דיפוזיה מולקולרית פלזמה ממברנות יסודי לימפוציטים נמדד באמצעות מתאם ספקטרוסקופיה פלואורסצנטי

סיכום

מתוארת שיטה למדידת דיפוזיה של חלבון בממברנות של תאי חיסון ראשוניים באמצעות ספקטרוסקופיה של מתאם פלואורסצנטי (FCS). במאמר זה מודגם השימוש בנוגדנים לסימון פלואורסצנטי.

תקציר

מתאם ספקטרוסקופיה פלואורסצנטי (FCS) היא טכניקה רבת עוצמה ללימוד דיפוזיה של מולקולות בתוך ממברנות ביולוגיות עם רזולוציה גבוהה במרחב ובזמן. FCS יכול לכמת את מקדם ריכוז דיפוזיה מולקולרית של מולקולות שכותרתו fluorescently בקרום התא. טכניקה זו יש את היכולת לחקור את מאפייני דיפוזיה המולקולריים של מולקולות בקרום הפלזמה של תאים חיסוניים מצב יציב (כלומר, בלי תהליכים המשפיעים על התוצאה בזמן המדידה בפועל). FCS מתאים ללימוד דיפוזיה של חלבונים כי הם לידי ביטוי ברמות אופייניות חלבונים אנדוגניים ביותר. כאן, שיטה פשוטה וחזקה כדי לקבוע את קצב הדיפוזיה של חלבוני קרום על לימפוציטים עיקרי באה לידי ביטוי. דרך יעילה לבצע מדידות על תאי חיים מוכתם נוגדן נפוץ תצפיות שהתרחשו לאחר הרכישה מתוארת. הפיתוחים האחרוניםבפיתוח של צבעי ניאון צילום יציב יכול להיות מנוצל על ידי conjugating הנוגדנים של עניין לנכס צבעים שאינם להלבין בהרחבה במהלך המדידות. בנוסף, זה מאפשר זיהוי של גופים להתפוגג אט אט, אשר היא תכונה נפוצה של חלבונים הביע קרום התא. הליך הניתוח כדי לחלץ פרמטרי ריכוז דיפוזיה מולקולריים מן עקומות autocorrelation שנוצרו מודגש. לסיכום, פרוטוקול בסיסי למדידות FCS מסופק; ניתן בעקבותיו ידי אימונולוגים עם הבנה של מיקרוסקופיה confocal אך ללא ניסיון קודם אחרים של טכניקות למדידת פרמטרים דינמיים, כגון שיעורי דיפוזיה מולקולרית.

מבוא

פונקציות תאים חיסוניים רבות מסתמכות על דיפוזיה אינטראקציות מולקולריות בתוך ממברנות. ממברנות ביולוגיות הם מורכבים, וישנם גורמים רבים שעשויים להיות חשובים לתפקוד של תאי מערכת החיסון יכול להשפיע על מהירות של דיפוזיה translational של חלבונים בתוך קרומים תאיים ^1. הראינו לאחרונה כי הרג טבעי (NK) תאים, לימפוציטים שייך למערכת החיסון המולדת, להפגין דיפוזיה הפרש של שני חלבונים למדו בבית קרום התא בהתאם למצב של תא NK הפעלה ^2.

