשטוף את שרף עם 2 מ"ל פעמים DMF שלוש.
    5. עבור העקירה, להוסיף 1 מיליליטר של תמיסה אמינה (1.5 M ב DMF). לנער את שרף במשך 60 דקות בטמפרטורת החדר. מסננים את הפתרון ולשטוף את שרף עם 2 מ"ל פעמים DMF שלוש.
      1. כדי להוסיף מונומר ארגינין-סוג, בצע צעד 1.7. בהתאם רצף peptoid הרצוי, אמינים שוניםיתווסף.
    6. חזור על שלבים 1.1.4 ו 1.1.5.
    7. כדי לכלול מונומר פונקציונלי guanidine (כלומר, N Arg), להוסיף 1 מיליליטר של תמיסת diamine לא מוגנת (1.5 M ב DMF) שרף ולנער במשך 60 דקות בטמפרטורת חדר.
      1. מסננים את הפתרון ולשטוף את שרף עם 2 מ"ל פעמים DMF שלוש.
      2. מוסיפים 2-acetyldimedone (0.2 גרם, 1 מילימול 0.5 מ"ל DMF, 10 ושווי) כדי להוסיף את הקבוצה DDE אל אמין ראשוני חינם ולנער במשך 60 דקות בטמפרטורת החדר. מסננים את הפתרון ולשטוף את שרף עם 2 מ"ל פעמים DMF שלוש.
    8. המשך סינתזת submonomer כמו 1.1.4 כדי 1.1.7 עד שיסתיים התהליך הרצוי הוא עשה. הוסף 2 מ"ל DMF לשטוף את שרף וחזור שלוש פעמים.
    9. כדי deprotect הקבוצה DDE על שרף, להוסיף 4 מ"ל 2% פתרון הידרזין (נ DMF / v) ולנער עבור 3 דקות בטמפרטורת החדר. מסנן את הפתרון וחזור שלוש פעמים.
    10. מסננים את הפתרון ולשטוף את שרף עם 2 מ"ל DMF שלושה tIMEs.
    11. התוספת carboxamidine pyrazole-1 (6 ושווי לכל אמין בחינם, כלומר, לכל מונומרים N Arg, בהיקף מינימלי של DMF) ו- N, N -diisopropylethylamine או DIPEA (6 ושווי לכל אמין בחינם) ולנער בטמפרטורת החדר למשך 60 דקות .
    12. מסננים את הפתרון ולשטוף את שרף עם 2 מ"ל dichloromethane שלוש פעמים. השאר את השרף לייבוש באוויר במשך 10 דקות ולאחר מכן השרף ניתן לאחסן עד מחשוף (סעיף 2).
    13. כדי להשהות את הסינתזה, לשטוף את שרף עם 2 מ"ל DMF שלוש פעמים. הוסף 2 מ"ל DMF, פקק הספינה סינתזה ומשאירים בטמפרטורת החדר במנדף.
      הערה: הסינתזה עלולה להיות מושהה לאחר כל צעד עקירה (למעט צעד העקירה השני diketopiperazines עלול להיוצר).
  2. Deprotection מחשוף Side-שרשרת משרף
    1. לבצע תדבק מבחן כדי לבדוק את ההתקדמות של סינתזה (טוהר ומסה) בכל נקודה במהלך הסינתזה לאחר displaמדרגות הבטון, להוספה או הסרה של DDE המגן קבוצה או לאחר רצף הסופי נעשה.
      1. העבר כ 10 חרוזים שרפו מספינת התגובה לתוך מחסנית fritted 8 מיליליטר הפוליפרופילן חדשה.
      2. הוסף 1 מ"ל של קוקטייל מחשוף חומצה trifluoroacetic (המכיל 95% TFA, 2.5% H 2 O, 2.5% triisopropylsilane) ולנער במשך 90 דקות בטמפרטורת החדר.
      3. סנן את קוקטייל מחשוף TFA מן השרף באמצעות כלי תגובת fritted לפתוח בסבב 10 מיליליטר התחתי בקבוק.
      4. לאדות את קוקטייל מחשוף באמצעות המאייד רוטרי redissolve הנפט וכתוצאה מכך 1 מ"ל אצטוניטריל / מים להגשה LC-MS או HPLC אנליטי.
    2. עבור מחשוף הסופי: במחסנית אותו פוליפרופילן fritted התגובה המשמש לסינתזה, להוסיף 4 מ"ל של קוקטייל מחשוף TFA (95% TFA, 2.5% H 2 O, 2.5% triisopropylsilane) ולכסות את כלי השיט. Shake למשך 90 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. ה מסנןקוקטייל מחשוף דואר TFA מן השרף באמצעות כלי תגובת fritted לפתוח בסבב 50 מיליליטר התחתי בקבוק.
    4. לאדות את הקוקטייל מחשוף באמצעות מאייד רוטרי. לאחר TFA הוסר, המוצר להמחשה בלבד יש לקבל כקובץ שמן. כדי לסייע להסרת TFA מנפט גולמי זה, להוסיף אתר 2 מ"ל נטול מים diethyl ואת peptoid צריך לזרז.
      1. הסר את אתר diethyl באמצעות פיפטה וזורק או להתאדות באמצעות מאייד רוטרי. ממטרי אתר diethyl חוזרים שלוש פעמים.
    5. ממיסים את peptoid גולמי ב 10 מ"ל תמיסת מים אצטוניטריל / acidified (50% אצטוניטריל, 0.1% TFA נ מים / v). העברה למיכל טרום שקל, ולהקפיא ב -20 ° C ו Lyophilize כדי אבקה יבשה.

אפיון טיהור 2.

