מאמר שיטה

ניצול טכנולוגיית הדפסה 3D כדי מיזוג MRI עם היסטולוגיה: פרוטוקול המוח חתך

15.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54780

⸱

6 בדצמבר 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Translational Neuroradiology Section, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, 2Cerebral Microcirculation Section, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, 3Viral Immunology Section, National Institute of Neurological Disorders and Stroke

במאמר זה

סיכום

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא ליישר הדמיה בתהודה מגנטית במדויק כרכי תמונה (MRI) עם קטעים היסטולוגיה באמצעות יצירת בעלי המוח 3D מודפס אישית ותיבות מבצעה.

תקציר

הדמיית תהודה מגנטית (MRI) מאפשרת תיחום בין רקמה תקינה לחריגה בקנה מידה מקרוסקופי, תוך דגימת נפח רקמה שלם באופן תלת מימדי. בעוד ש-MRI הוא כלי רגיש ביותר לאיתור חריגות ברקמות, הקשר של שינויי אות עם תהליך פתולוגי בסיסי הוא בדרך כלל לא פשוט. במערכת העצבים המרכזית, למשל, דלקת, דה-מיאלינציה, נזק אקסונלי, גליוזיס ומוות עצבי עשויים כולם לגרום לממצאים דומים ב-MRI. ככזה, הפרשנות של סריקות MRI תלויה בהקשר, ולכן יש חשיבות עליונה למתאם רדיולוגי-היסטופתולוגי. למרבה הצער, חתך פתולוגי מסורתי של רקמת המוח הוא לרוב לא מדויק ולא עקבי, ובכך מסבך את ההשוואה בין חתכים היסטולוגיים ל-MRI. מאמר זה מציג מתודולוגיה חדשה לחיתוך מדויק של רקמות מוח של פרימטים ובכך לאפשר התאמה מדויקת בין היסטולוגיה ל-MRI. הפרוטוקול המפורט המתואר במאמר הזה יסייע לחוקרים ליישם את השיטה הזו, שמסתמכת על יצירת פורסות מוח מודפסות בתלת-ממד. עם שינוי קל, ניתן ליישם אותו בקלות עבור מוחות של מינים אחרים, כולל בני אדם.

מבוא

in vivo MRI מספק מדד לא פולשני ורגיש לשלמות הרקמה ברמה המקרוסקופית. שינויים בעוצמת אות ה-MRI הנראים in vivo הם מדדי תוצאה בניסויים קליניים מתמשכים רבים. 1 בעוד ששינויי העוצמה הנראים באמצעות MRI יכולים לזהות אזורים חריגים בהקשר של המוח כולו, הם לרוב אינם ספציפיים מספיק כדי להבדיל בין תהליכים פתולוגיים. זה נכון במיוחד לגבי תהליכים דינמיים הכוללים פתולוגיות מרובות. לדוגמה, בטרשת נפוצה (MS) או במודל החי שלה, דלקת מוח אוטואימונית ניסיונית (EAE), דלקת, בצקת, פירוק מיאלין, הרס אקסונלי, גליוזיס ומוות עצבי חופפים. 2, 3 כדי להשיג את הספציפיות הדרושה לגבי הפתולוגיה הבסיסית, יש לקחת בחשבון את ההקשר, יחד עם ידע על ההיסטולוגיה של רקמות חריגות שזוהו ב- MRI.

עם זאת, אפילו בניסויים בבעלי חיים מבוקרים היטב, התאמת היסטולוגיה ל-MRI in vivo היא מאתגרת ביסודה מסיבות שונות. ראשית, ההבדל בקנה מידה ממדי בין חתכים היסטולוגיים ל-MRI הוא בכמה סדרי גודל. 4 שנית, לצורך השוואה נכונה, הכיוון של מישור פרוסת ה-MRI חייב להתאים למישור החיתוך של רקמת המוח בעת החיתוך. בשל צורת המוח, קשה מאוד לבצע חתכים ישרים ומדויקים באופן עקבי כאשר המוח יושב על משטח ישר. שלישית, גודלו הגדול של המוח ביחס לאזור עניין קטן פוטנציאלי (נגע, גידול וכו') יוצר תרחיש של "מחט בערימת שחת" עבור הפתולוג המעבד את הרקמה. רביעית, גם כאשר רקמת המטרה נמצאת, היא מעובדת בדרך כלל באופן שהופך את הקשר לנתוני ה-MRI המקוריים לבלתי אפשרי. לבסוף, חתך פתולוגי מסורתי של רקמת המוח הוא לרוב לא מדויק ולא עקבי, מה שמסבך עוד יותר את ההשוואה בין חתכים היסטולוגיים לתמונות MRI.

ניסיונות קודמים להתגבר על אתגרים אלה הסתמכו על שימוש באלגוריתמים דפורמטיביים כדי לרשום במשותף את הנתונים ו/או מיקום של סמנים פידוציאליים בתוך הרקמה או סביבה כהפניה. 5, 6, 7, 8 הגישה הראשונה דורשת מודלים חישוביים מורכבים הרגישים במיוחד לסיבוכים עקב עיצוב נתונים, חפצי הדמיה ושינויים הנגרמים על ידי עיבוד רקמות. 4 מצד שני, הגישה האחרונה מציגה את האפשרות לזהם או לפגוע בדרך אחרת ברקמה עצמה. 9

הגישה המתוארת כאן משפרת את המעבר בין שיטות באמצעות שימוש ב-MRI לאחר המוות כדי לגשר על הפער בין MRI in vivo להיסטולוגיה. MRI לאחר המוות מספק תמונות תלת מימדיות (תלת מימד) של המוח ברזולוציה גבוהה יותר ממה שניתן להשיג in vivo ובנוסף, מספק את הנתונים הדרושים להפקת מודל מדויק מבחינה מורפולוגית של פני המוח. לאחר מכן ניתן להשתמש במודל דיגיטלי זה ליצירת מחזיק מותאם אישית בהדפסת תלת מימד עבור המוח. עם מיקום זהיר, מחזיק המוח מאפשר חתך מוח מדויק ומכוון MRI, מפחית את הצורך באלגוריתמים מתמטיים מורכבים, ומאפשר התמקדות באזורים ספציפיים לדגימה ממוקדת.