מתאם ספקטרוסקופיה פלואורסצנטי (FCS) היא טכניקה כי הוא מסוגל לכימות שיעורי דיפוזיה מולקולרית בתוך ממברנות ביולוגיות. זה מדווח על קצב הדיפוזיה הממוצע של fluorescently שכותרתו מולקולות בנפח קבוע, בדרך כלל מוקד מיקרוסקופ confocal. היא מבוססת על מדידת תנודות קרינה המתרחשת על תנועה מולקולרית במערכת במצב עמיד. FCS כבר בשימוש נרחב ללימוד דיפוזיה של צבעי ניאון וחלבונים, הוא פתרון ובתוך ממברנות שומנים בדם. פרמטרי פלט נוספים המשפיעים על קצב הדיפוזיה יכולים להיות גם למדו בעקיפין בדרך זו (למשל, שינויים קונפורמציה של חלבונים או אינטראקציות של מולקולות על קרום תא) ^{3, 4.} FCS בולטת לעומת טכניקות אחרות בשל הרגישות הגבוהה שלו, מה שמאפשר את האפשרות לגילוי מולקולה בודדת. זה עובד גם עבור ריכוזים מולקולריים nanomolar למגוון millimolar, אשר אופיינית עבור רמות ביטוי אנדוגני של רוב החלבונים ^5. יתר על כן, FCS יכול לתת קירוב המספר המוחלט של חלבונים בתוך הנפח למד, בעוד רוב הטכניקות אחרות רק לתת מידע ביחס על רמות ביטוי חלבון. שיטות אחרות כדי למדוד את שיעורי דיפוזיה מולקולרית בתוך ממברנות כוללים fluoהתאוששות rescence לאחר photobleaching (FRAP), חלקיק בודד מעקב (SPT), FCS חריר המרובה, ושיטות התמונה קורלציה. FRAP ושיטות תמונת מתאם טכניקות הרכב, אשר בדרך כלל לא מספקות מידע על מספרם המוחלט של מולקולות ^10. לעומת SPT, התפוקה של FCS היא גבוהה ביחס המאפיין את הממוצע באוכלוסייה. הניתוח הוא גם פחות תובעני מאז קצב הדיפוזיה הממוצע של המולקולות הנוכחות בתוך מוקד הליזר נמדד, ולא בשיעור של מולקולות בודדות. כמו כן, אלא אם כן מיקרוסקופים מיוחדים זמינים ^11, SPT לא יכול לתת שום מידע על ריכוזי, מאז תיוג SPT תקן חייב להיות נמוך מאוד על מנת לאפשר זיהוי של מולקולות בודדות. מצד השני, FCS מחייב המולקולות הנחקרת להיות ניידות. זה פשוט לא מזהה כל שברים המשוערת נייחים או מולקולות נעו לאט יותר. שיעור דיפוזיה של מולקולותמתגוררים בתוך המוקד שאורכן עולה על עשירית מהזמן הרכישה לא להיות מיוצג כראוי במדידות FCS ^{3, 12.} לכן, מקדמי דיפוזיה שרשמו FCS נוטים להיות מהיר יותר מאשר שיעורי דיפוזיה דיווחו מטכניקות כמו FRAP ו SPT, שבו קרוב ל-נייח איטית מאוד שברים נלקחים בחשבון גם כן. SPT גם ייתן תיאור מפורט יותר של ההשתנות של שיעורי דיפוזיה בתוך האוכלוסייה המולקולרית מ FCS יהיה.

FCS מכמת את התנודות של עוצמת קרינה לאורך זמן בתוך הנפח הנרגש. במקרה של מדידות קרום, זה מתרגם ל השטח המואר של הממברנה. במאמר זה, אנו מנצלים את העובדה כי תנודות כאלה הן המושרה על ידי מולקולות המפגינות דיפוזיה בראונית ובכך עוברות פנימה וחוצה של נפח העירור. ישנם גם מספר מקורות אפשריים אחרים עבור fluctuaהמשא ב האות הקרינה, כגון מהבהב או נוכחות של טריפלט ב fluorophores, השפעות סביבתיות, מחייב unbinding של ליגנד, או תנועה של קרום התא כולו. מקורות שגיאה המשוערים אלה צריכים להילקח בחשבון בעת תכנון ניסוי FCS כדי לפרש את התוצאות במדויק ^{12, 13.} בדרך כלל, שיעורי דיפוזיה לרוחב ממברנות ביולוגיות נמוכים בשל צפיפות ואינטראקציות, הוא בין חלבונים בממברנה ובין חלבוני שלד התא. מבחינה הסטורית, השימוש FCS בממברנות ובכך כבר הקשה על ידי חוסר fluorophores צילום יציב, אשר נדרשים כדי למנוע הלבנה בזמני המעבר המורחבים דרך התמקדות עירור ^14. עם זאת, היום, יש שפע של אפשרויות עבור צבעי צילום יציב מתאימים. שיפורים משמעותיים גלאי ורכיבי חומרה אחרת גם לאפשר זיהוי של prote הניאוןכל פרטי צבעים של בהירות נמוכה יותר. כאן, פרוטוקול בסיסי עבור היישום של FCS באמצעות לימפוציטים העיקרי בעכברים, שבו החלבון של עניין מסומן עם fluorescently מתויג נוגדן, מתואר. גישה כדי להתאים את עקומות autocorrelation כדי לחלץ את מקדם הדיפוזיה ואת הצפיפות המולקולרית מוצגת גם. הפרוטוקול שיתפשר עוקב אחריו בקלות על ידי אימונולוגים ללא ניסיון קודם של טכניקות ללמוד דיפוזיה של מולקולות. עם זאת, הבנה בסיסית של מיקרוסקופיה confocal צפויה (כדי לקבל הבנה בסיסית זו, ראה התייחסות ^15). פרוטוקול זה יכול להיות מותאם בקלות יחסית לתאי השעיה אחרים, הוא שורות תאי תאים ראשוניים. עבור משתמשים מנוסים יותר FCS, שיטות ניתוח מעודנות יותר להתקיים, שחלקם מתוארים הדיון.

