הערכה לא פולשני של תפקוד האנדותל בבני אדם יכולה להיקבע על ידי טכניקת התרחבות בתיווך הזרימה. למרות אלפי מחקרים השתמשו בטכניקה זו, אף מחקר לא ביצע את הטכניקה הזאת הלא פולשני בחולדות. המאמר שלהלן מתאר מדידה לא פולשנית של התרחבות זרימה בתיווך של הזרוע ועורקי ירך שטחית של חולדות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הערכת אולטראסאונד של זרימה על ידי מתווך התרחבות של הזרוע ועורקי ירך שטחיים אצל חולדות
במאמר זה
סיכום
תקציר
הרחבת כלי הדם העורקיים לעלייה בקצב גזירת הדופן מעידה על תפקוד האנדותל של כלי הדם. בבני אדם, ניתן להשיג את המדידה הלא פולשנית של תפקוד האנדותל על ידי שימוש בטכניקת הרחבה מתווכת זרימה, המבוצעת בדרך כלל בעורק הירך הברכיאלי או השטחי. בקצרה, שרוול לחץ דם הממוקם דיסטלי לבדיקת אולטרסאונד מנופח ללחץ סופרסיסטולי, מה שגורם לאיסכמיה בגפיים. לאחר 5 דקות של חסימה השרוול מתרוקן, וכתוצאה מכך היפרמיה תגובתית ועלייה בקצב גזירת הדופן המאותתת על מולקולות מרחיבות כלי דם להשתחרר מהאנדותל ומעורר הרחבת כלי דם. למרות אלפי המחקרים שביצעו התרחבות מתווכת זרימה בבני אדם, באופן מפתיע, אף מחקר לא ביצע טכניקה זו באופן לא פולשני בחולדות חיות. בהתחשב בשינוי האחרון במיקוד למחקר תרגומי, קביעת הנחיות למדידה לא פולשנית של התרחבות בתיווך זרימה בחולדות ומכרסמים אחרים תהיה בעלת ערך רב. במאמר הבא מוצג פרוטוקול למדידה לא פולשנית של התרחבות בתיווך זרימה בעורקי הירך הברכיאליים והשטחיים של חולדות, שכן אתרים אלה נמדדים לרוב בבני אדם.
מבוא
האנדותל של כלי הדם הוא בשכבה הסלולר המרפדת את לומן של העורקים הוא וסת חשוב של תפקוד כלי הדם. יש מולקולות רבות שוחררו מבית האנדותל שתוצאתן אפנון של קוטר כלי דם. בין המולקולות האלה, תחמוצת חנקן (NO), נראה כי מולקולת vasodilatory העיקרית שוחררה מן האנדותל של כלי הדם בתגובה לגירוי (למשל, אינסולין, אצטילכולין, או שינויי מאמץ גזירה) 1. בשנת האנדותל של כלי הדם, NO מיוצר על ידי האנזים אנדותל synthase NO (eNOS), והוא שוחרר לאחר מכן מתאי אנדותל 2. NO מפזר על שריר חלק בכלי הדם שם הוא גורם כלי הרפיה וגדילה בקוטר 3.
תפקוד האנדותל ניתן להעריך הלא פולשני בבני אדם באמצעות התרחבות בתיווך זרימת 4,5 טכניקה (FMD). FMD הוצע לייצג מבדק פונקציונלי האנדותל הנגזרNO הזמינות הביולוגית אצל בני אדם, נבחנת בדרך כלל על הזרוע או עורק הירך שטחית בתגובה hyperemia תגובתי הבאה איבר ~ 5 דקות חסימה 6. Hyperemia הריאקטיבי מגביר כוחות גזירה למינרית כי הם transduced אל תא האנדותל 7, מאותת על שחרורו של NO 8. אמנם בשנים האחרונות, חלקם של התרחבות ביוזמת אין לשחרר כבר התווכח 9,10, FMD מעיד על התרחבות האנדותל תלוי הוכח באופן עקבי לחזות אירועים קרדיווסקולריים 11-13.