המעבדה שלנו הציגה לאחרונה שיטות חדשות ליצירת מחזיקי מוח ופורסים מותאמים אישית באמצעות MRI לאחר המוות וטכנולוגיית הדפסת תלת מימד עבור מוחות אנושייםשל 10 ומרמוסטים. 4 שתי השיטות מאפשרות מתאם מדויק יותר בין MRI והיסטולוגיה במסגרת מחקרית, ובסופו של דבר מאפשרות הבנה מעמיקה יותר של הפתולוגיה הספציפית העומדת בבסיס חריגות MRI. ניסויים שתוכננו בקפידה, שבהם המוח נדגם שוב ושוב לאורך זמן in vivo, יכולים לספק הקשר לפירוש הפתולוגיה, מה שבתורו יכול להוסיף ספציפיות לפירוש ה-MRI. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מותאם במסגרת מאוחדת שניתן ליישם על כל רקמת מוח, בין אם היא נובעת מפרימטים לא אנושיים, מכרסמים או בני אדם. אנו מספקים הוראות מפורטות, וסרטון מתאים, לחיתוך המרמוסטים. אף על פי שהפרוטוקול הכללי חל על כל סוג של מוח, בשל הבדלים ברכישת MRI ובגודל הרקמה, כמו גם האתגרים שנתקלים בהם כאשר מתמודדים עם סוגי מוח מסוימים, ישנם כמה הבדלים בגישה כתלות בסוג המוח המעובד. במצגת זו, קטעים עם "אנושי" יצביעו על הבדלים בפרוטוקול הספציפי למוח האנושי.

פרוטוקול

כל טיפול ונהלים חיה כפי שיתואר בהמשך בוצעו בהתאם לפרוטוקול שאושר על ידי המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ טיפול בבעלי חיים ועדת שימוש. המוח נאסף מרמוסטים משותפים (מרמוסט jacchus) מושרה לפתח EAE. 11 Brains אוחסנו פורמלין 10% עבור בין 3 שבועות ושנה לאחר המתת חסד על ידי זלוף transcardial של paraformaldehyde 4%.

1. הכנת MRI לאחר המוות ורכישה

  1. מוח מרמוסט
    1. הכן תחנת עבודה עם גזה כותנה, צינור צנטריפוגות 50 מ"ל, שפכטלים קטן, ~ 30 מ"ל של פרפין, שמן פלואור, והמוח המרמוסט.
    2. מלאו את הצינור עם שמן fluorinated ו גזה על הגובה 20 מ"ל. לדחוס את הגזה כדי להסיר בועות אוויר לאורך הדרך.
    3. בעדינות פורמלין היבש מפני השטח של המוח עם מגבת נייר. הכנס את המוח עם מוט חזיתית לכיוון החלק התחתון שלהצינור. בזהירות להבטיח את המוח בצינור באמצעות גזה יותר סביב הצדדים לתקן את עמדתה. ראה גם סעיף משלים 11 עבור שיטה של ​​יצירת ערש מוח MRI עבור התקנה של סריקות MRI נוספות.
    4. מלאו את שאר הצינור עם גזה ושמן פלואור. מוציאים בזהירות בועות אוויר לאורך הדרך. אבטח את הכובע ואת החותם את הצינור עם פרפין.
    5. סמן את הכובע עולה בקנה אחד עם פיסורה המיספרה. לעטוף את הצינור במגבת נייר ולהכניס אותו לתוך הסליל עם-המרכז העליון הסימן.
    6. רוכשת 2D ספין הד T2. פרמטרים ניתנים בטבלה 1.
    7. פתח את 10 150 אנטומיים מיקרון רכישות T2-weigted ב Mipav ולהירשם לרכישת 6 ה.
      הערה: ההרשמה היא אלגוריתם 3.5D רישום אוטומטי אופטימיזציה עם 9 דרגות חופש, אינטרפולציה sinc חלונות, עלות מתאם הצלב מנורמל פונקציה, עם אלגוריתם החיפוש של ברנט קורא של פאוול. סיבובי נדגמו +106; -10 ° עם סיבובים גסי הגדלת 5 מעלות סיבובים בסדר הגדלת 1 °. אז את הממוצע של התמונות הרשומות: כלי עזר, תמונות תמונה-גורף מחשבון, ממוצע.
  2. מוח אנושי
    1. הפרד את המוח הקדמי מן גזע המוח באמצעות חתך ברמה של המוח התיכון. 10 ההמיספרות ניתן להפריד גם עם חתך לאורך קו האמצע.
    2. מקם את המוח הקדמי בתוך שפופרת גלילית עם כיפה חצי מוח בקצה אחד זרבובית בקצה השני.
    3. מלאו את הצינור עם שמן פלואור דרך הזרבובית. הסר בועות אוויר באמצעות שאיבה עדינה עבור ~ 30 דקות דרך הזרבובית.
    4. רוכשת 3D T1-MPRAGE. פרמטרים ניתנים בטבלה 1.

