מאמר שיטה

מערכת תרבית תאי זיהומיות וירוס זיקה ואת

20.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54767

⸱

23 באוגוסט 2016

 , 
1Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 2Department of Surgery, Cedars-Sinai Medical Center, 3Department of Surgery, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

במאמר זה

סיכום

Zika Virus (ZIKV), פתוגן מתפתח, קשור להפרעות התפתחותיות בעובר ולמיקרוצפליה. הקמת מערכת תרבית תאים זיהומית יעילה היא חיונית למחקרים על שכפול ZIKV כמו גם לפיתוח חיסונים ותרופות. במחקר זה מומחשות ונדונות בדיקות וירולוגיות שונות הנוגעות לזיק"ו.

תקציר

וירוס הזיקה (ZIKV) הוא פתוגן מתעוררים מקושר ליקויים התפתחותיים בעובר כגון מיקרוצפליה, פגמי עין, וצמיחה לקויה. ZIKV הוא וירוס RNA של המשפחה Flaviviridae. ZIKV מועבר בעיקר על ידי יתושים, אבל יכול גם להיות מופץ על ידי אימהי העברה אנכית עוברת וכן מגע מיני. נכון להיום, לא קיימות אופציות טיפול או חיסון אמין זמינות להגן על אלה שהנגיף יחדור. פיתוח מערכת תרבית תאי זיהומיות וירוס לשחזור, יעיל Zika הוא קריטי לחקר המנגנונים המולקולריים של שכפול ZIKV וכן פיתוח תרופות חיסון. בהקשר זה, פרוטוקול המתאר מערכת התרבות יונקים מבוססי תאים במבחנה Zika וירוס לניתוח בייצור ובצמיחה ויראלי מדווח כאן. פרטים על היווצרות הפלאק על ידי וירוס Zika על monolayer תא ורובד assay למדידת כייל הנגיף מוצגים. קינטיקה שכפול הגנום ויראליביניים replicatory הגנום RNA פעמיים תקועים נחושים. פלטפורמה תרבות זו נוצלה למסך נגד ספריה של קבוצה קטנה של ציטוקינים וכתוצאה מכך לזיהוי-α אינטרפרון (IFN-α), IFN-β ו- IFN-γ כמו מעכבים חזקים של גדילת ויראלי Zika. לסיכום, במבחנת מערכת תרבות ויראלית מדבקת Zika מבחני virological שונים הם הפגינו במחקר זה, אשר יש לו את הפוטנציאל למען קהילת המחקר מאוד הבהרה נוספת המנגנונים בפתוגנזה ויראלי ואת האבולוציה של ארסיות ויראלי. אנטי IFN-alpha ניתן להעריך עוד יותר כאמצעי מניעה מניעתי, שלאחר החשיפה, אפשרות טיפול עבור נגיף Zika באוכלוסיות בסיכון גבוה, כולל בנשים הרות שנדבקו במחלה.

מבוא

וירוס הזיקה (ZIKV) הוא פתוגן אדם חשוב הקשורות מיקרוצפליה והריון עניים ותוצאות 1,4. ZIKV שייך הסט של flaviviruses רלוונטי מבחינה רפואית שיכולה לגרום למומים נוירולוגיות כגון דנגי, קדחת הנילוס המערבי, ווירוסים אנצפליטיס בסנט לואיס. המצב העיקרי של שידור ויראלי הוא על ידי וקטור היתוש Aedes aegypti, ובנוסף, העברה מינית גם דווחה 5,6. ZIKV הפך לנושא בריאות הגלובלי גדול בשל ההתפלגות הגיאוגרפית הנרחב של וקטור יתושי הקשר החזק שלה עם מומים מולדים. ZIKV בודד לראשונה בשנת 1947 מקוף רזוס הזקיף ביער Zika, אוגנדה והתיק הראשון של האדם דווחו בשנת 1952 7,8. אנשים כי להידבק ZIKV הנוכחי עם סימפטומים קלים כגון חום, פריחה, כאבי ראש, דלקת הלחמית, ושרירים / כאבי פרקים. אינפקטד נשים בהריון יכולים לשדר ZIKV לעובר המתפתח 1. Zזיהום IKV גם נקשר תסמונת גיאן-בארה, demyelination אוטואימוניות עצבים היקפיים הפרעת 9.