נכון להיום, אלפי מחקרים מועסקים הטכניקה FMD למדידה לא פולשנית של תפקוד האנדותל אצל בני אדם. בהתחשב במשמרת האחרונה בפוקוס מחקר translational, הנחיות באשר לאופן מדיד לא פולשנית של FMD במכרסמים תהיינה יקרות מאוד. שמירה עם גישה translational, פרוטוקול זה הוקם למדידת FMD ב הזרוע ואת Supeעורקי ירך rficial של חולדות, כמו באתרים אלה ביותר נמדדים בדרך כלל אצל בני אדם. תוצאות פרוטוקול זה בתגובת FMD חזקה דיר בחולדות, לעומת זאת, מדידת FMD בחולדות הן תובענית מבחינה טכנית עלולה להיות קשה עבור חוקרים אחרים לשכפל בלי הפגנת וידאו. לכן, במאמר הבא ידגים שיטת למדידת לא פולשנית של FMD של הזרוע ועורקי ירך שטחית של חולדות.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
נהלי כל החיה תאמו את המדריך לטיפול והשימוש בחי המעבדה 14 ואושרו על ידי האוניברסיטה של יוטה בסולט לייק סיטי לענייני ותיקי מרכז רפואי בבעלי חיים לטיפול ושימוש.
1. הכנת בעלי חיים
- מניחים חיה בתא הרדמה אינדוקציה המכיל 3% isoflurane ב 100% חמצן. להשאיר את החיה בחדר האינדוקציה עד שהוא מגיב לגירויים חיצוניים.
- הסר את החיה מן חדר האינדוקציה ומניח אותו על שולחן בדיקה מחומם מצויד אלקטרודות רל (אק"ג). לשמור על הרדמה ב 3% isoflurane ב 100% חמצן. זרוע ושטחי ירך העורקת FMD לא ניתן לבצע בו זמנית. לפיכך, הוראות הכנות לכל מדידה מפורטות להלן.
2. הכנת עורק הזרוע
- מקם את פרקדן החיה ולרסן הגפה השמאלית העליונה וכל גפיים תחתונים שלimal לשולחן בדיקה בעזרת פלסטר.
- לרסן את האיבר הימני העליון של החיה, כך את החלק התחתון של הגפיים העליונים הוא מוגבה מעט (~ סנטימטר 0.2-0.5) מעל הרציף.
- החל סוכן מקריח (למשל, Nair) על הגפה העליונה הימנית של בעלי החיים כדי להסיר שיער.
- למקם השרוול חסימה (10 מ"מ לומן occluder וסקולרית תקן קוטר) על דיסטלי הגפה העליונה הזכות המרפק. אין להניח את occluder על הרציף, כמו אינפלציה / דפלציה תעביר את האיבר ומפריעה הדמית אולטרסאונד.
- להגדיר את המכשיר אולטרסאונד במצב B באמצעות המקלדת אולטרסאונד.
- למרוח כמות קטנה של ג'ל אולטרסאונד על הגפה העליונה של החיה, הפרוקסימלי שרוול החסימה.
- ידני ליישר מתמר מערך ליניארי תדר אולטרה גבוה המצורפת לבעל stereotactic עם הגפה העליונה. עורק הזרוע צריך להיות גלוי 2-3 מ"מ עמוק.
- כדי לאשר כי עורק הזרוע, לא וריד הזרוע, הוא להיותצילמו, לעבור למצב PW באמצעות המקלדת אולטרסאונד. העורק יהיה זרימת דם pulsatile בניגוד הווריד הסמוך אשר תהיה זרימת דם רציפה.
3. הכנת עורקים שטחי ירך
- מקם את פרקדן החיה ולרסן את הגפיים העליונים ואת האיבר השמאלי תחתון אל שולחן הבדיקה בעזרת פלסטר.