פרוטוקול

1. מכתים עבור FCS

1. לבודד תאי NK בעכברים מן לימפוציטים טחול באמצעות תיוג חרוז מגנטי, על פי הפרוטוקול של היצרן ^16. השתמש 2-3 x 10 ⁵ תאים לדגימה עבור השלבים הבאים.
   הערה: השתמש סלקציה שלילית להעשיר את אוכלוסיית תא המטרה, והשאיר אותו ללא פגע, כך התא יכול להיות מתויג באמצעות נוגדנים ראשוניים בלבד. ראה התייחסות ² לקבלת מידע מפורט יותר על בידוד תא מעכברים ^2.
2. עבור תאים בעכברים המבטאים קולטנים Fc, לחסום את קולטני Fc עם 2.4G2 שיבוט נוגדן ב 5 מיקרוגרם / μl ב 25 μl של תמיסת מלח שנאגרו פוספט (PBS) ו -1% בסרום שור העובר (FBS) לדגימה. דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
3. הכנת תערובת נוגדנים.
   1. נוגדנים השתמש מצומדות ישירות fluorophore צילום יציב. אם שני נוגדנים נגד שני חלבונים שונים² משמש, fluorophores שימוש שיש ספקטרום פליטה מופרדת היטב כדי למזער את ההצטלבות (למשל, נרגש מן הלייזרים 488 ו 633, בהמשך הפרוטוקול המכונה לייזרים "ירוקים" ו- "אדומים" ו fluorophores, בהתאמה ).
      הערה: אם נוגדנים המסחריים שכותרתו עם fluorophores צילום יציב אינם זמינים עבור הסמנים הביולוגיים שנבחרו, נוגדנים ללא תווית המצומד אל fluorophores פי הוראות היצרן. ראה חומרי שולחן הנוגדנים המשמשים במחקר זה.
   2. הכינו תערובת נוגדנים על ידי דילול נוגדנים שכותרתו fluorescently נגד החלבון או חלבונים בעלי עניין ב PBS + 1% FBS. מוסיפים את תערובת נוגדנים מדגם לנפח סופי של 50 μl לדגימה. דגירה על קרח למשך 45 דקות בחושך.
      הערה: מטב את הריכוז של הנוגדנים מראש על מנת להבטיח כי הנוגדן משמש בריכוז להרוות, בדרך כלל1-10 מיקרוגרם / מ"ל.
4. לאחר דגירה, לשטוף את התאים על ידי הוספת 250 μl של PBS ו צנטריפוגות אותם ב XG 150 במשך 3 דקות. בטל supernatant.
5. חזור על שלב 1.4.
6. Resuspend התאים 200 μl של PBS + 1% FBS. שמור על הקרח בחושך עד הרכישה.
   הערה: תאים Murine NK יכולים להישמר על הקרח עד 10 שעות.

2. הכנת שקופיות coverglass חדרים מיקרוסקופ

שקופיות coverglass החדרים השתמש או מנות עם עובי הזכוכית המכסה כי מיקרוסקופ כבר מותאם, או # 1 או # 1.5: הערה. אם המיקרוסקופ אינו מיושר עבור בעובי מסוים, או אם זה לא ידוע, טבעת מיקרוסקופ הצווארון צריכה להיות מותאמת עבור עובי coverglass הנוכחי ^17.

1. לדלל פולי- L- ליזין במים מזוקקים על יחס 1:10. הוסף 200 μl של בדילול פולי- L- ליזין לתאי דגירה במשך 20 דקות.
2. הסר אתפולי- L- ליזין על ידי שאיפה ולתת אוויר יבש קאמרית מאת עוזב אותו ללא מכסה בטמפרטורת החדר למשך דקות 20-30 לפחות.

3. הפעלת מערכת FCS

הערה: פרוטוקול זה מתייחס למערכת מיקרוסקופ ספציפית ותוכנה (ראה חומרים / ריאגנטים טבלה), למרות setups מיקרוסקופיה אחר וחבילות תוכנה יכולים לשמש גם.