הגנום הויראלי Zika מורכב במובן החיובי, מולקולת רנ"א חד-גדילי שזה בערך 10.8 kilobases באורך. מבנה הגנום מאורגן כמו 5'NCR-C-PRM-E-ns1-NS2A-NS2B-ns3-NS4A-2K-NS4B-NS5-3'NCR, עם אזורים קידוד אי (NCR) איגוף אזור המקודדים חלבונים 6. Polyprotein יחיד (3419 אא) מתורגם כי הוא שיתוף ופוסט translationally ביקע ל -10 פפטידים קטנים. הן 5'NCR ומבני לולאת גזע 3'NCR RNA לשחק תפקיד קריטי תחילתו של תרגום הגנום נגיפי ושכפול. הרכיבים המבניים של הגנום מורכבים של קפסיד, קרום, וחלבוני מעטפה. החלבונים הלא המבניים הם קריטיים עבור שכפול הגנום.

נכון לעכשיו, זני הנגיפים Zika מקובצים לשלוש גנוטיפים עיקריים: אפריקה המערביתבמזרח, אפריקה, ואסיה 6,10-13. הוצע כי שושלת מזרח אפריקה התפשטה במערב אפריקה ואסיה, שם הוא מאוחר יותר התפתח 12. הגנוטיפ אסיה אחראי ההתפרצויות הנוכחיות ביבשת אמריקה. וירוס הזיקה יכול להיות מתורבת בשני יתושים בתאי יונקים. פיברובלסטים עורי ראשיים, תאים דנדריטים בשלים, ובתאים עצביים בקליפת המוח, ותאי Vero חשופים לסכנת הדבקה ויראלית Zika 10,14,15. סוג I וסוג שני II אינטרפרונים הוכחו להגביל את שיעור הגידול ZIKV ב fibroblasts העור 15. המטרות של מחקר זה הן לספק פרוטוקול צעד חכם, מפורט לייצור assaying של PRVABC59 זן ויראלי Zika גנוטיפ אסיאתית מערכת תרבית תאים יונקת וכדי להדגים את התועלת של מערכת התרבות זיהומיות זו כפלטפורמה לפיתוח תרופות. משאב זה הוא בעל פוטנציאל תועלת רב קהילת המחקר ויראלי ונוירולוגיות Zika להבהיר עוד iמנגנוני ts של בפתוגנזה ואבולוציה ויראלי של ארסיות ויראלי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: מתאר סכמטי של זרימת העבודה מוצג באיור 1.

1. תאים

  1. השתמש בתאי Vero לייצור וירוס זיקה וניתוח של מחזור שכפול נגיפי.
  2. הכן התקשורת צמיחה מלאה המכילה 10% בסרום שור העובר (FBS), 2 מ"מ L- גלוטמין, פניצילין (100 יחידות / מ"ל), סטרפטומיצין (100 יחידות / מ"ל), ו -10 מ"מ HEPES.
  3. תרבות תאי Vero עם מדיום הגידול להשלים שצוין על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2.