2. חילוץ שטח מוח: Mipav 7.2

  1. פתח את MRI בכיוון העטרה.
  2. בחר אלגוריתמים, כלי טרנספורמציה, שינוי צורה, דגימה מחדש. בחר גודל המוגדרים על ידי המשתמש ו לדגום מחדש כדי isotווקסלים ropic: 0.1 x 0.1 x 0.1 מ"מ. שמור את MRI resampled כמו Brain_MRI_Resampled. אדם: דגימה מחדש כדי איזוטרופיים ווקסלים 0.3 x 0.3 x 0.3 מ"מ.
  3. בחר אלגוריתמים, מסננים (מרחבית), הפחתת רעש קוית. השתמש בהגדרות ברירת המחדל, לחץ על אישור.
  4. בחר טבלת חיפוש מציג ולחץ על כפתור הסף הכפול. גרור את המחוון על הגרף כדי לכסות את המוח כולו.
  5. בחר אלגוריתמים, פילוח, סף, סף באמצעות מינימום / מקסימום. הזן את הערך הנמצא בפינה השמאלית התחתונה של הגרף העוצם (ממש מתחת בקנה המידה) לתוך התיבה "גבול תחתון". בחר "בינארי" ב עבור סוג תמונת הפלט ולהוריד את הסימון "סף הפוך."
  6. בחר אלגוריתמים, מורפולוגי, מלא חורים. בדוק "תהליך ב 2.5D."
  7. מאחר וזהו MRI של המוח המלא, יש איזה חלל ריק בין למוח האחורי ואת הקליפה כי צריך להיות מלאות. המוח האנושי: לדלג על שלב זה.
    1. באמצעות קו VOI, לצייר חיבורבין למוח האחורי ואת הקליפה משני צידי המוח בנקודה לרוחב ביותר. המשך לעשות את זה דרך המוח.
    2. בחר VOI, מרת VOI, הכל כדי המסכה בינארי. Utilities בחר, מחשבון תמונה. לבחור או מהתפריט הנפתח מפעיל ובחר את מסכת המוח. בחר "קדם סוג תמונת יעד"
    3. בחר אלגוריתמים, מורפולוגי, מלא חורים. בדוק "תהליך ב 2.5D"
  8. שמור את המסכה בינארי כמו Brain_Model.nii.
  9. בחר אלגוריתמים, משטח חלץ (קוביות צועדות). תמונת מסכת בחר, שמירה בשם Brain_Model.ply.

3. בחירת מיקומי Slice: Mipav 7.2

  1. לזהות רקמות של עניין או לנקודת ההתחלה. לחשב את עובי לוח המיועד. במוח המרמוסט, לספור 30 פרוסות MRI לכל סעיף, ו -5 פרוסות MRI לכל פער להב, יוצר 3 חלקי מ"מ עם פערי להב .5 מ"מ, וכתוצאה מכך לוחות ~ 3.5 מ"מ. המוח האנושי: 20 פרוסות MRI לכל סעיף, ו SL MRI 4גלידות לכל פער להב, יוצרות 6 חלקי מ"מ עם פערי להב 1.2 מ"מ, וכתוצאה מכך לוחות ~ 7.2 מ"מ.
  2. במיקום של פער להב הראשונה, לחץ על "VOI התיבה" ולאחר מכן לצייר תיבת רחבי המוח. לחץ בתוך התיבה כדי לבחור בו. העתק והדבק את קונטור עבור כל פרוסת MRI המתאימה פער הלהב.
  3. דילוג קדימה במספר פרוסות MRI המתאים עובי סעיף ולהעתיק ולהדביק את הגובה המתאים הפער להב הבא. חזור על תהליך זה דרך המוח.
  4. בחר VOI, המרה VOI, הכל כדי מסכת בינארי. Save as Blade_Gaps.nii.
  5. בחר אלגוריתמים, Surface חלץ (קוביות צועדות), תמונת מסכת, Blade_Gaps.ply.

4. יצירת מפת Blade MRI: Mipav 7.2

  1. פתח את Brain_MRI_Resampled ואת התמונות Blade_Gaps.nii.
  2. עם תמונת Blade_Gaps.nii שנבחרה, בחר Utilities, תמונה מתמטיקה. בחר לקדם סוג התמונה ולהתרבות.זן 10,000 כערך.
  3. Utilities בחר, מחשבון תמונה. בחר הוסף, ולאחר מכן לבחור את התמונה Brain_MRI_Resampled מהתיבה הנפתחת התמונה. בחר לקדם סוג תמונת היעד.
  4. שמור את התמונה בתור Brain_BladeMap.nii.
  5. אם תקליק על נוף Triplanar, המקומות שבהם המוח יהיה פרוס ניתן לראות שלוש תצוגות מאונך.

5. יבוא מוח ומשטחי גאפ Blade: Netfabb מקצועי

  1. בחר חלק, להוסיף חלק. בחר את הקבצים Brain_Model.ply ו Blade_Gaps.ply
  2. בחר את המוח ולחץ על מצב תיקון. במצב תיקון:
    1. לחץ על כפתור בחירת הפגז, ולאחר מכן לחץ על המוח.
    2. לחץ על כפתור שינוי הבחירה כדי לבחור את המשתלב האחר. לחץ על הסר כדי למחוק את המשתלב האחר.
    3. לחץ על החל תיקון, ולהסיר את החלק הישן.
  3. קליק ימני על המוח. מהלך בחר. הקלק על הכדי כפתור מוצא. רשום את הפרמטרים XYZ המופיעות במסך. פרמטרי תרגום אלו יש צורך לשמור על מיצוב הלהב הקים בשנת Mipav. לחץ על תרגם. ואז לסגור את החלון. (אל תלחצו לתרגם יותר מפעם אחת. זה יהיה לתרגם שוב באמצעות אותם הפרמטרים.)
  4. בחר את דגם Blade_Gaps. קליק ימני על החלק, ובחר Move. הזן את ערכי XYZ נרשמו בעבר בתיבות פרמטרי XYZ. כעת לחץ תרגום ולסגור את החלון.
  5. בחר את דגם Brain_Model ולחץ על מצב תיקון. במצב תיקון:
    1. לחץ על כפתור בחירת הפגז, ולאחר מכן לחץ על המוח.
    2. קליק ימני ובחרו משולשים חלקים. זן 4-5 חזרות. בדוק התכווצות נפח מנע. המוח האנושי: 1-2 חזרות.
    3. קליק ימני, ובחר להפחית משולשים. זן 200000 במניין המשולש היעד ולחץ ביצוע.
    4. לחץ על תיקון אוטומטי, תיקון ברירת מחדל. ואז לחץ על החל תיקון
  6. קליק ימני, שינוי השם. שנה את המוח המוחלק, כפי Smoothed_Brain_Model.
  7. בחר Smoothed_Brain_Model. קליק ימני, ייצוא, STL.

6. עריכת המוח קווי מתאר: Meshmixer

  1. ייבא את Smoothed_Brain_Model לתוך Meshmixer.
  2. השתמש בכלי הפיסול ובחירה לבצע התאמות הרשת. עריכות כוללות:
    1. השתמש בכלי פיסול, יציבה חלקות. להחליק את האזור המקביל לקו VOIs. המוח האנושי: לדלג על שלב זה.
    2. להחליק את פני השטח של קליפת המוח אשר יהיה עם הפנים למטה בתיבה.
    3. להחליק divots קטנה שאולי נוצרו בתהליך meshing ועריכה.
  3. בחר ניתוח, מפקח, כל Autorepair.
  4. יצא את Smoothed_Brain_Model כמו Smoothed_Edited_Brain_Model.