1. הפעל את מיקרוסקופ סורק לייזר confocal עם קורלטור FCS. פתח את התוכנה "מצב מומחה". בחר את עדשת הטבילה במי 40X.
2. בכרטיסייה "רוכש", לחץ על "Config" ו "סריקה" כפתורים כדי לפתוח את "בקרת התצורה" וחלונות "בקרת הסריקה" (חלונות A ו- B באיור 1, בהתאמה). בכרטיסייה "Confocor", לחץ על "מדוד" כדי לפתוח את החלון "מדידה" (חלון C באיור 1).
3. צור את התיקייה שבה יישמר FCSמידות. התחל מאגר תמונה חדשה על ידי לחיצה על "חדש" תחת הלשונית "קובץ".
4. שימוש בלחצן "לייזר", להדליק את מנורת הלוגן לייזרים רלוונטי עבור fluorophores מרגש (למשל, 488 ננומטר עבור עירור "ירוק" לייזר עירור 633 ננומטר עבור לייזר עירור "אדום").
5. בחר מסנני עירור ופליטה מתאימים ולהפעיל את הגלאי המקביל.
   1. קביעת הגדרות עבור לכידת תמונה, כולל לייזר עירור, מסננים עירור ופליטה, נתיב האור, וגלאי לשמש, בחלון "בקרת תצורה".
   2. בדומה לכך, ציין את ההגדרות המתאימות עבור מדידות FCS בחלון "מדידה", תחת הלשונית "תצורת המערכת". השתמש כמו הגדרות דומות ככל האפשר עבור הדמיה FCS.
   3. הפעל את ערוצי גילוי להקלטות FCS על ידי סימון התיבה "CH1" עבור channe הירוקl ו "CH2" עבור הערוץ האדום בחלון "מדידה".
      הערה: ההגדרות צריכות להיות מותאמות עבור fluorophore (הים) בשימוש, כמו בניסוי הדמית confocal סטנדרטי. בניסויים הבאים, אותן הגדרות FCS ניתן לעשות שימוש חוזר על ידי פתיחת קובץ FCS הישן, באמצעות תפריט "Confocor" הנפתח בחלק העליון של ממשק המשתמש, ובחירת "פתח קובץ". לחץ "שימוש חוזר" בחלון הרכישה המתעוררים. באופן דומה, הגדרות רכישת תמונה ניתן לטעון על ידי פתיחה נשמרה תמונה והלחיצה "שימוש חוזר".
6. מתן עד הליזר יציב לפני ביצוע מדידות FCS. זה יכול לקחת עד 30 דקות עבור לייזרי גז, תוך לייזרים דיודה לייצב מהר. התאם את החריר בזמן ההמתנה.

4. התאמת חריר

1. כן 0.2-0.5 מיקרומטר פתרונות של fluorophores או צבעי ניאון מתאים ספקטרום העירור ופליטה של ​​התוויות על הנוגדנים. הבוודאי ידע fluorophores מקדם דיפוזיה ^{18, 19.}
2. שים טיפה 50 μl של פתרון עם fluorophore נרגש לייזר ירוק במרכז באר שקופית coverglass החדרים. שים טיפת מים מזוקקים על מטרת מי 40X ולמקם את השקופית. לחץ על כפתור ה "Vis" להתחיל אור הנראה ולהשתמש העינית למצוא ולהתמקד ירידת fluorophore.
   הערה: משתמשת באותו שקופית כתמונה למדידות תא מאוחר יותר, מאז שינויים קלים המשוערת עובי זכוכית בין שקופיות יכולות להשפיע על יישור מיקרוסקופ.
3. מניחים את הפוקוס גם בתוך טיפת הנוזל (10-100 מיקרומטר מלמטה).
4. בחלון "מדידה", בחר בכרטיסייה "רכישה". לחץ "מיקום נוכחי" תחת "פוזיציות" (חלון C באיור 1).
5. חזור לכרטיסייה "תצורת המערכת" באותו חלון. הגדרת p גבוההower עבור לייזר ירוק.
   הערה: כוח ליזר גבוה מתייחס הכח להרוות (כלומר, את אות הניאון אינה מעלה באופן ליניארי אם כוח הליזר הוא גדל עוד יותר). בסביבות 1 כוח הגדרות mW של המערכת, או 5-10% של כוח לייזר מקס, הוא בדרך כלל מספיק.
6. בדוק את יציבות האות על ידי לחיצה על "התחל". פעולה זו תפתח בחלון נפרד מוצגות עקבות הזמן העקום autocorrelation לשקילה הנוכחית. בדוק כי אות הניאון היא גבוהה ויציבה לאורך זמן, ותנודות המציגות את kHz ולא בטווח הרץ.
7. בחר בלחצן "O התאם" בחלון "מדידה". בדוק אם ערוץ זיהוי התקין (ch1 או CH2) נבחר. לחץ "AutoAdjust X." אם העקומה וכתוצאה מכך לא מראה לכל היותר ברורה או המרבי היא בקצה, יש לסמן את האפשרות "הגסה" ולחץ על "AutoAdjust X" שוב. כאשר המסך וכתוצאה מכך-בכיוון x הוא סיים, לעשות את saלי עבור Y על ידי לחיצה על "AutoAdjust י"
8. בטלו את הבחירה "גס" חלופי בין התאמת X ו- Y על ידי לחיצה על "AutoAdjust" עד שיש הן מקסימום ברור והערכים אינם משתנים בין מדידות.
9. אם תאים מסומנים עם שני fluorophores שונה, לעבור לחדר שבו פתרון fluorophore האדום נוסף. בחר כוח ליזר גבוה עבור הליזר האדום וחזור על שלבי 4.6-4.8 עבור ערוץ העירור וגילוי האדום.
   הערה: אם X ו- Y ערכים לסטות בין הערוצים במערכות שבו רק חריר אחד משמש הוא ערוצי הגילוי, בחר ערכי ביניים ולחץ על אישור כדי לקבל את השינויים. הנה, לייזר 488 ננומטר עם מקסימום ב X = 79 ו- Y = 189 ואת לייזר 633 ננומטר עם מקסימום ב X = 80 ו- Y = 188, ערכי X = 80 ו- Y = 189 נבחרו. השילוב של לייזרים 488 ננומטר 633 ננומטר עבור עירור של שני נוגדנים שכותרתו עם fluorophores נרגש 488 ננומטר או 633 ננומטר הוא בחירה טובה, מאזסיכון ההצטלבות ממוזער אם ספקטרום הפליטה לא חופף ^2.