- לרסן את זכות גפיים תחתונים של החיה בעמדה מוגבהת (~ 0.5-1 סנטימטר) מעל הפלטפורמה באמצעות כרית (למשל, מגבות נייר מקופלות).
- החל סוכן מקריח (למשל, Nair) על גפיים תחתונים של ימין החיה להסרת שיער. לאחר הסרת שיער וריד הירך צריך להיות בבירור על הירך הפנימית העליונה.
- למקם השרוול חסימה (10 מ"מ לומן occluder וסקולרית סטנדרטי בקוטר) הפרוקסימלי הקרסול הימני. אין להניח את occluder על הרציף, כמו אינפלציה / דפלציה תעביר את הגפיים התחתונים ומפריעה הדמית אולטרסאונד.
- להגדיר את מכשיר אולטרסאונדB-mode.
- למרוח כמות קטנה של ג'ל אולטרסאונד על הגפיים התחתונים של החיה, הפרוקסימלי שרוול החסימה.
- ידני ליישר מתמר מערך ליניארי תדר אולטרה גבוה המצורפת לבעל stereotactic עם וריד הירך, שהוא נראה לעין מבעד לציפוי. עורק הירך השטחי צריך להיות גלוי <1 מ"מ עמוק.
- כדי לאשר כי עורק הירך השטחי, לא וריד הירך, מתבצע הדמיה, לעבור למצב PW. העורק יהיה זרימת דם pulsatile בניגוד הווריד הסמוך אשר תהיה זרימת דם רציפה.
4. שלב Baseline
- למטב את התמונה B-mode, בדומה לאופן בו הדבר ייעשה בבני אדם 15. ודא תמונה אופקית, אורך של הכלי עם תקשורת-אינטימה דמיינה בשני הכתלים הוא ציין. מטב את התמונה על ידי התאמת מיקום בדיקת אולטרסאונד מעט על מנת להבטיח כי כמו הרבה של העורק ככל האפשר ניתן לצפייה בחלון ללכוד.
- לחלופין, לשנות את גדרות אולטרסאונד כדי לקבל תמונה טובה יותר על ידי שינוי בהירות / ניגודיות, אזורי מוקדים, תדירות, טווח דינמי, וצפיפות קו. ישנן דרכים אחרות כדי למטב את תמונת אולטרסאונד, אך תיאור מפורט של אלה הם מעבר להיקף של פרוטוקול זה.
- אחרי אופטימיזציה של דימויים עורקים, להדליק-gating א.ק.ג. להציג תמונות בלבד שנתפסו במשך-גל R כדי להבטיח שרק מסגרת בקוטר אחד נאספת הם במהלך כל מנה הדיאסטולי של מחזור לב.
הערה: א.ק.ג.-gating נגיש מכונת אולטרסאונד להשתמש בפרוטוקול זה על ידי בחירת א.ק.ג.-gating תחת אפשרות הגדרות הפיזיולוגיות, עם זאת, ייתכן שתכונה זו לא תהיה זמינה בכל מכונות אולטרסאונד. א.ק.ג.-gating צריך להיות מופעל לאחר התמונה ממוטבת, כמו שקשה להשיג תמונת מסגרת חליפין נמוכים (כלומר, פעם אחת לכל-גל R). ללא א.ק.ג.-gating, השילוב של קצב לב גבוה אצל חולדות דרישה של מסגרת גבוההשיעור ללכוד את החלק הדיאסטולי של מחזור הלב מאפשר רק עבור ~ 10-20 קליפים שניים. גודל מסורבל כמות הנתונים בכל קליפ מגביר את העומס ניתוח משמעותי. - שיא 60 שניות על בסיס נתוני שימוש במצב B.