הערה: הסינתזה peptoid ניתן לנטר ואת peptoid הסופי כפי שהוערך HPLC הפוכה פאזיים אנליטיים באמצעות טור C18 ואלectrospray ספקטרומטריית מסה נוזלי כרומטוגרפיה (LC-MS). כל ממסי HPLC של ממסים עבור LC-MS צריכים להיות מוכנים טרי.

  1. HPLC אנליטי
    1. לשקול 1 מ"ג של peptoid בבקבוקון זכוכית קטן. מוסיפים את נפח מינימלי של אצטוניטריל לפזר לדלל עד 1 מ"ל מים. ודא כי peptoid נמס לגמרי.
    2. להזריק 10 μl כדי HPLC אנליטיות (הציע שיפוע 0 - 100% ב ממס למעלה מ -30 דקות, שבו ממס A = 95% מים, 5 אצטוניטריל%, 0.05% TFA ממס B = 95% אצטוניטריל, 5% מים, 0.03% TFA) , לפי הוראות היצרן.
    3. דמיינו ספקטרום UV ב 220 ננומטר.
  2. ESI LC-MS
    1. הפוך 1 מ"ג / פתרון peptoid מ"ל כמו בשלב 2.1.1.
    2. להזריק 1 μl כדי electrospray LC-MS כדי לקבוע אם המשקל המולקולרי של peptoid היעד הוא ההווה, באמצעות הוראות היצרן.
    3. בדוק את המוני היעד של רצף peptoid באמצעות peptמחשבון OID, לפי הוראות על המחשבון. 26 כלי אינטרנט זה גם מאפשר ההקצאה של כל מוצרים מחיקים / בנוסף לראות בספקטרום ההמוני. 26
  3. HPLC שלב ההפוך preparative
    1. ממיסים peptoids גולמי לתוך 2 מ"ל acidified מים / אצטוניטריל (מים 95%, 5% MeCN, 0.1% TFA) ולטהר באמצעות פרוטוקול של היצרן-HPLC RP preparative. לקבוע את השיפוע עד elution המתקבל HPLC אנליטיים בסך המוזרק יהיה תלויות ממדי העמודה.
    2. דמיינו באמצעות גלאי להגדיר ב 220 ננומטר.
    3. אסוף שברים ב 15 מ"ל צינורות צנטריפוגה, ולהקפיא ב -20 ° C ו Lyophilize.
    4. Re-לנתח שברים באמצעות LC-MS ו- HPLC אנליטיות על פי פרוטוקול של היצרן. ולשלב מחדש שברים מטוהרים.

3. בדיקה ביולוגית נגד שושנת יריחו מקסיקנה טפילה

Caution:. הערכות בטיחות חייבות להתבצע לפני תחילת סינתזת מקסיקנה שושנת יריחו מסווגת פתוגן מפגע קבוצת 2 בבריטניה אמצעי בקרה נאותה חייבים להיות במקום לפני תחילת בדיקה. כל העבודה צריכה להתבצע בתוך ארון בטיחות מיקרוביולוגית בכיתה 2 וציוד מגן אישי נאות משוחק על פי צורך (כלומר, כפפות ניטריל, משקפי מגן וחלוק מעבדה).