7. יצירת תיבת מבצעה המוח: Netfabb מקצועי

  1. בחר חלק, להוסיף חלק. בחר את filדואר Smoothed_Edited_Brain_Model.
  2. בחר חלק, להוסיף חלק. לאחר מכן בחר את קובץ מוח STL מבצעה Parts_Marmoset ולחץ פתוח. המוח האנושי: המוח מבצעה Parts_Human (קבצי קוד משלימה).
  3. קליק ימני על החלק, ובחר מורחבים, כיורים לחלקים. בחר כל חלק בנפרד ועל שמאל לחץ כדי לשנות אותם. (לחיצה על העין שליד אובייקט מסתירה את זה או עושה את זה גלוי.) שנה את שם הקופסה הגדולה הראשי, תת קופסא הקטנה, ותיבת החיתוך Box_Cutout, בצורת המשושה Blade_Holder_Main, תיבת השטוח הקטנה Blade Microtome, ואת החצי Cradle אובייקט צינור. המוח האנושי: אין Blade_Holder_Main, Microtome Blade, או עריסה.
  4. הסתר הראשי, תת, Blade, Blade_Holder_Main, Blade Microtome, עריסה ולהשתמש משמרת-בחר כדי לבחור את כל השש ואת Box_Cutout. רק Box_Cutout ואת Smoothed_Edited_Brain_Model צריך להיות גלוי, אבל Smoothed_Edited_Brain_Model לא צריך להיבחר.
  5. לחץ וגרור את החלקים שנבחרו להתאים את המיקום בתיבה ביחס למוח.
    1. מקם את המוח במרכז התיבה. Postion המוח העמוק מספיק בתיבה להיסחף בחוזקה, אבל לא עמוק מדי כדי ליצור מסוכך המונע מיקום נכון.
  6. לאחר מיקומו, את קווי המתאר תיבת המוח יכול להיבדק על הסככות. בחר את Box_Cutout ואת Smoothed_Edited_Brain_Model. בחר מבצע בוליאני.
    1. הקישו על Smoothed_Edited_Brain_Model להפוך אותו אדום.
    2. בחר חיסור בוליאני, ולהחיל את החישובים.
  7. סמן את תיבת המוח עבור סככות שתמנענה את רקמת המוח מפני שיוצב בבטחה לתוך הקופסה. אם סככות אלה נמצאות, להתאים את המוח ולכן הוא פחות עמוק בתוך התיבה. אם המוח הוא בעומק הרצוי המסוכךנוכחים, עיין 10 סעיף משלים פתרון להסרת הסככות.
  8. בחר את דגם Blade_Gaps. קליק ימני, ובחר Move. רשמו את ערך Z עמדה, ואז לסגור את החלון. זו תהיה עמדת פער הלהב האחורי ביותר.
  9. בחר את STL Blade כי באו מאזורים מבצעה המוח. קליק ימני, ובחר Move.
    1. בחר תרגום מוחלט. הזן את ערך Z מן 7.8. עבור ערכי X ו- Y, הזן את הערך המתאים מתיבות פרמטר מיקום הנוכחיות
  10. בחר את Blade STL. קליק ימני, לחץ כפול.
    1. בדוק מסדרים חלקים. הזן את המספר הכולל של להבים במניין הכולל. הזן את אותו המספר לתוך תיבת ספירת Z. הזן את עובי הלוח לתוך פער Z. לחץ על שכפל. אם עובי הלוחות היה מגוון, הלהבים יצטרכו להיות ממוקמים בנפרד. שכפל כל להב חדש מן הקודם (נע אחורי אל קדמי)עם פער z שווה עובי הסעיף בסעיף זה.
  11. מקמו את חלקי Microtome Blade בדיוק באותו במרווחים כמו הלהבים של מבצעה ידי חזרה צעד 7.9 ו 7.10 עבור Blade Microtome. המוח האנושי: לדלג על שלב זה.
    1. בחר Microtome Blade יחד עם חלק Blade_Holder_Main ובחר מבצעים בוליאני.
    2. בחר את כל הלהבים ב Microtome Blade כדי לסמן אותם באדום. הקישו על בוליאני חיסור, ולהחיל את החישובים.
    3. מצב תיקון בחר. בצע תיקון החלפה מורחבת. בחר להחיל את התיקון, ולהסיר את החלק הישן.
    4. שינוי שם מחזיק Blade חלק. לייצא את החלק כמו STL.
  12. Shift-בחר Smoothed_Edited_Brain_Model, כל דגמי Blade שנוצרו בשלב הקודם, ואת תת ואת הראשים. לחץ על פעולה בוליאני.
    1. הפוך את כל החלקים מלבד אדום ראש ידי selecting אותם ולחיצה על החץ תחת הקופסה הירוקה להעביר אותם לאדום.
    2. בחר חיסור בוליאני ולאחר מכן בחר להחיל חישובים.
  13. הקש על מצב תיקון. במצב תיקון:
    1. סמן את התיבה עבור סככות ונקודות חדות. אלה יכולים להיות מוחלק ב Netfabb או Meshmixer.
    2. לחץ על תיקון אוטומטי, תיקון מורחב. לאחר מכן להחיל את התיקון ולהסיר את החלק הישן
  14. קליק ימני על תיבת המוח לתיקון ושנה את שמו המוח מבצעה Box. ייצוא כקובץ STL.