5. מדוד את Transit הזמן של חינם Fluorophore

הערה: על ידי קביעת זמן המעבר דרך ההתמקדות (TauD) של fluorophore עם מקדם דיפוזיה ידוע, את גודל נפח זיהוי, ולכן השטח של קרום התא כי הוא בתוך המוקד, ניתן לחשב. חישוב TauD המתואר בשלב 7.2.

1. באמצעות הפתרונות אותו ששימש בהתאמת חריר, להגדיר את זמן הרכישה עד 30 שניות x 2 חזרות תחת הלשונית "רכישת" בחלון "מדידה" (איור 1, חלון C).
2. התחל מדידה על ידי לחיצה על "התחל" בחלון "מדידה" (איור 1, חלון B).
   1. מבצעים סדרה כוח לייזר עבור כל לייזר עירור ואת fluorophore המקבילה פתרון, החל מ או לידלהרוות כוח ולהפחית בחצי לכל מדידה. שנה את כוח לייזר בלשונית "תצורת המערכת" של החלון "מדידה" (איור 1, חלון C). לחצו על כפתור "התחל" כדי להתחיל במדידה.
      הערה: כלול את כוח לייזר עבור מדידות תא הקרובה בתחום הנמוך (למשל, למדוד ב 16, 8, 4, ו -2 μW כוח, לפני אובייקטיבי) ^20. הגדרות ליזר מערכת הן בכלל גבוה עירור הפלט ויכולות להשתנות תלוי ברובו על המיקרוסקופ ואת איכות היישור. במערכת זו, בטווח הכח מעל התואמת כ 60-500 μW גדרות מערכת של הכח. מומלץ להשתמש במד כוח למדוד את תפוקת החשמל לפני המטרה לראשונה מיקרוסקופ חדש משמש. הכוח המקסימלי הנוכחי של הלייזר נמצא תחת הכפתור "מידע" של החלון "מדידה".
   2. רשום את הספירה לכל שומהcule (CPM, יחיד: KHz) מכל מדידת כוח הליזר.
   3. אם שני ערוצי גילוי משמשים, לבדוק את החלון המציג את עקומת autocorrelation עבור הצטלבות. השתמש בתמיסה המכילה fluorophores הירוקה היחידה למדוד autocorrelation FCS מזוהה בערוץ זיהוי אדום פתרון עם fluorophores אדום רק להעריך זיהוי בערוץ זיהוי ירוק. ככלל אצבע, לשמור על CPM זוהה מן fluorophore "לא בסדר" מתחת ל -5% של אות המסוימת מן fluorophore הנכונה.
   4. בדוק שערכי ליניארי עם כוח לייזר המשמש. רוויה של CPM על כוח הליזר הגבוה ביותר (כלומר, ערכים נמוכים במקצת מהצפוי ממערכת יחסים ליניארי) מקובל.
      הערה: CPM צריך להיות הרבה מעל 10 עבור כוח הליזר הגבוה ביותר עבור כמעט כל מערכות מיקרוסקופ fluorophores נפוץ ויכול להיות גבוהה משמעותי למערכות רגישות. בפעם הראשונה נוגדן פלורסנט מצומדות חדשה משמש, לבצעמדידת FCS של הנוגדן בחופשיות לשדר בתמיסה לכמת את CPM הצפוי. לפני המדידה, מעיל לתא המדידה עם 200 μl של L- ליזין פולי מורכבים עם פוליאתילן גליקול (מדולל ל 0.5 מ"ג / מ"ל ​​PBS) במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר. הסר את הנוזל עם pipet ולאפשר חדר אוויר יבש. שמור את פתרון המניות במקרר (עד 2 שבועות) ומניית האבקה במקפיא. על המיקרוסקופ, לדלל את הנוגדן 1-10 מיקרוגרם / מ"ל ​​ב PBS. בצע את הפעולות 4.2-4.4 ו -6.7 בפרוטוקול זה. אם פני השטח הוא לא מצופים פתרון שאינו מקל, נוגדנים יהיו אינטראקציה עם משטח הזכוכית להיות מדולדלים במהירות מהפתרון.