  1. תת של טפילים
    1. הפשר 1 מיליליטר -150 ° C מניות קפואות שושנת יריחו מקסיקנה M379 על ידי צבת בקבוקון בתוך אמבט מים 37 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות.
    2. מעבירים את הפתרון המניות 10 מ"ל בינוני חרקים שניידר (ב- pH 7.0 בתוספת 15% בסרום עוברי חום מומת שור ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין) בבקבוק תרבות 25 ס"מ 3 תאים עם כובע לא מאוורר.
    3. לדגור על 26 מעלות צלזיוס למשך 72 שעות.
    4. בדוק טפילים תחת מיקרוסקופ (הגדלה 400X) כדי לבדוק את מצב. thEY צריך להיות promastigotes הבמה חרקים, צורות procyclic בשלב יומן עם תאי מתחלקים רבים.
    5. לשמור promastigotes procyclic ידי טפילים תת-culturing לריכוז של 5 x 10 5 טפילים / מ"ל כל שלושה ימים. ספירת תאים באמצעות hemocytometer נויבאואר משופר.
  2. טרנספורמציה של L. מקסיקנה במת חרקים לצורת amastigote axenic בשלב היונק 27
    1. יום 0: כן 10 מיליליטר התרבות של טפילים בשלב היומן ב 5 x 10 5 טפילים / מיליליטר במדיום חרקי שניידר (ב- pH 7.0 בתוספת 15% חום מומת בסרום שור עוברי 1% פניצילין / סטרפטומיצין) בתא 25 סנטימטר 3 בקבוק תרבות עם כובע לא מאוורר.
    2. לדגור על 26 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.
    3. יום 3: תרבות מ"ל העברת 10 לצינור צנטריפוגות 50 מ"ל ו צנטריפוגות ב 447 XG במשך 5 דקות.
    4. יוצקים את המדיום הישן ולהוסיף 10 מ"ל בינוני חרקים שניידר (ב- pH 5.5 בתוספת 20% hלאכול מומת בסרום שור עוברי 1% פניצילין / סטרפטומיצין). בעדינות resuspend הגלולה של טפילים במדיום החדש בעזרת פיפטה.
    5. ספירת טפילים באמצעות hemocytometer נויבאואר משופר. לדלל את ריכוז של 5 x 10 5 טפילים / מ"ל עם מדיום pH 5.5 והעברה בקבוק תרבות 25 ס"מ 3 תאים.
    6. לדגור על 26 מעלות צלזיוס למשך כ 6 ימים.
    7. יום 9: בדוק טפילים במיקרוסקופ (400X). הם צריכים להיות משכפלות עישון, בשלב promastigote metacyclic זיהומיות.
    8. ספירת טפילים באמצעות hemocytometer נויבאואר משופר. לדלל את ריכוז של 5 x 10 5 טפילים / מ"ל עם מדיום pH 5.5.
    9. הסר 10 מ"ל של תרבית תאים ולהעביר בקבוק תרבית תאים. לדגור על 32 מעלות צלזיוס למשך 5 ימים.
    10. יום 14: הגעת מראה של טפילים מתחת למיקרוסקופ (400X). הם צריכים להיות בשלב amastigote פתוגניים, חסר אופי השוטוןistic של promastigotes, ומוכן assay.
  3. Assay Cytotoxicity על L. מקסיקנה amastigotes axenic.
    הערה: הבדיקות הביולוגיות של peptoids משתמשת מבחני תפוקה גבוהה בצעו ב 96 צלחות היטב. פרוטוקול זה מתאר את הבדיקות של L. מקסיקנה axenic amastigotes, אבל מבחנים זהים יכול גם להתבצע על טפילי promastigote במת המדיה מתאימה. תרכובות מודגרת עם טפילים על ריכוזים מ 3 - 100 מיקרומטר במשך 60 דקות ולאחר מכן וטופחו במשך 24 שעות לאחר דילול של פי 10. תוצאות הם זכו על ידי מדידת הקרינה של בארות לאחר דגירה עם פתרון כדאי תא מבוסס Resazurin (למשל, alamarBlue).
    1. הכן פתרונות מניות מתחמים. תשקול 1 מ"ג של מוצר peptoid המטוהרים הסופי באמצעות איזון אנליטיים. להוסיף הנפח המתאים של dimethylsulphoxide כיתת ביולוגיה מולקולרית (DMSO) לריכוז של 5 מ"מ. הפוך 6 aliquots μl ולהקפיא ב -20 ° C.
    2. הכן פתרונות המתחם על 96 צלחות היטב (פריסת צלחת מומלצת שניתן לראות בקטע התוצאות, איור 6) בשלושה עותקים מן 100 כדי 3 מיקרומטר. הוסף 2 μl של פתרון מניות 5 מ"מ של כל מתחם בשורה העליונה (כלומר, א). להוסיף 48 μl טרי בינוני חרקים שניידר (ב- pH 5.5 ו -20% בסרום שור העובר (FBS), 1% פניצילין / סטרפטומיצין (P / S)) כדי בשורה העליונה בעזרת פיפטה רב ערוצי. הוסף 25 μl בינוני חרקי שניידר על כל השורות האחרות (B - F).
      1. לבצע דילול סדר על ידי פתרון μl pipetting 25 מהשורה העליונה. הוסף בשורה מתחת ומערבבים. לבצע דילולים עד השורה האחרונה, בהם הפתרון 25 μl האחרון אמור להיות מושלך.
      2. השתמש B amphotericin (5 מניות מ"מ) כביקורת חיובית ו DMSO (פתרון 2%) כביקורת שלילית בשלושה עותקים.
    3. הכן פתרון טפיל: העברת התרבות לצינור צנטריפוגות 50 מ"ל ו צנטריפוגות ב447 XG במשך 5 דקות. יוצקים את המדיום הישן ולהוסיף 10 מ"ל בינוני חרקים שניידר (5.5 pH ו -20% FBS, 1% P / S).
    4. בעדינות לפזר את הגלולה של טפילים במדיום החדש בעזרת פיפטה ולספור באמצעות hemocytometer משופרת נויבאואר. לדלל תרבות עד 8 x 10 6 טפילים / מ"ל.
    5. הוסף 25 μl L. מקסיקנה תרבות היטב כל אחד. דגירת צלחות עבור 60 דקות ב 32 מעלות צלזיוס.
    6. הסר את הצלחת מן החממה ולהסיר פתרון 40 μl מכל טוב.
    7. להוסיף 90 μl בינוני טרי דגירה במשך 24 שעות ב 32 מעלות צלזיוס.
    8. הוסף 10 μl Resazurin מבוסס פתרון תא כדאי היטב כל אחד. דגירה של 4 שעות ב 32 מעלות צלזיוס.
    9. למדוד את הקרינה באמצעות קורא צלחת (= לשעבר λ 540 ננומטר, λ em = 600 ננומטר), לפי הוראות היצרן. ניתוח נתונים על ידי הסרת רקע ממוצע (ממדיום רק בארות) ומשווה את הקרינה של בארות לאחר נורמליזציה ביחס ל- tהוא DMSO שולט.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כתוצאה מכך נציג, סינתזה ואפיון של שני 12 peptoids שאריות המכיל שני מונומרים מסוג ליזין מונומרים סוג שני-ארגינין כל יתוארו. התוצאות הבאות מן assay cytotoxicity מוצגות גם.

שני peptoids [(N nArg N SPE N SPE) (N AE N SPE N SPE)] 2 (א) ו- [(N hArg N SPE N SPE) (SPE N SPE N ליס N)] 2 (ב) היו מסונתז באמצעות 120 מ"ג רינק אמיד שרף כל (טעינה = 0.79 מילימול / g). כל הצעדים acetylation ועקירה בוצעו כמתואר לעיל, עם כל ריאגנטים לרכוש מסחרית. שאריות אלה, אמינים הבאים שימשו בשלב עקירה: N SPE (S) - (-) - α-methylbenzylamine, N AE N - (-butoxycarbonyl טרט) -1,2-קוטרinoethane, N ליס N - (-butoxycarbonyl טרט) -1,4-diaminobutane. עבור השאריות הנגזרות ארגינין, את diamines המוגן הבא היו מצמיד: N hArg 1,4-diaminobutane או N nArg 1,2-diaminoethane, ואחריו הגנה על-שרפתי עם 2-acetyldimedone (DDE-OH). לאחר רצף כולה כבר מסונתז, הידרזין deprotection של DDE מניב אמינים חופשי guanidinylate.