הערה: מכשיר אולטרסאונד תמיד מקליט, לעומת זאת, לא כל התמונות מאוחסנות על מכונת אולטרסאונד, כפי שיש מגבלה על מספר המסגרות שניתן נרשמת קליפ אולטרסאונד. אורך קליפ (כלומר, מספר המסגרות) ניתן לכוונן את ההגדרות. זה מוצע לקבוע עבור מספר מרבי של פריימים קליפ. כאשר ההקלטה תהיה בסוף קליפ (כלומר, מספר מרבי של מסגרות הגיע), ההקלטה נמשכת, אבל הקליפ גלגולים קדימה לכיד המסגרות האחרונה. במקרה זה, מוקדם יותר מסגרות כי נתפסו מחוץ לגבול מסגרת מקסימלית נמחקות לאחר מכן. בעוד המורכבויות הללו בהקלטה שונה בין מכונות, התאמת אורך הקלטה עשויה להיות נחוצה. - Swiטצ אל מצב PW. מניחים את הסמן באמצע לומן. שערים לדוגמא תוצבנה באופן אוטומטי בהתייחס הסמן, אך ניתן להתאימו עבור רוחב בעזרת מקלדת אולטרסאונד. לשמור בזווית insonation של ≤60 °.
- התאם את זווית insonation על ידי שינוי זווית קורה דופלר. לבצע התאמות בסדר לזווית באמצעות מקלדת אולטרסאונד. אם אפשרויות אלו אינן מספקות זווית מתאימה למדידה, באופן ידני להתאים הבדיקה אולטרסאונד על ידי הטיית העורק לזווית אופטימלית יותר. אם התאמה כלשהי של זווית אולטרסאונד מבוצע, לשחזר תמונות B-mode.
- שיא של 10 שניות של נתונים מהירים.
5. ספיגת שלב
- לנפח את occluder וסקולרית באמצעות מזרק אוויר מלא 10 מ"ל. כדי לשמור קבוע בלחץ האוויר occluder וסקולרית, לקפל את הצינור על עצמו ולמקם קליפ קלסר על צינור מקופל.
- Switch to-mode PW לאשר חסימת שרוול, כפי שמעידירידה גדולה מהיר דם.
- Switch to נתוני B-mode ולהקליט 60 קליפים שניים, עד 04:45 דק 'של חסימה.
- Switch to-mode PW. לשמור תיעוד של קצב הלב ואת הזמן של כל קליפ אולטרסאונד לניתוח.
6. Hyperemic שלב
- שחרר את השרוול בעת ההקלטה ב-מצב PW ידי הסרת קליפ קלסר מהצינור מקופל. שיא 5 שניות לפני ו -5 שניות לאחר שחרור השרוול.
- Switch to נתוני B-mode ולהקליט 60 קליפים שניים עד 3 דקות לאחר חסימה. לשמור תיעוד של קצב הלב ואת הזמן של כל קליפ אולטרסאונד לניתוח.
- לאחר השלמת FMD ולהסיר את החיה מהשולחן בדיקה וניטור עד שב להכרתו מספיק כדי לשמור שכיבה sternal.
ניתוח 7.
- לניתוח, אולטרסאונד יצוא כקובצי DICOM אל המחשב מחובר המצוידים בתוכנת קצה-זיהוי, המאפשר משוחדת להרתיעmination בקוטר העורק בכל מסגרת. ניתוח אפשרי על מכונת אולטרסאונד, לעומת זאת, זה לא מומלץ, כפי שהוא מאוד זמן אינטנסיבי ובכפוף ההטיה חוקרת.
- ניתוח נתונים בקוטר עורק ב -60 מקטעים שניים בשלב מחקר ולאחר חסימה, ובשנת 10 קטעים שניים בשלב hyperemic.
- ניתוח נתונים מהירים דם באמצעות יכולות ניתוח תזרים של תוכנת קצה-זיהוי האוטומטי. לקבוע מהירויות דם ממוצעות ידי מדידת 5 או יותר גל רצוף של מראה אחיד במהלך שלבי מחקר ולאחר חסימה. לקבוע מהירויות דם ממוצעות במהלך hyperemia תגובתי עבור מהירויות דם מייד לאחר שחרור שרוול. צורת הגל עם מהירויות דם גבוהות נחשבת מהיר דם שיא.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
תזרים בתיווך ההתרחבות בוצעה על הזרוע ועצם ירך שטחי של 8 חולדות Wistar. מיצוב של עכברוש מוצג באיור 1.