6. מדידות תא

1. להוסיף 125 μl של תאים PBS + 1% FCS מן ההשעיה תא שכותרתו נוגדן (שלב 1.5) ו -150 μl של מדיום שקוף רוזוול פארק הזיכרון מכון 1640 (RPMI) לתוך אחד טוב של שקופית coverglass 8-גם מחולק לתאים. Leותעיף התאים בחושך בטמפרטורת מדידה במשך 20 דקות לפחות לפני תחילת מדידות FCS.
   הערה: זו היא לאפשר לתאים להתיישב לצרף התחתון של הבארות וכדי לאזן את תאי פתרון לטמפרטורת המדידה.
2. בחלון "בקרת סריקה" (איור 1, חלון B), להגדיר זום 1 ולהתחיל סריקה XY מהיר על ידי לחיצה על כפתור "מהיר XY". שנה את כוח הליזר כך שזה נמוך ככל האפשר תוך התאים הם עדיין נראו בבירור. מרכז את התמונה על תא סבב בהירות ממוצעת, שבו הממברנה מוגדר בבירור ואין אות ניאון בציטופלסמה. התקרב עד התא מכסה את רוב התמונה.
3. בחר תא חדש אם התא שהזרם נע או קנוקנות מציג, extrusions, או כתמים בהירים מאוד. שמור אותו זום כוח לייזר עבור כל התאים שנתפס במשך אותו ניסוי.
   הערה: קרום פרע יכול גם להיות סימן של apo הקרובהפטוזיס.
4. דגש על החלק העליון של קרום התא. בלשונית "רכישה" של חלון "מדידה" (איור 1, חלון C), בחר מיקום עבור המדידה FCS באמצעות הפעלת "Crosshair." לחלופין, בחר את הכרטיסייה "תמונת LSM", לסמן את המקום המדיד רצה בתמונת LSM, ולחץ על "הוסף עמדה."
   הערה: החלק העליון של קרום התא לא להיות מושפע נוגדנים ניאון או fluorophores unspecifically מאוגד-פולי- L- ליזין. עם זאת, חשוב לוודא כי התא לא זז במהלך המדידה (לראות את התוצאות).
5. בלשונית "רכישה" של חלון "מדידה" (איור 1, חלון C), לקבוע את מספר החזרות עד 6-10, עם "זמן מדוד" שקיעה ב- 10 שניות לעמוד חוזרים.
6. חזור לכרטיסייה "תצורת המערכת" של החלון "מדידה". התאם את כוח לייזר למדידת FCS תחת "Lכפתור aser ". לפני המטרה, השתמש צריכת חשמל נמוכה למדידות התא, בטווח שבין 1 ל -10 μW ^20.
   הערה: הערכים המומלצים הם trade-off בין אות איתור נזקי לתאים. ראה הערת צעד 5.2.1 אחוז כוח ליזר ערכים אלה מתאימים.
7. התחל מדידת FCS ידי לחיצה על "התחל" (C החלון) "המדידה" החלון. אם מלבין התא משמעותי תחילת המדידה, כפי שזוהה על ידי ירידת העקבות העוצמת ידי יותר מ -30% במהלך 10 השניות הראשונות (דוגמא מוצגת באיור 3 א, פנל תחתון), לעבור לתא אחר ותחתון כוח לייזר למדידות בעתיד.
   1. אם האות לאיבוד, לשנות את הפוקוס של-בכיוון Z. לאחר המדידה היא מוחלטת, להשתמש בחלון "בקרת הסריקה" (איור 1, חלון B) כדי לבדוק את התא עדיין מרוכז וכי קרום התא נמדד. אם התא דואר עבר, לבטל את המדידה.
   2. בחלון האוטומטי המתאם שבו המדידה הוצג, בצע מחיקה ידנית חוזרים בודדים המכילים תמרוני התקרבות, לבנה, אשכולות גדולים, או ממצאים אחרים (ראה דוגמאות באיור 3). עושים זאת על ידי סימון אותם, לחיצה ימנית, ובחירת "מחק". שמור את הקובץ הסופי בפורמט .fcs. שמור לפחות ארבע חזרות לכל תא.
8. לחלופין, לרכוש תמונה של התא על החלק האמצעי (עם ההיקף הכולל של קרום גלוי) באמצעות חלון "בקרת סריקה". ללכוד את התמונה לאחר מדידת FCS כדי למנוע הלבנה. לחץ על כפתור ה "היחיד" כדי להתחיל את לכידת התמונה.
9. אם באמצעות "הוסף עמדה" עבור מיצוב מוקד FCS, לחץ על "סר עמדה" לפני שעברתי אל התא הבא.
10. שנה על aliquot חדש של תרחיף תאים לאחר לכל היותר 2 שעות המדידה לשמור על התאים throughou קיימאt הניסוי.