figure-results-1
איור 1. מבנים Peptoid (א) [(N nArg N SPE N SPE) (N AE N SPE N SPE)] 2 ו (ב) [(N hArg N SPE N SPE) (N ng> SPE ליס N SPE N)] 2. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-2
איור 2. השיטה לסנתז peptoids ארגינין / ליזין המעורב. אני. צעד עקירה רגיל בשיטת submonomer עם diamine; ii. תוספת של DDE-OH, 90 דקות להגן אמין בחינם; iii. תוספות בהמשך להאריך את שרשרת peptoid בשיטת submonomer; iv. Deprotection של DDE באמצעות הידרזין 2% ב DMF; . נ Guanidinylation של אמין בחינם על שרף עם pyrazole-1-carboxamidine ו DIPEA ב DMF; vi. מחשוף חומצי מן השרף deprotection של קבוצות בוק.large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

בעקבות מחשוף מן השרף lyophilization, המוצרים הגולמיים התקבלו אבקות לבנות: (א) 154 מ"ג, (ב) 163 מ"ג. מוצרים היו מטוהרים באמצעות RP-HPLC כמתואר עם 50 מקסימום זריקות מ"ג באמצעות משאבת LC עם גלאי UV-VIS (λ = 250 ננומטר) על טור אנליטית, 250 מ"מ x 10 מ"מ, 5 מיקרומטר; קצב הזרימה = 2 מ"ל / דקה. שברים המתאימים למסת היעד אוחדו וקבלו כמו אבקות לבנות: (א) 54 מ"ג (ב) 65 מ"ג, תשואות סופיות של כ 30% לשברים> 90% טהורים.

זהויות התרכובת הסופיות לאחר הטיהור אושרו על ידי LC-MS (ראה איור 3) באמצעות ספקטרומטר מסת quadrupole משולש מצויד UPLC וגלאי photodiode מערך. ספקטרומטריית מסה מדויקת התבצעה באמצעות אותו ספקטרומטר על t הוא [M + 2H] 2 + יונים. המשפט שלהלן מחושב והמוני נצפה נמצאו הסכם קרוב (איור 4): (א) מחושבים = 896.0026 האמו, ציינו = 896.0038 האמו; (ב) מחושב = 952.0691 האמו, ציין = 952.0730 האמו.

figure-results-3
איור 3. LC-MS עבור peptoids מטוהרים. (א) m / z = 1,792 ו- (ב) m / z = 1,903. איפה החלק העליון הוא TIC, ספקטרום LC-MS באמצע, הכרומתוגרמה UV התחתון ב 220 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-4
איור 4. נתונים ספקטרומטריית מסה מדויק עבור peptoids (א) ו- (ב)."Https://www.jove.com/files/ftp_upload/54750/54750fig4large.jpg" target = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

טוהר מוצרים הוערכה באמצעות (משאבת LC עם גלאי UV-VIS על טור אנליטית, 4.6 מ"מ x 100 מ"מ, 3.5 מיקרומטר; קצב הזרימה = 1 מ"ל / דקה) אנליטי RP-HPLC, ו דמיינו ב 220 ננומטר, ספיגת עמוד השדרה של אמיד. איור 5 א ו 5 ב מראה כי תרכובות הם הומוגניים.

figure-results-5
איור 5. HPLC אנליטי עבור peptoids המטוהר (א) ו- (ב). ישנו B 0-100% שיפוע מעל 30 דקות, בתנור טור ב 40 ° C (A = 95% H 2 O, 5% MeCN, 0.05 TFA%;. B = 95% MeCN, 5% H 2 O, 0.03% TFA) אנא CLאיכס כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Peptoids המטוהר (א) ו- (ב) נבדק מבחני cytotoxicity נגד L. מקסיקנה amastigotes axenic. מניות קפוא של L. מקסיקנה היו מופשרת והפכה לבמת amastigote המוכנה עבור assay. 72 שעות לאחר ההפשרה, הטפילים צריכים להיות promastigotes הבמה חרקים בצורתם procyclic, בשלב יומן עם תאי מתחלקים רבים. בשלב זה טפילים ניתן להפוך בשלב amastigote באמצעות שינוי pH וטמפרטורה תיאר. 27 ביום 9 של טרנספורמציה, הטפילים יהיה בשלב promastigote metacyclic זיהומיות שאינם משכפלים. לבסוף ב יום 14, הטפילים צריכים להיות בשלב amastigote פתוגניים שבו טפילים חסרי שוטונים המאפיין של promastigotes. 28

5 פתרונות מניות מ"מ של תרכובות נעשו בכיתה תרבית תאים DMSO ונבדקו triplicates עלמינימום של שני מקרים על מנת להבטיח מערך נתונים חזק נאסף. תוכנית צלחת 96-היטב נציג מוצג באיור 6. בסוף assay, מגיב כדאיות התא התווסף היטב כל הקרינה נמדדה כמתואר לחשב את הכדאיות של טפילים בכל ריכוז נבדק (ראה איור 7 ). ערכים 50 ED חושבו peptoid (א)> 100 מיקרומטר ו peptoid (ב) 37 מיקרומטר בהתאמה. ברי השגיאה זממו, להראות את השונות בין בארות כמו סטיית תקן וזה ניתן לראות כי אלה הם סבירים עבור רוב והברים.