2. הפקת וירוס Zika

  1. קציר תאי Vero ב 80% צפיפות תאים באמצעות טריפסין 0.25% ב בקבוק T-75 לספור את התאים.
    1. לשאוב התקשורת מהבקבוק תרבות T-75 ולשטוף את התאים עם 2 מ"ל בופר פוספט (PBS).
    2. הוסף 2 מ"ל של טריפסין 0.25% ו דגירה את הבקבוק על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    3. הוסף 8 מ"ל של סרום המכיל מדיום הגידול כדי להשבית טריפסין. Pipet מעלה ומטה כדי susתאים pend ולהעביר את התאים צינור 15 מ"ל.
    4. הסר 10 μl של תאים ומערבבים עם כמות שווה של כחול 0.4% trypan. טען את התערובת המוכנה השקופית הקאמרית ספירת תאים ולקבל תא קיימא ספירה באמצעות דלפק תא אוטומטי.
  2. זרעים סך של 7 מיליון תאים בנפח 30 מ"ל לתוך בקבוק T-160.
  3. למחרת, להכין ריבוי המתאים של זיהום (0.01 כדי 0.1 משרד הפנים) של הבידוד וירוס Zika בתוך התקשורת והתרבות חינם 10 מ"ל סרום לכל בקבוק.
  4. הסר את המדיה בילה מהבקבוק T-160 ולאחר מכן להוסיף את הבידוד ויראלי מוכן טרי (10 מ"ל).
  5. דגירת הצלוחיות המחוסנות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 עבור 4-6 שעות. מורחים את הבידוד על ידי הטיית צלוחיות בעדינות הצידה בכל שעה.
  6. בסיום הדגירה, להחליף את הבידוד עם תקשורת צמיחת סרום בתוספת חמה (30 מיליליטר) עבור כל בקבוק. ואז להמשיך את התרבות הנגיף למשך 96 שעות הקרובות.
  7. בדוק את ההתקדמות בfection על ידי התבוננות במראה של רובד נגיפי על monolayer התא באמצעות מיקרוסקופ לעומת שלב ולקחת תמונות (איור 2) על פי הצורך בהגדלה 40X ו 200X.

figure-protocol-1
איור 2:. הפלאק נוצר על ידי וירוס Zika על monolayer של תאי Vero תמונות שדה מוארות של בהגדלה שונה מראות רובד נגיפי זיקה ב -48 HPI. הערת הנוכחות של מוקדי תאים מעוגלים על monolayer. (סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר) אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

  1. supernatants תרבית תאים קציר בנקודת 96 שעות זמן בצנטריפוגה supernatant XG ב 300 במשך 10 דקות ב 4 ° C כדי להסיר פסולת התא.
  2. מוציאים בזהירות את supernatant מבלי פסולת pelleted מטריד והעברת to 15 מ"ל צינורות. Ultracentrifugation ב 24,000 XG יכול להתבצע להתרכז חלקיקים נגיפיים (אופציונלי).
  3. אחסן את supernatants תרבות ויראלי aliquots המרובה ב -80 מעלות צלזיוס.

3. כייל הנגיף Zika מדידת ידי assay פלאק

  1. זרע נאיבי תאים Vero ב 1 x 10 5 תאים לכל היטב 2 מ"ל נפח באמצעות צלחת 12-היטב.
  2. למחרת, להכין פי 10 דילולים סידוריים של supernatants התרבות ויראלי שנאסף מבקבוק T-160 באמצעות סרום ללא מדיה. הסר את המדיה בילתה מבאר כל ולהוסיף 400 μl של בידוד מוכן על תאי Vero בשלושה עותקים.
  3. דגירת הצלוחיות המחוסנות ב 37 ° C עם 5% CO 2 עבור 4-6 שעות. מורחים את הבידוד על ידי הטיית הצלחת בעדינות הצידה בכל שעה אחת.
  4. בסוף הדגירה, להחליף את הבידוד עם תקשורת בסרום השלים (2 מיליליטר לכל טוב).
  5. בשעה 48 שעות חיסון פוסט, לספור את מוקדי ויראלי באמצעות contr שלבמיקרוסקופ אס '. חשב את כייל הנגיף כיחידות פלאק ויוצרים (PFU) לכל מ"ל. ראה איור 3 עבור assay פלאק.
  6. תיקון ו להכתים את התאים ב 4% פורמאלדהיד פתרון סגול קריסטל 0.1% מוכנים באתנול 20% להדמיה ברורה של הפלאק.