8. הדפסת Box מבצעה המוח על Ultimaker 2

  1. מרמוסט המוח: Cura
    1. ייבא את תיבת מבצעה המוח לתוך Cura.
    2. בחר סובב ולגרור את המעגל כדי לסובב את התיבה כך הוא שטוח על המיטה.
    3. התאם את הגדרות ההדפסה: רזולוציה שכבה 0.1 מ"מ, 50% צפיפות מילוי, רפסודה.
    4. בחר נתיב כלי שמור לכרטיס SD. (הדפסה זמן ~ 12 שעות.)
    5. Blade יבוא המחזיקכדי Cura ולסובב אותו כך החריצים הם בצדדים הפנים משושה הוא במישור XZ או YZ.
    6. שכפל את האובייקט.
    7. התאם את הגדרות ההדפסה: רזולוציה שכבה 0.2 מ"מ, 20% צפיפות מילוי, ברים.
    8. בחר נתיב כלי שמור לכרטיס SD. (זמן הדפסה ~ 3 שעות)
  2. המוח האנושי: Cura
    1. ייבא את תיבת מבצעה המוח לתוך Cura ולסובב כמו 8.1.2.
    2. התאם את הגדרות ההדפסה: .2 ברזולוציה שכבת מ"מ, צפיפות מילוי 30-35%, רפסודה.
    3. בחר נתיב כלי שמור לכרטיס SD. (זמן הדפסה ~ 70 שעות עבור תיבת אונה יחידה.)
  3. על 2 Ultimaker
    1. למרוח שכבה דקה של דבק דבק מקל לבנות צלחת.
    2. הכנס את כרטיס ה- SD. בחר הדפסה ובחר את החלק.

9. חיתוך המוח

  1. מוח מרמוסט
    1. כן תחנת עבודה עם המוח הקבוע, מבצעה המוח, שני בעלי הלהב, להבי microtome, 1 מיליליטר של שמן פלואור, fפינצטה לאט, כפפות מגן, וקלטות הטבעה.
    2. מניח להבי microtome חדשים לתוך החריצים בעלי הלהב. ודא לקצה המשופע של כל להב פונה לאותו הכיוון. יש להשתמש בכפפות מגן בעת טיפול להבי microtome.
    3. הסר את המוח מפני בפורמלין בעדינות לייבש אותו.
    4. מניחים את המוח לתוך מבצעה. כמה טיפות של שמן פלואור יכולה להיות מיושמות על מוח מבצעה כדי לאפשר מיצוב קל. ודא המוח הוא במקומו.
    5. מקם את בעלי הלהב עם הלהבים בחריצי הלהב המקבילים.
    6. לחץ כלפי מטה על בעלי הלהב בתקיפות ולהפעיל לחץ איזון איטי לחתוך את המוח.
    7. הסר כל לוח, אחד בכל פעם, החל החלק הקדמי של המוח. זה עוזר להוציא את הלהב microtome מול לוח לפני הסרת לוח עצמה. שים לב לסגור את הכיוון הקדמי / האחורי של כל לוח.
    8. צלם תמונות של קדמימשטח ד האחורי של כל לוח. הלוחות האחוריים יכילו חלקים נפרדים ככל הנראה, אז שימו לב את הכיוון של החתיכות להטבעה. מניחים כל לוח לתוך קלטת הטבעה ולשים את כולם לתוך פתרון פורמלין 10%.
  2. מוח אנושי
    1. בזהירות לבדוק את ההתאמה של המוח בתיבה.
    2. פורסים את המוח מתחיל מקצה אחד באמצעות קיצוץ זוויתי, לאט אבל חיתוך בתקיפות. חותך את המוח דרך כל פער להב.
    3. הסר כל לוח אחד בכל פעם, הקדשת תשומת לב למספר והכיוון קדמי / אחורי של כל לוח.
    4. צלמו תמונות של פני השטח הקדמי וגם האחורי של כל לוח. מניח לוחות בשקיות פורמלין 10% אטומים. גושי רקמה יקוצצו מן הלוחות והושמו קלטות להטבעה.

10. מסוכך הסרה ב Brain Box (סעיף משלים)

  1. הוצאתי פרוסות: Meshmixer
    1. ייבא את Smoothed_Edited_Brain_Model.
    2. בחר לערוך, בצע את פרוסות. בשנת פרוסות הפוכות:
      1. בחר Stacked 3D, Z, זן 1-2 מ"מ עובי. לחץ מחשוב. כאשר פרוס לטעון, לחץ על קבל.
    3. בחר פרוסות 1 או 2 עם היקפה הגדול קרוב לתחתית של הקורטקס. פרוסות אלה צריכות להיות מתחת לרמה של תיבת Sub.
    4. לייצא כל אחד פרוסות אלה Brain_Slice_ #.
  2. הארכת הפרוסות כלפי מעלה כדי להסיר מסוכך: Professional Netfabb
    1. ייבא את פרוסות # Brain_Slice_.
    2. שכפל כל # Brain_Slice_ (לבטל את הסימון לארגן חלקים אם מסומנת).
    3. קליק ימני על עותק אחד מכל # Brain_Slice_ סולם בחר.
      1. יחס קנה מידה קבוע מסיר את סימון. ואז סולם את פרוסת המוח בכיוון Y, כך שהוא יהיה להגיע לרמה של החלק התחתון של תיבת Sub.
    4. שינוי שם # Brain_Slice_Big_ פרוסות אלה.
    5. בדוק את עמדת Y o.ו # Brain_Slice_ המקורי על ידי לחיצה ימנית על החלק ומהלך בחירה. רשום את עמדת Y עבור כל הפרוסות # Brain_Slice_ המקורי.
    6. בצעו את החישוב: Brain_Slice_ # [מיקום Y] - (Brain_Slice_Big_ # [גודל y] - Brain_Slice _ # [גודל y])
    7. בחר כל אחת # Brain_Slice_Big_ בנפרד, קליק ימני ובחר מהלך.
      1. הזן את הערך מחושב מ 10.2.6 בתיבת פרמטר תרגום Y. עבור פרמטרי תרגום X ו- Z, הזן את הערכים ממוקמים בתיבות פרמטר מיקום הנוכחיות. בחר מוחלט תרגום. לחץ על תרגם ולסגור את החלון.
        הערה: פרוסות # Brain_Slice_Big_ יופחת יחד עם המוח ולהבים בעת ביצוע בתיבה.