figure-results-6
איור 6. תוכנית צלחת גם נציג 96 עבור assay cytotoxicity על 2 פתרונות peptoid (כולל בקרות חיוביות ושליליות). Med + = בינוני (Medium חרקים שניידר, pH 5.5, 20% FBS, 1% P / S). ל MEX. =8 x 10 6 / מ"ל התרבות הטפיל + med. AmphoB = 5 מ"מ ב DMSO. Peptoid = 5 מ"מ מניות פתרון ב DMSO. בארות ריקות אמורות להכיל מים סטריליים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-7
איור 7. תוצאות assay cytotoxicity נגד L. טפילי amastigote axenic מקסיקנה באמצעות peptoid (א) ו- (ב). ניתן לראות כי peptoid (ב) הוא יעיל יותר מאשר peptoid (א) לצמצם את אחוז טפילי קיימא, עם שני תרכובות שפעה תלויה במינון. ברי השגיאה זממו להראות את השונות בין בארות כמו סטיית תקן. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Peptoids ויותר הנלמד בתוך וביולוגיה כימית ושדות כימיה רפואית ביישומים כגון הרפוי הרומן 3-5, סוכני משלוח תא 18,20 וכלי אבחון. 29 בדרך כלל, רצפים אלה הם קטיוני לספק מידה של הסלקטיביות עבור הפתוגן מעל בתאי יונקים, היכולת לחדור דרך קרומי התא, וכן לסייע מסיסות במערכות מימיות. ישנן דוגמאות רבות של peptoids קטיוני המכילים אך ורק lysine- או ארגינין-מימטיים שאריות בספרות. עם זאת, עד כה, את הסינתזה של peptoids המכילה את כל שאריות קטיוני אלה באותו הרצף התעכבה בשל חוסר הליך סינטטי מתאים. הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר peptoids קטיוני מעורב להיות מסונתז באופן יעיל רצוי מאוד כפי שהוא מציע מסלול לווסת את התכונות ביולוגיות וכימיות של peptoids amphipathic.

NT "> השיטה שלנו משתמשת עיבוד לסינתזה הנפוצה submonomer peptoid ומתירה תוספת של שני מונומרים lysine- ו ארגינין מסוג בתוך אותו הרצף. היא משתמשת זיווגים בטמפרטורת החדר והקים הגנת כימית קבוצה כך הוא צפוי כי שיטה זו יהיה שימושי עבור רוב קבוצות מחקר. כדי להוסיף שכבת הגנה מאונכת עבור שאריות ארגינין-הסוג, גידול diamine מוגן מתווסף בתנאי עקירה סטנדרטיים ולאחר מכן מוגן צימוד 60 דקות עם DDE-OH. מגוון diamines יכול להיות השתמש המאפשר שרשרות צד מן 2 פחמנים עד 6 פחמנים ארוכים כדי להיות מותקנים, כלומר, 1,2-diaminoethane אל diaminohexane 1,6 בהתאמה. להמסה גם DDE-OH ההגנה ב DMF ו היא קבוצת הגנה יעילה מאוד סלקטיבית אמינים ראשוניים. הקבוצה-גינת DDE משאיר אמינות שניוני מעושה, למשל, התחנה הסופית N המוגן של שרשרת peptoid. 30 מגבלה אחת היא שכל synהתזה נערכה באופן ידני; עם זאת, הוא צפוי כי תנאי הצימוד פתחו את השיטה נוחה לשימוש עם פפטיד אוטומטי / סינתיסייזרים peptoid.

על שרף deprotection של קבוצות DDE נעשית באמצעות פתרון הידרזין 2% ב DMF לעזוב אמינים חינם שניתן guanidinylated על שרף באמצעות pyrazole-1-carboxamidine. שישה ושווי של pyrazole-1-carboxamidine ושישה ושווי של DIPEA משמשים לכל אמין בחינם על השרף (כלומר, שש שחלופות מונומר אחד מסוג N Arg להיות מותקנות). שוב, התגובה הזו היא גם יעילה מגיב pyrazole-1-carboxamidine יש מסיסות טובה DMF. השלמת התגובה נתפסת בדרך כלל באמצעות LC-MS לאחר 60 דקות בטמפרטורת החדר.

בשל הרבגוניות של שיטת submonomer, מגוון רחב של אמינים ראשוניים ניתן להשתמש בשלב העקירה כך תנאים עשויים צריכים להיות מותאמים כדי להגדיל אפי צימודciency ותשואות מוצרים כוללים או טוהרות. 31 עבור הרצפים שנדונו לעיל, ללא תנאים מיוחדים כהכרחיים זיווגים מוצלחים. עם זאת, פעמי עקירה יותר או ריכוזיים אמין גבוהה יוכל לשמש עבור התקות בעייתיות (כלומר, עבור אמיני nucleophilic גרועים או sterically המגושמים). אמינים מסוימים עשויים שלא להיות מסיסים לחלוטין DMF, ובמקרה זה מומלץ לפזר אלה N -methyl-2-pyrrolidone (NMP), או ממסים מתאימים אחרים לתגובות-שלב מוצק במקום כמו שיטת מרכז קודם לסינתזת submonomer של peptoids. 32 כדי לשלב מונומרים המכילים heteroatoms מוגנים ב הרשתות בצד, acetylation באמצעות חומצה chloroacetic הוכח כיעיל על ידי קבוצות אחרות. 33 בנוסף, ניתן להשתמש שרפים אחרים בשיטה זו להניב peptoids עם functionalization מסוף C שונה. וואנג שרפים שרפי כלוריד 2-chlorotrityl משמשים באופן שיגרתיסינתזה submonomer של peptoids. לדוגמא, שיטה זו שמשה בהצלחה עם שרף כלוריד 2-chlorotrityl בקבוצה שלנו. 2 תומך מוצק שונה ידרוש הליך טוען שונה רינק אמיד דן כאן (תלוי השרף הספציפי בשימוש) אז זה צריך להיבדק עם הספרות לפני סינתזה.