תמונות אולטרסאונד נציג של עורק הירך השטחי מוצגות באיור 2.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
במחקר הנוכחי, מדידה לא פולשנית של FMD הייתה הפגינו הזרוע ועורקי ירך שטחיים של חולדות. בדומה לבני אדם 6, לאחר תקופת חסימה 5 דקות, חלה עלייה מהירה מהיר דם (כלומר, hyperemia תגובתי) ובכך להגדיל שיעור גזירה על דפנות העורקים אשר הביאו ההתרחבות הבאה של העורק. FMD נצפתה הוא הזרוע ועורקי ירך שטחית. בנוסף, קיים קשר חזק בין FMD העורק. למרות שיעור גזירת שיא היה גבוה בעורק הירך השטחי, FMD מנורמל לשיא שיעור גזירה שומר על קשר חזק בין עורקים. יחד, תוצאות אלה מצביעות על כך המדידה הבלתי...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תודות
כל הדמיית בעלי החיים בוצעה במתקן הליבה להדמיה של בעלי חיים קטנים, אוניברסיטת יוטה.
מחקר זה מומן בחלקו על ידי מענקים מהמכונים הלאומיים לבריאות (R21 AG043952, R01 AG040297, K01 AG046326, K02 AG045339 ו-R01 DK100505).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Vevo 2100 מערכת הדמיה מיקרו-אולטרסאונד ברזולוציה גבוהה | VisualSonics, טורונטו, ON, CAN | ||
| MicroScan מתמר מערך ליניארי בתדר גבוה במיוחד - MS-700 30-70 מגה-הרץ | VisualSonics, טורונטו, ON, CAN | ||
| Vevo תחנת הדמיה | VisualSonics, טורונטו, ON, CAN | ||
| מחמם ג'ל תרמי | מעבדות פרקר, פיירפילד, ניו ג'רזי, ארה"ב | 82-03 | קרם |
| אלקטרודות Signacreme | Parker Laboratories, פיירפילד, ניו ג'רזי, ארה"ב | 17-05 | |
| סרט כירורגי Transpore | 3M, מייפלווד, מינסוטה, ארה"ב | 1527-1 | |
| קרם אפילטורי (למשל , Nair) | אספקה | ||
| כללית צמר גפן | אספקה | ||
| ג'ל אולטרסאונד | אספקה כללית | ||
| אוטם כלי דם סטנדרטי, קוטר לומן 10 מ"מ | מנגנון הרווארד, הוליסטון, MA, ארה"ב | 62-0115 | |
| מזרק 10 מ"ל עם קצה Luer-Lok | אספקה | משמש למנגנון שרוול חסימה | |
| מהדק נייר | אספקה | משמש למנגנון שרוול חסימה | |
| מחט היפודרמית – 18 מד | אספקה | משמש למנגנון שרוול חסימה | |
| קליפ קלסר בינוני | אספקה | משמש למנגנון שרוול חסימה |
מקורות
- Smits, P., et al. Endothelial release of nitric oxide contributes to the vasodilator effect of adenosine in humans. Circulation. 92, 2135-2141 (1995).
- Forstermann, U., et al. Nitric oxide synthase isozymes. Characterization, purification, molecular cloning, and functions. Hypertension. 23, 1121-1131 (1994).
- Gardiner, S. M., Compton, A. M., Bennett, T., Palmer, R. M., Moncada, S. Control of regional blood flow by endothelium-derived nitric oxide. Hypertension. 15, 486-492 (1990).
- Harris, R. A., Nishiyama, S. K., Wray, D. W., Richardson, R. S. Ultrasound assessment of flow-mediated dilation. Hypertension. 55, 1075-1085 (2010).