11. Cradle MRI מוח מרמוסט עבור סריקה נוספת

  1. יצירת ערש MRI מוח
    1. ודא כי המשטח העליון של Cradle הוא באותו גובה כמו Box_Cutout. העומק והמיקום של המוח בעריסה צריך להיות התקנה בדיוק כפי שהוא עבור מבצעה.
    2. Shift-בחר כדי לבחור את Smoothed_Edited_Brain_Model ו ערש.
    3. בחר פעולה בוליאני. בחר את המוח כדי להדגיש את זה אדום, ולאחר מכן בחר חיסור בוליאני. ואז להחיל את החישובים. (גם לבחור את הפרוסות # Brain_Slice_Big_ אם זה אפשרי.)
    4. כנס למצב תיקון כדי להסיר כל נקודות חדות קונטור הערש כפי שנעשה בעבר עבור מבצעה. בחר תיקון מורחב. החל את התיקון, ולהסיר את החלק הישן.
    5. קליק ימני כדי לשנות את חלק MRI מוח ערש. בחר ייצוא, STL.
  2. הדפסת ערש: Cura
    1. יבוא ערש מוח MRI לתוך Cura ולסובב אותו כך שהחלק השטוח עם מגזרת המוח פונה כלפי מעלה.
    2. התאם את הגדרות ההדפסה: רזולוציה שכבה 0.1 מ"מ, 100% צפיפות מילוי, רפסודה.
    3. בחר נתיב כלי שמור לכרטיס SD. (זמן הדפסה ~ 10 שעות)
    4. הדפס על Ultimaker 2 כמתואר 8.3.
  3. רכישה ברזולוציה גבוהה MRI T2 * באמצעות העריסה
    1. בעדינות פורמלין היבש מפני השטח של המוח עם מגבת נייר.
    2. מקם את המוח בעריסה כמתואר עבור מבצעה.
    3. החלק את המוח ערש לתוך הצינור צנטריפוגות 50 מ"ל. מלאו אותו עד אפס מקום עם שמן פלואור.
    4. יש ללחוץ בעדינות את הצינור כדי לאפשר בועות אוויר להימלט מהמוח. הכנס את השווי הכנס לתוך ההבלעה של כובע הצינור כדי למנוע בועות אוויר להרכיב שם. אבטח את הכובע, ואת החותם את הצינור עם פרפין.
    5. מניחים את הצינור לתוך סליל כפי שתואר לעיל. 3D T2 * פרמטרים ניתנים בטבלה 1.
    6. פתח את 18 T2 אנטומיים 100 מיקרון * הרכישות משוקללות ב Mipav ולהירשם לרכישת 10 th. פרמטרי רישום זהים ב 1.1.7. ממוצע התמונות הרשומות: מאיilities, תמונות מחשבון-גורף תמונה, ממוצע.

תוצאות

זרימת העבודה של שיטה זו מסוכמת באיור 1. ברגע שהמוח הוא פרוס, השוואה ויזואלית בין תמונות MR ותמונות של המשטחים השטחיים של לוחות מראה משחק אורינטציה טוב חוצה רצועות מרובות (איור 2). אחרי לוחות מוטבעי פרפין, הם הם מחולקים על microtome ומוכתמת. השוואה יסודית יותר בין ברזולוציה הגבוהה MRI לאחר מוות ואת הסעיפים היסטולוגיה המוכתמים מדגימה התאמה מדויקת ועקבית בכל המבנים של המוח המרמוסט (איור 3).

במודל חיה זו של MS, החיות לפתח נגעים בחומר הלבן הפזורים ברחבי החומר הלבן במוח. נגעים אלה יכולים להיות מזוהים פולשנית על ידי ביצוע MRI. איור 4 מדגים את היכולת של טכניקה זו על מנת להבהיר את המצע פתולוגית של ממצאי ה- MRI. נגעים קטנים שזוהו ב- MRI in vivo יכוללהיות במעקב משני MRI ו היסטולוגיה לאחר המוות. כפי שניתן לראות את ריבועי, פגיעה במיאלין בתוך נגעים הוא אחד המרכיבים העיקריים נהיגה שיתחלף הרמזור MR (והיפראינטנסיות לעומת הרקמה הסובבת). בדיקת ה- MRI היסטולוגיה לאחר המוות גם יכול להראות נגעים החמיצו על in vivo MRI (איור 4).

figure-results-1
איור 1. Workflow ליצירת תיבת מבצעה המרמוסט המוח. המוח הוא קבוע עם פורמלין (A1) וכן MRI משוקלל T2 נרכש עם ווקסלים איזוטרופיים של 150 מיקרומטר לכל קצה (A2). תמונות מעובדים thresholded ליצור מסכה בינארי (A3). המשטח הוא שניתנו אז תוכנת מודלים 3D (A4). חיסור בוליאני בין תבנית מבצעה ומודל המוח יוצר מודל דיגיטלי של מבצעה במוח (B1). תיבת מבצעה המוח מודפסת במדפסת 3D (B2). המוח הוא הניח אז בתקיפות בתיבת מבצעה עבורחיתוך (B3). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-2
איור 2. משמאל לימין: בשנת vivo MRI, לאחר מות MRI, ולצלם לוח רקמות. מטוסי חיתוך נקבעו בהתבסס על MRI (B) לאחר המוות חזותי לעומת פרוסת MRI vivo המקבילה (א). המוח נחתך ואז, ואת הלוחות וכתוצאה מכך נמצאו להיות עקבי (C). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-3
MRI לאחר המוות ברזולוציה גבוהה איור 3. היסטולוגיההתאמת סעיף. לוחות היו מוטבע פרפין, לחתוך עם microtome ל -4 מיקרומטר חלקים, ומוכתמת עם סגול כחול cresyl מהיר (B). הסעיפים מכן הותאמו ויזואלית עם T2 100 מיקרומטר * משוקלל MRI מבוסס על מבנים מוחיים (א). פרטים לרכישת התמונה מופיעים בקטע המשלימה מטעם הפרוטוקול ומבני מוח בטבלת 1.: (1) חץ אדום = כמוסה פנימית, חץ כחול = השליך קדמי; (2) חץ אדום = putamen, חץ כחול = בדרכים אופטיות; (3) חץ אדום = caudate, חץ כחול = ההיפוקמפוס; (4) חץ אדום = כפיס מוח, חץ כחול = אמת מוחות; (5) חץ אדום = colliculus נחה, חץ כחול = בדרכי פירמידה. התיבה המקווקות B1 מצביעה על פרוסה שבו, או במהלך חיתוך במוח או הטבעת פרפין, שגיאה גרמה סיבוב קל על ציר Y, ​​מה שמוביל התאמה של השליך הקדמי בצד השמאל. אנא לחץ כאן כדי להציגגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-4
איור 4. מעקב נגעים מ MRI in vivo סעיף היסטולוגיה. תפקידיו של מוסד vivo MRI לא הראה שום ראיות משכנעות של אות והיפראינטנסיות נורמלית להציע נגעים או בדרכים אופטיות (A1). עם זאת, MRI לאחר המוות ברזולוציה הגבוה מראה ברורי יתר קווים אינטנסיביים בשני שטחים האופטיים (A2). הכתם הסגול הכחול / cresyl המהיר של קטע היסטולוגיה 4 מיקרומטר מראה כי באזורי hyperintense לראות על vivo לשעבר MRI הם demyelinated (A3). ב החומר הלבן במוח, את in vivo MRI מראה והיפראינטנסיות עדין בילטרלי (B1 שהורחבה את ריבועי). אזורי hyperintense יותר ברורים על ברזולוציה הגבוהה לאחר מות MRI (B2). כתם LFB של קטע היסטולוגיה 4 מיקרומטר מראה כי באזורים אלה demyelinated (B3). לאחר השוואה עם ה- i הבסיסn vivo MRI וכתם hemotoxylin-ו-eosin, בצד ימין היה נחוש בדעתו להיות חריגות אנטומי, לא נגע demyelinated. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-5
קבצי קוד משלימה. Brain_Slicer_Parts_Marmoset.stl: אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ. Brain_Slicer_Parts_Human.stl: אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ. Cap_Insert.stl: אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