בדומה סינתזה פפטיד, התנאים מחשוף הסופי של peptoid את שרף יכול להיות מותאם גם עבור רצף מסוים. בפרוטוקול זה, קוקטייל מחשוף TFA שמש (עם triisopropylsilane ומים כמו אוכלי נבלות). Peptoids המוצג כאן הכיל רק הגנת בוק שהיא קבוצה יציבה סביר חומצה. כדי להבטיח המלא deprotection של רצפים עם חלק גדול יותר של שאריות מוגנות או חומצה מגינה פחות יציב קבוצות, פעמים מחשוף יותר עשויות להיות נחוצות (כלומר, פעמים מחשוף העולה על 2 שעות מומלצות רצפים המכילים PBF או-bu שליישוניםאסתר Tyl קבוצות מוגנות). נבלות אלטרנטיביות יכולות לשמש גם עבור רשתות בצד מיוחדות (למשל, ethanedithiol או 2-mercaptoethanol משמשים לעתים קרובות פפטידים שיש שרשרות צד המכיל גופרית כמו ציסטאין ומתיונין או).

את assay הביולוגי המוצג הנו מבחן רעיל סטנדרטי אשר ניתן לשנות כדי להתאים שורות תאים שונות. חשוב לציין כי כל צלחת 96-היטב צריכה להכיל שולטת מספיק כדי לאפשר אמון התוצאות שהתקבלו. במקרה זה, B amphotericin משמש כביקורת חיובית כפי שהוא סם ידוע המשמש לטיפול במחלה DMSO משמש כביקורת שלילית כמו זו היא הממס המשמש לייצור מניות מתחמות עבור assay. אם שורות תאים אחרות נמצאות בשימוש, אלטרנטיבית, שולטת מתאימה יש לקבל ומאומתים לפני השימוש. L. מקסיקנה הוא מודגרות עם peptoid בריכוזים בין 100 ל 2 מיקרומטר עבור שעה אחת, ולאחר מכן הטפיל / פתרון peptoid הוא מדולל על ידיגורם של עשר עבור דגירת הלילה (כלומר, בארות בתחילה עם 100 מיקרומטר peptoid מניות מדוללות עד 10 מיקרומטר).

מגיב כדאיות התא מתווסף כל טוב (10% של נפח היטב הכולל) בסוף assay. שינוי צבע גלוי נתפס בין בארות עם טפילי קיימא (ורוד), בארות שליטה ללא טפילי קיימא (כחול) ספקטרום בין עם מספרי ביניים של טפילי קיימא. הקרינה היא פרופורציונלית למספר של תאי חיים תואם את הפעילות המטבולית של התאים; צבע resazurin (לא ניאון) מומר resorufin ניאון על ידי תגובות צמצום תאים פעילים מבחינה מטבולית. 34 ב assay זה, זמן הדגירה עם מגיב כדאיות התא עבר אופטימיזציה עבור L. מקסיקנה. פעמי דגירה עם המגיב הכדאי ישתנה עבור צלחות זורעות בריכוזי תאים שונים או עם שורות תאים שונות (למשל שיטה זו יכולה לשמש גםעם בתאי יונקים). תלויים קורא צלחת המדויקת בשימוש, שיקולים צריכות להתבצע לפני מדידות קרינה נלקחות. כל בועות אוויר בבארות להסירו כדי להבטיח שניתן לנקוט קריאה מדויקת. חלק מקוראי הצלחת לקרוא מעומק הצלחות, ובמקרה תחתי שטוח 96 צלחות גם אמור לשמש. מכונות אחרות יכולות לקרוא מהחלק העליון של הצלחת, כך את המכסה של הצלחת צריכה להסיר לפני המדידה.

לבסוף, בעתיד, פרוטוקול זה עשוי להתיישב עם סינתיסייזרים אוטומטיים המסוגלים ביצוע רצפים רבים במקביל. בנוסף, הסינתזה של peptoids מחזורית כמו כן ניתן בשיטה זו. פרוטוקול זה אמור לספק לחוקרים עם הליך סינטטי מעשיות שיכולים לשמש לגשת פיגומי peptoid רומן עם שני מונומרים lysine- ו ארגינין-סוג, אשר עשוי להיות שימוש ביישומים רבים, כוללים חומרים או שדות מרפאים.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים המועצה למחקר הנדסה המדעים הפיזיקליים (EPSRC) עבור תמיכה כספית (HLB). אנו מודים גם Sridevi Maalika Ramanoudjame על סיועה בזמן הצילומים של הליך זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מחסניות מיצוי פאזה מוצקה מפוליפרופילן עם שתי מחסניותCrawford Scientific12131017 ו-1213101520 מ"ל ו-6 מ"ל המשמשות בתכשיר זה
חומצה טריפלואורואצטיתטוקיו התעשייה הכימית (אירופה)T0431-100g>98%; זהירות: עלול לגרום לכוויות חמורות ולגירוי בדרכי הנשימה
N,N'-diisopropylcarbodiimideSigma Aldrich38370-100ML98%; זהירות: מסוכן לעיניים, לעור ובאמצעות שאיפת נשימה, עלול גם לגרום לרגישות
DimethylformamideFischer Scientific10346180 HPLC; זהירות: חשד לטרטוגן
אצטוגןפישר סיינטיפיק10407440בדרגת HPLC
1035426399.8%; זהירות: חשד למסרטן
חומצה ברומקטיתסיגמא אולדריץ'17000-100 גרם>99%; זהירות: גורם לכוויות ומסוכן לעור, לעיניים ולדרכי הנשימה
(S)-(-)-אלפא מתילבנזילאמיןסיגמא אולדריץ'115568-100G98%; אזהרה: מזיק בבליעה, רעיל במגע עם העור, גורם לכוויות עור חמורות ולנזק לעיניים, משמש לסינתזה של מונומר Nspe
N-Boc 1,4-diaminobutaneTokyo Chemical Industry (אירופה)A1373-25g>98%; זהירות: גורם לכוויות עור חמורות ולנזק לעיניים, המשמש לסינתזה של מונומר NLys
N-Boc 1,2-diaminoethaneTokyo Chemical Industry (Europe)A1371-25g>97%; זהירות: גורם לכוויות עור חמורות ולנזק לעיניים, המשמש לסינתזה של מונומר Nae
1,2-diaminobutaneSigma AldrichD13208-100G99%; זהירות: נוזל ואדים דליקים, מזיקים בבליעה או בשאיפה, רעילים במגע עם העור, גורמים לכוויות עור חמורות ולנזק לעיניים, המשמשים בסינתזה של מונומר NhArg
1,4-diaminoethaneSigma Aldrich03550-250ML99.5%; זהירות: נוזל ואדים דליקים, מזיקים בבליעה או בשאיפה, רעילים במגע עם העור, גורמים לכוויות חמורות בעור ולנזק לעיניים, המשמשים לסינתזה של מונומר NnArg
 