- Corretti, M. C., et al. Guidelines for the ultrasound assessment of endothelial-dependent flow-mediated vasodilation of the brachial artery: a report of the International Brachial Artery Reactivity Task Force. J Am Coll Cardiol. 39, 257-265 (2002).
- Celermajer, D. S., et al. Non-invasive detection of endothelial dysfunction in children and adults at risk of atherosclerosis. Lancet. 340, 1111-1115 (1992).
- Niebauer, J., Cooke, J. P. Cardiovascular effects of exercise: role of endothelial shear stress. J Am Coll Cardiol. 28, 1652-1660 (1996).
- Sessa, W. C. eNOS at a glance. J Cell Sci. 117, 2427-2429 (2004).
- Wray, D. W., et al. Does brachial artery flow-mediated vasodilation provide a bioassay for NO? Hypertension. 62, 345-351 (2013).
- Green, D. J., Dawson, E. A., Groenewoud, H. M., Jones, H., Thijssen, D. H. Is flow-mediated dilation nitric oxide mediated? A meta-analysis. Hypertension. 63, 376-382 (2014).
- Green, D. J., Jones, H., Thijssen, D., Cable, N. T., Atkinson, G. Flow-mediated dilation and cardiovascular event prediction: does nitric oxide matter? Hypertension. 57, 363-369 (2011).
- Brevetti, G., Silvestro, A., Schiano, V., Chiariello, M. Endothelial dysfunction and cardiovascular risk prediction in peripheral arterial disease: additive value of flow-mediated dilation to ankle-brachial pressure index. Circulation. , 2093-2098 (2003).
- Gokce, N., et al. Predictive value of noninvasively determined endothelial dysfunction for long-term cardiovascular events in patients with peripheral vascular disease. J Am Coll Cardiol. 41, 1769-1775 (2003).
- National Research Council (U.S.). Guide for the care and use of laboratory animals. , 8th, National Academies Press. (2011).
- Alley, H., Owens, C. D., Gasper, W. J., Grenon, S. M. Ultrasound assessment of endothelial-dependent flow-mediated vasodilation of the brachial artery in clinical research. J Vis Exp. , e52070(2014).
- Ghiadoni, L., et al. Assessment of flow-mediated dilation reproducibility: a nationwide multicenter study. J Hypertension. 30, 1399-1405 (2012).
- Thijssen, D. H., et al. Heterogeneity in conduit artery function in humans: impact of arterial size. Am J Physiol Heart Circ. 295, H1927-H1934 (2008).
- Green, D. J., et al. Why isn't flow-mediated dilation enhanced in athletes? Med Sci Sports. 45, 75-82 (2013).
- Heiss, C., et al. In vivo measurement of flow-mediated vasodilation in living rats using high-resolution ultrasound. Am J Physiol Heart Circ. 294, H1086-H1093 (2008).
- Chen, Q., et al. Pharmacological inhibition of S-nitrosoglutathione reductase improves endothelial vasodilatory function in rats in vivo. J Appl Physiol. 114, 752-760 (2013).
- Pinnamaneni, K., et al. Brief exposure to secondhand smoke reversibly impairs endothelial vasodilatory function. Nicotine Tob Res. 16, 584-590 (2014).
- Liu, J., et al. Impairment of Endothelial Function by Little Cigar Secondhand Smoke. Tob Regul Sci. 2, 56-63 (2016).
- Schuler, D., et al. Measurement of endothelium-dependent vasodilation in mice--brief report. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34, 2651-2657 (2014).
- Erkens, R., et al. Left ventricular diastolic dysfunction in Nrf2 knock out mice is associated with cardiac hypertrophy, decreased expression of SERCA2a, and preserved endothelial function. Free Radic Biol Med. 89, 906-917 (2015).
- Harris, S. A., Billmeyer, E. R., Robinson, M. A. Evaluation of repeated measurements of radon-222 concentrations in well water sampled from bedrock aquifers of the Piedmont near Richmond, Virginia, USA: : effects of lithology and well characteristics. Environmental research. 101, 323-333 (2006).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