דיון

הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר השוואה מדויקת בין MRI וחתכים היסטולוגיה. הפרוטוקול מוצג במתכונת אחידה כי ניתן להחיל על מוחם של בני אדם או בעלי חיים קטנים, כגון מרמוסטים או מכרסמים. הבדלים ספציפיים גדול (אדם) וקטנים (פרימטים לא אנושיים ו מכרסם) מוח מודגש, ובסרטון ודמויות המצורפים אנחנו מדגימים את היישום המרמוסט. למרות הגישה היא פשוטה, השיטה דורשת צעדים רבים, כמו גם את השימוש כמה סוגים של תוכנה. יתר על כן, מספר בעיות שעלולים להשפיע על הדיוק של שיטה זו הן חשובות להזכיר.

איכות התמונה של MRI in vivo היא גורם חשוב. כדי למזער את הפער רזולוציית תמונה בין MRI ותמונות היסטולוגיה דיגיטליות, גודל voxel MRI הקטן ביותר האפשרי אמור לשמש. מושג זה חל גם על איכות התמונה של ה- MRI לאחר המוות. בעוד גדלרכישת הזמן ב- MRI לאחר המוות מאפשר רזולוציית תמונה גבוהה בהרבה, ההכנה יכולה להציג ממצאי תמונה כגון נשירת אות מוקדים הקשורים בועות אוויר. ממצאים אלה יכולים לטשטש אזורים של רקמות וכן להשפיע קונטור שלה. יתר על כן, את הממדים של הרקמה על MRI לאחר המוות צפויים להיות מושפעים על ידי תהליך קיבוע ומשך. בעוד in vivo כדי משחק vivo לשעבר MRI יכול להיות מקורב מקרוב על ידי ניצול ציוני דרך אנטומיים בהגדרת גיאומטריה פרוסה במהלך הרכישה נעשה רישום שאינו ליניארי עדיין יהיה צורך להגיע רמה גבוהה יותר של דיוק בהתאמת שתי התמונות האלה MRI.

העיצוב של בעל מוח מבצעה הוא גם צעד מכריע. ביצירת המודל הדיגיטלי של המוח, אלגוריתם החלקה מוחל שמביאה להגדלה ביחס המודל מעט למוח הקבוע. זה מאפשר החדרה קלה של המוח לתוך המחזק שלו ואת מבצעה ומפחית קצוות חדים במחזיק &# 39; קונטור s. עם זאת, אם המודל הוא גדול מדי (למשל, על ידי יותר מ -5%), המוח יכול לזוז במהלך MRI לאחר המוות ו / או החתך. נקודה חשובה נוספת היא להתאים את העיצוב של דגם המוח כך המוח הקטן ממוקם כראוי בתוך האובייקט מודפס 3D. זה יכול להיות מאתגר במיוחד כאשר המוח הקטן נפגע במהלך חילוץ מוח הנתיחה.

בעת הדפסת מבצעה במוח בעל, את סוג מדפסת 3D חייב גם להיות שנבחר בקפידה. חלק מדפסות רב-סילון דורשים שלאחר עיבוד באמצעות תנור להסיר חומר תמיכה. בעוד מדפסות אלה יכולים לייצר אובייקטים למים יחסית עמיד יותר ממדפסות דוגמנות בתצהיר התמזגו שולחן העבודה (FDM), תהליך החימום להסיר תומך לשבש את הקופסה מילימטרים ספורים, יצירת פערים להב שאינם ניצבים באופן מושלם את חיטובי המוח.

תהליך חתך המוח הוא עוד צעד חיוני. לפני חיתוך המוח הדואר כולו לתוך לוחות, חשוב לוודא כי המוח יושב בחוזקה בתוך מבצעה במוח: לא אמור להיות תנועה כאשר לחצו קל מוחל על המוח. זה יעשה את זה אפשרי עבור הלהבים לחתוך דרך המוח נכחה בזירה שקבע החוקרים. לחץ רצוף, מאוזן צריך להיות מוחל על שני בעלי הלהב בעת חיתוך. בהתאם החד של הלהבים הנוקש של הרקמות, בתנועות חיתוך רוחביות קלות יכולות להיות יתרון עבור שמירת משטחי חתך שטוחים.