 
1H-פיראזול-1-קרבוקסמידין הידרוכלורידסיגמא אולדריץ'402516-10Gבצורת מלח HCl; אזהרה: מזיק בבליעה ועלול לגרום לתגובה אלרגית בעור, גורם לנזק חמור לעיניים
Hydrazine monohydrateSigma Aldrich207942-5Gדרגת ריאגנט; זהירות: חשוד כמסרטן, קטלני בשאיפה וגורם לכוויות קשות בעור ובעיניים
2-אצטיל דימדוןNovabiochem8510150005Dde-OH
Rink שרף אמידNovabiochem8551190005100-200 רשת, טעינה גבוהה
PiperidineSigma Aldrich411027-1L>99.5%, חומר מבוקר, ולכן יש לקבל אישור מתאים לפני הרכישה; זהירות: נוזל ואדים דליקים מאוד, מזיקים בבליעה ורעילים במגע עם העור או בשאיפה, גורמים לכוויות חמורות בעור ולנזק לעיניים, מזיקים לחיים במים עם השפעות ארוכות טווח
TriisopropylsilaneSigma Aldrich233781-50G98%; זהירות: נוזל ואדים דליקים, גורמים לגירוי בעור ולגירוי חמור בעיניים
alamarBlueThermoFischer DAL1025לא מסווג כמסוכן
מדיום חרקים של שניידרסיגמא אולדריץ'S9895-1Lאבקה, יש להכין מדיום לפני השימוש בהתאם להוראות היצרנים; אפשר להתחמם לטמפרטורת החדר לפני השימוש במבחנים ביולוגיים
96 לוחות בארVWR734-1793תחתית שטוחה (כדי לאפשר מדידת פלואורסצנטיות מלמטה), מאגרי ממס שטופלו בתרבית רקמות
VWR613-1182בשימוש עם פיפטה רב-ערוצית
פיפטה רב-ערוציתEppendorf3122000043
קצות פיפטהStarlab GroupS1111-3810, S1113-1810, S1111-6810נפח הקצה תלוי בפיפטה המשמשת. 10  ומיקרו; l, 10 - 200  ומיקרו; l ו-1,000  ומיקרו; l מומלץ לבדיקות
25 ס"מ3 צלוחיות תרבית תאיםVWR734-2312
צינורות צנטריפוגה 50 מ"לVWR525-0791
דימתילסולפוקסיד (דרגת ביולוגיה מולקולרית)סיגמא אולדריץ'D8418-50MLלא מסווג כמסוכן
סרום בקר עוברי מומת בחוםThermoFischer 10082139-100 מ"לג'יבקו
פניצילין/סטרפטומיציןתרמופישר 15140148-20 מ"לקיצור: P/S
Amphotericin BSigma Aldrich46006-100mgAmphotericin B trihydrate, תקן אנליטי VetranalTM
> דיכלורומתאן פישר >