4. Assay שכפול הגנום ויראלי Zika

  1. זרע נאיבי תאים Vero ב 1 x 10 5 תאים לכל היטב 2 כרכים מ"ל באמצעות צלחת 12-היטב. למחרת, להכין inocula ויראלי (משרד הפנים של 0.01 ו -0.1; 400 μl / טוב) של כייל נמוך וגבוה באמצעות תקשורת חופשית בסרום בשלושה עותקים. עבור זיהום מדומה, השתמש תקשורת חופשית בסרום (400 μl / טוב) בלבד.
  2. חזור על השלבים 3.2 כדי 3.4.
  3. בנקודות זמן hr 48 ו -96, לאסוף דגימות עבור רנ"א immunocytochemistry (ICC).
    1. לקבלת דוגמיות RNA קציר, להסיר את המדיה ולאחר מכן להוסיף 400 μl של פתרון תמוגה ישירות היטב כל לאסוף את lysates.
    2. עבור כאל, להסיר את המדיה ואת tתרנגולת לתקן את התאים על ידי הוספת 1 מ"ל של מתנול זה היטב דגירה את הצלחת ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    3. מן lysate התא, לבודד RNA הכולל באמצעות ערכת בידוד RNA לפי הוראות היצרן. לכמת את RNA באמצעות ספקטרופוטומטר.
  4. בצע שעתוק לאחור שני שלבים PCR כמותי (RT-qPCR) כדי לקבוע את תוכן הגנום ZIKV מ- RNA שנקטפו.
    1. להיפוך לתמלל את RNA, הראשון להקים תערובת התגובה 13 μl המורכב של 5 מיקרוגרם של RNA בודד, 1 μl של dNTPs (10 מ"מ), ו 1 μl hexamer אקראי (250 ng) בצינור 0.2 מ"ל. דגירת הצינור ב 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ולאחר מכן למקם אותו על קרח למשך דקה אחת. בהמשך לכך, להוסיף 1 μl של transcriptase הפוכה, 4 μl של חיץ סינתזה גדיל 5x, 1 μl של 0.1 M dithiothreitol, ו 1 μl של מעכב RNase לתערובת התגובה. דגירת הצינור עבור 5 דקות נוספות על 25 מעלות צלזיוס, ואחריו 60 דקות ב 50 מעלות צלזיוס, inactivאכול את התגובה על ידי חימום עד 70 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
    2. בצע qPCR באמצעות 1 μl של cDNA וכתוצאה מכך עם 12.5 μl של תמהיל סופר צבע ירוק 2x המכיל DNA פולימרז ו 1 μl של פריימרים הפרט 10 מ"מ ספציפיות וירוס זיקה [פריימרים גנוטיפ-פאן וירוס זיקה (עבור: 5'-AARTACACATACCARAACAAAGTGGT-3 " ; Rev: 5'-TCCRCTCCCYCTYTGGTCTTG-3 '), תחל זן PRVABC59 גנוטיפ אסיה וירוס זיקה (5'-AAGTACACATACCAAAACAAAGTGGT-3'; Rev: 5'-TCCGCTCCCCCTTTGGTCTTG-3 ')], או וירוס הפטיטיס C (F RTQ JFH: 5 'CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3; R RTQ JFH: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3'), או GAPDH גן משק הסלולר (עבור: 5'-CCACCTTTGACGCTGGG-3 '; Rev: 5'-CATACCAGGAAATGAGCTTGACA-3') בהיקף תגובה 25 μl.
    3. בצע PCR באמצעות התנאי בטווח 95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות ו 60 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות (40 מחזורים) במערכת ה- PCR בזמן אמת.
    4. השתמש רמת הביטוי GAPDH מבוסס על סף מחזור (CT) ערך לנרמל את Zמדידת הגנום ika ויראלי. חישוב הדלתא CT (ΔCt) ערך של הגנום Zika בהשוואה לזו של GAPDH ולקבל את הערך 2 ΔCt. ואז, לחשב את השינוי לקפל על ידי לקיחת היחס בין תוכן הגנום מנורמל זיקה בין תאים נגועים נגועים בנקודות זמן מצוינות. ראה איור 4 עבור תוצאות שכפול הגנום ZIKV.
  5. בצע ICC באמצעות תאים קבוע מתנול.
    1. לשטוף את התאים קבוע שלוש פעמים עם PBS 1x ולחסום עם חיץ חסימת ICC (סרום עיזים 3%, BSA 3%, 0.1% Triton-x 100 ב PBS).
    2. השתמש חד שבטיים העכבר J2 נוגדן אנטי dsRNA (1 מיקרוגרם / מ"ל) בשעה דילול של 1: 100 בחסימת חיץ דגירה לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
    3. שוטפים את התאים עם 1x PBS ולהוסיף אנטי עכבר עז משני נוגדן IgG-594 (1 מיקרוגרם / מ"ל) בשעה דילול 1: 1,000 במאגר חסימת דגירה במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
    4. שטפו תאים עם 1x PBS ואת הכתם עבור הגרעינים באמצעות לצבוע Hoechst ולבחון את התאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בהגדלת 100X (איור 4).