7. ניתוח FCS

1. פתח את קבצי .fcs בתוך תוכנה עם יכולת הולמת עקומה (ראה חומרים / ריאגנטים שולחן התוכנה בשימוש בפרוטוקול זה).
   הערה: תוכנת FCS שמגיעה עם מיקרוסקופ היא מקום טוב כדי להתוודע הולם בסיסי, אבל תוכנה נוספת יש צורך להתאים דיפוזיה קרום דו ממדים.
2. ראשית, לקבוע את גודל נפח עירור על ידי ניתוח המדידות fluorophore בחינם. התאם עקום דיפוזיה חינם 3-ממדי אל עקומות autocorrelation ^21.
   (Eq. 1)
   הערה: הגדרה של פרמטרים: N: אומרת מספר הגופים פלורסנט בהיקף המוקדים, τ (טאו): זמן קורלציה, τ _D (TauD): זמן מגורים ממוצע בהיקף המוקדים, T 1: הסתברות עבור fluorophores להיות מדינת השלישייה, τ T: זמן הרפיה עבור מעברי סינגלט-שלישייה, S: יחס בין גובה לרוחב בקוטר עבור נפח המוקד.
   1. חלץ TauD, את זמן המעבר של מולקולות להעביר את הפוקוס.
   2. השתמש מקדמי דיפוזיה TauD ופורסם ציין (D) של fluorophores המשמש לכיול ^{18, 19} כדי לחשב את רדיוס חריר (ω).
      (Eq. 2)
3. ניתוח של עקומות autocorrelation על קרום התא.
   1. כדי להמחיש את חלק מעקומת המייצג דיפוזיה מולקולרית, בחר מסגרת זמן החל לפני המדרון התלול של עקומת autocorrelation וכלה לאחר המפגשים להתעקם 1 (למשל, 0.001 ל 5 שניות עבור הקולטנים בעכברים, ראה איור 4).
   2. צור עקומת autocorrelation ממוצעת של חזרות הפרט הצילו in צעד 6.7.2.
   3. התאם עקום דיפוזיה קרום 2 ממדים לכל בממוצע עקומת autocorrelation באמצעות משוואת 3 ^3.
      (Eq. 3)
      הערה: פרמטרי פלט חשובים הן כדלקמן: N הוא המספר הממוצע של מולקולות המתגוררות בתוך אזור הקרום הנרגש. חישוב מחדש צפיפות (N / מיקרומטר ^2). _D τ (TauD): זמן מגורים ממוצע באזור המוקדים, מוגבל על ידי שני-הממדי של הקרום (ים). חישוב מחדש בזמן מגוריו ממוצעים מקדם דיפוזיה (מיקרומטר ² / sec) באמצעות רדיוס החריר הנחוש (ω) ואת המשוואה 2. T1 הוא ההסתברות עבור fluorophores להיות טריפלט. הבהירות (CPM) מחושבת על ידי חלוקת העצמה הכוללת הממוצעת של המדידה על ידי נ
   4. אם בכושר טוב אינו מושג בניסיון הראשון, לשנות את הערכים החל ו / או גבולות העליונים ותחתונים עבור המשתנים עד thiהים מושג.
      הערה: גבולות עליונים תחתונים אופייניים עבור שיעורי דיפוזיה חלבון בקרומי תאים עיקריים הם 10-500 msec עבור TauD, 0-100% עבור T1, ו 0.1-5 msec עבור TauT1. בחר החל ערכים עבור הולם באמצע במרווחים אלה. החלק של עקומת המייצגים תנודות הקרינה נגזר דיפוזיה ממוקם בדרך כלל בין 1 msec ו 1 שניות (ראה איור 4). בהתאם fluorophore, לפעמים לא יכולה להיות מתנת תהליך שנייה, והוליד autocorrelation בסקלות זמן קצר יותר מאשר פרמטר דיפוזיה. זו נגרמת על ידי מדינה כהה חולפת (שלישייה) או מהבהב (לעתים קרובות להתרחש חלבוני ניאון). מדינת שלישיית מטופלת במשוואה 3, ואת המודל המוצג וכך צריך גם מצביע על התאמה טובה במצבים אלה.