תהליך ההטבעה-פרפין יכול להיות גם מקור של חוסר תיאום בין MRI ו היסטולוגיה. אם לוח הרקמות אינו יושב שטוחים על הקלטת בתהליך ההטבעה, תהיה הטיה בין מטוס החיתוך של microtome ומקום השטח של הלוח. זה ידרוש קיצוץ בסעיפים שמישים למצוא מישור שטוח שבו כל הרקמה חשופה. דרך אחת לתקן את ההטיההיא על ידי שינוי הזווית של המטוס לצפייה MRI לאחר המוות גבוהה איזוטרופיים ברזולוציה. עם זאת, זה כמעט בלתי אפשרי לבצע על MRI vivo ב כי היא רכשה בדרך כלל עם רזולוצית איזוטרופי (בדרך כלל פרוסות העטרה עבות).

לבסוף, הרקמה יכולה לחוות כמה עיוות במהלך תקופת הקיבוע בפורמלין והטבעת פרפין (הצטמקות), כמו גם במהלך תקופת ההכנה של שקופיות (מתקפלים, פיצוח, קמטים). חלק דפורמציות אלה ניתן לתקן על ידי צבת 4-5 מיקרומטר החלקים באמבט מים לפני ההעברה על גבי שקופיות. ניתן דפורמציות אחרים נפתרה חלקית על ידי ביצוע coregistration תמונה ובר-עיוות של תמונות דיגיטציה היסטולוגית לתמונות MRI לאחר המוות. אף על פי כן, מזעור דפורמציות עם תרגול זהיר ומיומן היא הגישה היעילה ביותר כדי התאמת כמויות MRI כדי היסטולוגיה סעיפים.

לסיכום, המתודולוגיה הציג כאן מאפשר investigators להעריך את הפתולוגיה הבסיסית במדויק ממצאי ה- MRI. באופן כללי יותר, היא גישה מבטיחה לזיהוי ו / או על מנת לאשר ביומרקרים MRI רומן ללימודי מחקר למקד תהליכים פתולוגיים ספציפיים, כגון דלקת או מיאלין מחדש.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

תוכנית המחקר הפנימי של NINDS תמכה במחקר זה. אנו מודים למתקן הדמיית תהודה מגנטית פונקציונלית של ה-NIH. אנו מודים לג'ניפר לפבר ולססיל צ'רן-צ'י ין על הסיוע ברכישת MRI לאחר המוות. אנו מודים לג'ון אוסטוני ולמחלקה למתקן ליבת מכשור על הסיוע בהדפסת תלת מימד. איור 1 של עבודה זו השתמש בתמונות מ-MeshLab, כלי שפותח בתמיכת פרויקט 3D-CoForm.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
7T/30 ס"מ USR AVIII Bruker MRIBruker Biospin
38 מ"מ סליל נפח Bruker Biospin
FomblinSolvay Solexis
50 מ"ל צינורות צנטריפוגה פלקון, פוליפרופילן,קורנינג21008-951
ספוגי גזה של פישרברנדפישר סיינטיפיק13-761-52
סרט מעבדה לכל מטרה Parafilm MBemis
Leica RM2235 מיקרוטום סיבובי להבים
Leica, פרופיל נמוך (819)Leica
Cresyl Violet Acetate, 0.1%מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית26089-01
Luxol Fast Blue, 0.1% ב-95% אלכוהולמדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית26056-15
ETOH
Ultimaker 2 מורחב Ultimaker.75
ק"ג ממותג רשמי של Ultimaker PLA  נימה, 2.85 מ"מ, כסף מתכתיUltimaker
Axio Observer.Z1Zeiss
Zen 2 (מהדורה כחולה)Zeiss
Netfabb Professional 5.0.1Netfabbhttp://www.netfabb.com/professional.php
Meshmixer 10.9.332Autodeskhttp://www.meshmixer.com/download.html
Mipav 7.2NIH CIThttp://mipav.cit.nih.edu
CuraUltimakerhttps://ultimaker.com/en/products/cura-software
סטרילי חד פעמיים Leica מימית

מקורות

  1. Evans, A. C., Frank, J. A., Antel, J., Miller, D. H. The role of MRI in clinical trials of multiple sclerosis: comparison of image processing techniques. Ann Neurol. 41 (1), 125-132 (1997).
  2. 't Hart, B. A., van Kooyk, Y., Geurts, J. J. G., Gran, B. The primate autoimmune encephalomyelitis model; a bridge between mouse and man. Ann Clin Transl Neurol. 2 (5), 581-593 (2015).
  3. Ontaneda, D., Hyland, M., Cohen, J. A. Multiple sclerosis: new insights in pathogenesis and novel therapeutics. Annu Rev Med. 63, 389-404 (2012).
  4. Guy, J. R., Sati, P., Leibovitch, E., Jacobson, S., Silva, A. C., Reich, D. S. Custom fit 3D-printed brain holders for comparison of histology with MRI in marmosets. J Neurosci Methods. 257, 55-63 (2016).
  5. Breen, M. S., Lazebnik, R. S., Wilson, D. L. Three-dimensional registration of magnetic resonance image data to histological sections with model-based evaluation. Ann Biomed Eng. 33 (8), 1100-1112 (2005).
  6. Dauguet, J., et al. Three-dimensional reconstruction of stained histological slices and 3D non-linear registration with in-vivo MRI for whole baboon brain. J Neurosci Methods. 164 (1), 191-204 (2007).
  7. McGrath, D. M., Vlad, R. M., Foltz, W. D., Brock, K. K. Technical note: fiducial markers for correlation of whole-specimen histopathology with MR imaging at 7 tesla. Med Phys. 37, 2321-2328 (2010).
  8. Schormann, T., Zilles, K. Three-Dimensional linear and nonlinear transformations: An integration of light microscopical and MRI data. Hum Brain Mapp. 6, 339-347 (1998).
  9. Jiang, L., et al. Combined MR, fluorescence and histology imaging strategy in a human breast tumor xenograft model. NMR Biomed. 26 (3), 285-298 (2013).
  10. Absinta, M., et al. Postmortem magnetic resonance imaging to guide the pathologic cut: individualized, 3-dimensionally printed cutting boxes for fixed brains. J Neuropathol Exp Neurol. 73 (8), 780-788 (2014).
  11. Gaitán, M. I., et al. Perivenular brain lesions in a primate multiple sclerosis model at 7-tesla magnetic resonance imaging. Mult Scler. 20 (1), 64-71 (2014).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

MRI

מאמרים קשורים