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zuckermann, R. N., Kerr, J. M., Kent, S. B. H., Moos, W. H. Efficient method for the preparation of peptoids oligo(N-substituted glycines) by submonomer solid-phase synthesis. J. Am. Chem. Soc. 114, 10646-10647 (1992).
  2. Bolt, H. L., Cobb, S. L. A practical method for the synthesis of peptoids containing both lysine-type and arginine-type monomers. Org. Biomol. Chem. 14, 1211-1215 (2016).
  3. Mojsoska, B., Zuckermann, R. N., Jenssen, H. Structure-activity relationship study of novel peptoids that mimic the structure of antimicrobial peptides. Antimicrob Agents Chemother. , (2015).
  4. Chongsiriwatana, N. P., et al. Peptoids that mimic the structure, function, and mechanism of helical antimicrobial peptides. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 2794-2799 (2008).
  5. Eggimann, G. A., Bolt, H. L., Denny, P. W., Cobb, S. L. Investigating the Anti-leishmanial Effects of Linear Peptoids. Chem Med Chem. 10, 233-237 (2015).
  6. Kapoor, R., et al. Antimicrobial Peptoids Are Effective against Pseudomonas aeruginosa Biofilms. Antimicrob. Agents Chemother. 55, 3054-3057 (2011).
  7. Ryge, T. S., Frimodt-Moller, N., Hansen, P. R. Antimicrobial activities of twenty lysine-peptoid hybrids against clinically relevant bacteria and fungi. Chemotherapy. 54, 152-156 (2008).
  8. Huang, M. L., Benson, M. A., Shin, S. B. Y., Torres, V. J., Kirshenbaum, K. Amphiphilic Cyclic Peptoids That Exhibit Antimicrobial Activity by Disrupting Staphylococcus aureus Membranes. Eur. J. Org. Chem. , 3560-3566 (2013).
  9. Huang, M. L., Shin, S. B. Y., Benson, M. A., Torres, V. J., Kirshenbaum, K. A Comparison of Linear and Cyclic Peptoid Oligomers as Potent Antimicrobial Agents. Chem Med Chem. 7, 114-122 (2012).
  10. Bolt, H. L., Eggimann, G. A., Denny, P. W., Cobb, S. L. Enlarging the Chemical Space of Anti-leishmanials: a Structure-Activity Relationship Study of Peptoids against Leishmania mexicana, a Causative Agent of Cutaneous Leishmaniasis. Med Chem Comm. , (2016).
  11. The World Health Organisation. Leishmaniasis. , Available from: http://www.who.int/leishmaniasis/en/ (2016).
  12. Chon, S. Y., et al. Antibiotic overuse and resistance in dermatology. Dermatologic therapy. 25, 55-69 (2012).
  13. Alvar, J., et al. Leishmaniasis Worldwide and Global Estimates of Its Incidence. PLOS ONE. 7, (2012).
  14. Croft, S. L., Barrett, M. P., Urbina, J. A. Chemotherapy of trypanosomiases and leishmaniasis. Trends Parasitol. 21, 508-512 (2005).
  15. Kedzierski, L. Leishmaniasis Vaccine: Where are We Today? J Global Infect Dis. 2, 177-185 (2010).
  16. Croft, S. L., Sundar, S., Fairlamb, A. H. Drug resistance in leishmaniasis. Clin Microbiol Rev. 19, 111-126 (2006).
  17. Huang, W., et al. Learning from Host-Defense Peptides: Cationic, Amphipathic Peptoids with Potent Anticancer Activity. PLOS ONE. 9, (2014).
  18. Wender, P. A., et al. The Design, Synthesis, and Evaluation of Molecules That Enable or Enhance Cellular Uptake: Peptoid Molecular Transporters. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 13003-13008 (2000).
  19. Schröder, T., et al. Peptoidic Amino- and Guanidinium-Carrier Systems: Targeted Drug Delivery into the Cell Cytosol or the Nucleus. J. Med. Chem. 51, 376-379 (2008).
  20. Kömel, D. K., et al. Cell-penetrating peptoids: Introduction of novel cationic side chains. Eur. J. Med. Chem. 79, 231-243 (2014).
  21. Hein-Kristensen, L., Knapp, K. M., Franzyk, H., Gram, L. Bacterial membrane activity of α-peptide/β-peptoid chimeras: Influence of amino acid composition and chain length on the activity against different bacterial strains. BMC Microbiology. 11, 1-12 (2011).
  22. Su, Y., Doherty, T., Waring, A. J., Ruchala, P., Hong, M. Roles of Arginine and Lysine Residues in the Translocation of a Cell-Penetrating Peptide from (13)C, (31)P and (19)F Solid-State NMR. Biochem. 48, 4587-4595 (2009).
  23. Andreev, K., et al. Guanidino groups greatly enhance the action of antimicrobial peptidomimetics against bacterial cytoplasmic membranes. BBA Biomembranes. 1838, 2492-2502 (2014).
  24. Foged, C., et al. Cellular uptake and membrane-destabilising properties of alpha-peptide/beta-peptoid chimeras: lessons for the design of new cell-penetrating peptides. BBA Biomembranes. 1778, 2487-2495 (2008).
  25. Vedel, L., et al. Antiplasmodial and prehemolytic activities of alpha-peptide-beta-peptoid chimeras. Chem Bio Chem. 8, 1781-1784 (2007).
  26. Lear, S., Cobb, S. L. Pep-Calc.com: a set of web utilities for the calculation of peptide and peptoid properties and automatic mass spectral peak assignment. J Computer-Aided Mol Des. , 1-7 (2016).
  27. Bates, P. A. Complete developmental cycle of Leishmania mexicana in axenic culture. Parasitol. 108, 1-9 (1994).
  28. Gossage, S. M., Rogers, M. E., Bates, P. A. Two separate growth phases during the development of Leishmania in sand flies: implications for understanding the life cycle. Int J Parasitology. 33, 1027-1034 (2003).
  29. Seo, J., Lee, B. C., Zuckermann, R. N., et al. Comp Biomaterials. Ducheyne, P., et al. 2, Elsevier. 53-76 (2011).
  30. Nash, I. A., Bycroft, B. W., Chan, W. C. Dde - A selective primary amine protecting group: A facile solid phase synthetic approach to polyamine conjugates. Tetrahedron Lett. 37, 2625-2628 (1996).
  31. Culf, A. S., Ouellette, R. J. Solid-phase synthesis of N-substituted glycine oligomers (alpha-peptoids) and derivatives. Molecules. 15, 5282-5335 (2010).
  32. Tran, H., Gael, S. L., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N. Solid-phase Submonomer Synthesis of Peptoid Polymers and their Self-Assembly into Highly-Ordered Nanosheets. J Vis Exp. , e3373(2011).
  33. Burkoth, T. S., Fafarman, A. T., Charych, D. H., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N. Incorporation of unprotected heterocyclic side chains into peptoid oligomers via solid-phase submonomer synthesis. J. Am. Chem. Soc. 125, 8841-8845 (2003).
  34. Nakayama, G. R., Caton, M. C., Nova, M. P., Parandoosh, Z. Assessment of the Alamar Blue assay for cellular growth and viability in vitro. J Immunol Methods. 204, 205-208 (1997).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

HPLCLeishmania mexicana

מאמרים קשורים