תוצאות

תוצאה אופיינית יפיק עקומת autocorrelation עם זמן המעבר בטווח של 10 מילי-שניות ל -400 מילי-שניות עבור חלבונים בממברנה. מספר מולקולות יכול להשתנות בין 0.5 ל סביב 200 לכל מיקרומטר ² עבור חלבונים הביע באופן אנדוגני. בדוק היטב כי CPM אינו נמוך מהצפוי. המשמעות יכולה להיות כי קיימת השפעה של אות הרקע. ככלל אצבע, האות CPM על תאים מקובל לניתוח לא צריך להיות נמוך מ -33% של ה- CPM עבור לשדר נוגדנים בחופשיות באותו כוח לייזר. ה- CPM צריך סולם ליניארי ...

דיון

פרוטוקול זה עבור FCS יכול לשמש להערכת דינאמיקה מולקולארית של מולקולות פני השטח על כל סוגי תאים חיסוניים (Murine, אדם, או מינים אחרים). אמצעי FCS במרחב ובזמן דינאמיקה מולקולארית עד רזולוצית מולקולה בודדת בתאים חיים. הצפיפות המולקולרית, וכן את דינמיקת קצב אשכולות דיפוזיה של החלבונים בעלי עניין, ניתן לחלץ מן עקומות autocorrelation.

תיוג פלורסנט הוא בעלת חשיבות מרכזית עבור ניסויי FCS מוצלחים. חלבונים של ריבית על קרום...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ערכת בידוד תאים MACS NK עכבר II	Miltenyi Biotec NordenAB	130-096-892	בחירה שלילית של תאי NK
סרום בקר עוברי	סיגמא-אדלריך	F7524
פוספט מומת בחום חוצץ מלח	-		תוצרת בית
מכון הזיכרון רוזוול פארק מדיום 1640	PAA חברת תרבית התאים	E15-848	בינוני שקוף
2.4G2	תרמו פישר סיינטיפיק	553140	לחסימת קולטני FC.
נוגדן אנטי-Ly49A			נוגדן חד שבטי המיוצר בבית ומצומד בבית ל-Alexa fluor 647
Clone JR9.318
נוגדן נגד H-2Dd	BD Pharmingen	558915	מצומד בבית ל-MFP488
Clone 34.5.8S
MFP488	Mobiotech	MFP-A2181	צבע פלואורסצנטי לצימוד נוגדנים.
פולי-ליזין	סיגמא-אולדריץ'	P8920	מדולל במים מזוקקים (1.10)
פולי-ליזין (20 kDa) מושתל בפוליאתילן גליקול (2 kDa)	SuSoS AG	PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)	מדולל ב-PBS (pH 7.4) עד 0.5 מ"ג/מ"ל.
רודמין 110 כלוריד	סיגמא-אולדריץ'	432202	מקדם דיפוזיה ידוע: 3.3 פעמים; 10 ומינוס; 10 m2/sec 19
Alexa fluor 647	Thermo Fisher Scientific	A20006	מקדם דיפוזיה ידוע: 4.4 & פעמים; 10 ומינוס; 10 m2/sec 20
מיקרוסקופ קונפוקלי	Zeiss	LSM510
תוכנה: Confocor 3	Zeiss
תוכנה: Matlab עם ארגז כלים מתאים עקומה	Matlab	גרסת R2013b
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass	תרמו-מדעי	155411	8 בארות, 1.0 תחתית בורוסיליקט