5. הקרנת הספרייה ציטוקין מפני הידבקות בווירוסים Zika

  1. זרעים נאיבי תאים Vero ב 1 x 10 5 תאים לכל גם באמצעות צלחת 12-היטב. ברגע שהתאים מצורפים (6 שעות שלאחר זריעה), להוסיף כל ציטוקינים בריכוזים מצוינים כפילויות ביולוגיות (2 מיליליטר נפח / טוב). כלול רכב (PBS) בקר לבד.
  2. לאחר 12 שעות לאחר הטיפול, לבצע זיהום ויראלי זיקה (משרד הפנים של 0.1 ב 400 μl לכל היטב). כלול בארות בקרה שלילית ללא זיהום (מדומה).
  3. ב 4 שעות לאחר הפגיעה, להחליף את הבידוד ויראלי עם התקשורת התייחסו ציטוקינים (2 מ"ל). דגירת התאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 44 שעות נוספות.
  4. בשעה 48 לאחר הפגיעה hr, לספור רובד נגיפי באמצעות מיקרוסקופ לעומת שלב ולרכוש תמונות נציג של תאים נגועים ב 40X ההגדלה (איור 5).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

זן ויראלי זיקה (PRVABC59; KU501215 מספר ההצטרפות GenBank) של גנוטיפ אסיה נוצל במחקר זה 12. תאים Vero ב 80% confluency שימשו חוקרת דה נובו זיהום ויראלי Zika. לייצור ויראלי ואפיון Virological עוקב אחד פרקים מוקדמים (P3) וירוס Zika הועסק. הפלאק ויראלי נצפה ביום השני של זיהום. Progenies ויראלי Zika שוחרר מהתא נגוע בתחילה יכול להתפשט תאים שכנים, אשר לגרום להיווצרות פלאק גלוי על תרבות בשכבה (איור 2). השפעת cytopathic ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כאן, פרוטוקול יעיל עבור culturing וירוס Zika במבחנה מוצג. צעדים קריטיים כולל, זיהוי נקודות קצה אופטימלית עבור בהרחבת התרבות הנגיף, מדידת כייל, וכימות שכפול הגנום נמסרו. וירוס Zika הוא פתוגן אנושי, כל כך, תוך טיפול חומרים מזהמים, נהלי בטיחות ביולוגיים הם להיות אחריו בקפדנות. שורת תאי קוף כליות, Vero, שמשה הוכחת מבחני virological שונים. קינטיקה שכפול נגיפי זיקה עשוי להיות שונה בתאים של רקמות ומינים שונים. שורות תאים נוספות ניתן להשתמש כפי שתוארו לעיל 15. וירוס Zi...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

ברצוננו להודות לד"ר אהרון ברולט ולד"ר ברנדי ראסל מהמרכזים לבקרת מחלות ומניעתן (CDC), ארה"ב על מתן PRVABC59 לזן הנגיפי של זיקה. אנו מודים לניקולס טן מאוניברסיטת ייל על עריכת כתב היד הזה. עבודה זו נתמכה על ידי פרס המחקר הפרוגרמטי המוסדי של המרכז הרפואי Cedars-Sinai ל-V.A.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
דולבקו s שונה Eagle' s medium (DMEM)Sigma Life ScienceD5796
HEPESLife Technologies15630080
GlutamaxLife Technologies35050061
2.5% טריפסין, 10x [-] פנול אדום   קורנינג25-054-C1
טריפן כתם כחול 0.4%Life TechnologiesT10282
רוזנת – מונה תאים אוטומטיThermoFisher ScientificC10227
ספירת תאים רוזנת  שקופיות תאThermoFisher ScientificC10283
Rneasy מיניקיט Qiagen74104
Nanodrop 2000Thermo ScientificNanodrop 2000
נוגדן חד שבטי נגד dsRNA J2 אנגלית & ייעוץ מדעי Kft.
עיזים נגד ארנב IgG Alexa Fluor 594Life TechnologiesA11020
SUPERSCRIPT III RT Life Technologies18080085
SYBR QPCR SUPERMIX W/ROXLife Technologies11744500
QuantStudio12K Flex מערכת PCR בזמן אמתThermo Fischer4471088
ללא RNasePromegaM6101
Vero Cell Line ATCCCCL-81
זן נגיפי זיקה PRVABC59המרכזים לבקרת מחלות ומניעתן (CDC)
IL-6Peprotech200-06                         
IL-1 אלפא             פפרוטק200-01A                   
TNF-אלפאפפרוטק300-01A                   
אינטרפרון אלפא A   מו"פ & D Systems11100-1
Interferon betaPeprotech300-02BC
Interferon gammaPeprotech300-02
צנטריפוגה 5415REppendorf5415R
צנטריפוגה 5810REppendorf5810R
Nikon Eclipse Ti מיקרוסקופ אימונופלואורסצנטי עם Nikon Intenselight C-HGFINikon בקר ניקון לבקשה
10010200

מקורות

  1. Brasil, P., et al. Zika Virus Infection in Pregnant Women in Rio de Janeiro - Preliminary Report. N Engl J Med. , 1-11 (2016).
  2. Lucey, D. R., Gostin, L. O. The Emerging Zika Pandemic: Enhancing Preparedness. JAMA. 315 (9), 865-866 (2016).
  3. Mlakar, J., et al. Zika Virus Associated with Microcephaly. N Engl J Med. 374 (10), 951-958 (2016).
  4. Schuler-Faccini, L., et al. Possible Association Between Zika Virus Infection and Microcephaly. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 65 (3), Brazil. 59-62 (2015).
  5. Foy, B. D., et al. Probable non-vector-borne transmission of Zika virus, Colorado, USA. Emerg Infect Dis. 17 (5), 880-882 (2011).
  6. Kuno, G., Chang, G. J. Full-length sequencing and genomic characterization of Bagaza, Kedougou, and Zika viruses. Arch Virol. 152 (4), 687-696 (2007).
  7. Dick, G. W. Zika virus. II. Pathogenicity and physical properties. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46 (5), 521-534 (1952).
  8. Dick, G. W., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. I. Isolations and serological specificity. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46 (5), 509-520 (1952).
  9. Oehler, E., et al. Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome--case report, French Polynesia. Euro Surveill. 19 (9), 1-3 (2013).
  10. Baronti, C., et al. Complete coding sequence of zika virus from a French polynesia outbreak in 2013. Genome Announc. 2 (3), e00500-e00514 (2014).
  11. Lanciotti, R. S., et al. Genetic and serologic properties of Zika virus associated with an epidemic, Yap State, Micronesia, 2007. Emerg Infect Dis. 14 (8), 1232-1239 (2008).
  12. Lanciotti, R. S., et al. Phylogeny of Zika virus in Western Hemisphere, 2015 [Letter]. Emerg Infect Dis. 22 (5), (2016).
  13. Musso, D., Nilles, E. J., Cao-Lormeau, V. M. Rapid spread of emerging Zika virus in the Pacific area. Clin Microbiol Infect. 20 (10), O595-O596 (2014).
  14. Tang, H., et al. Zika Virus Infects Human Cortical Neural Progenitors and Attenuates Their Growth. Cell Stem Cell. , 1-5 (2016).
  15. Hamel, R., et al. Biology of Zika Virus Infection in Human Skin Cells. J Virol. 89 (17), 8880-8896 (2015).
  16. Faye, O., et al. Quantitative real-time PCR detection of Zika virus and evaluation with field-caught mosquitoes. Virol J. 10, 311(2013).
  17. Chu, D., et al. Systematic analysis of enhancer and critical cis-acting RNA elements in the protein-encoding region of the hepatitis C virus genome. J Virol. 87 (10), 5678-5696 (2013).
  18. Hiratsuka, M., et al. Administration of interferon-alpha during pregnancy: effects on fetus. J Perinat Med. 28 (5), 372-376 (2000).
  19. Ozaslan, E., et al. Interferon therapy for acute hepatitis C during pregnancy. Ann Pharmacother. 36 (11), 1715-1718 (2002).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

VeroRT qPCR

מאמרים קשורים