סינתזה של Cationized Magnetoferritin עבור המגנטיזציה אולטרה-מהירה של תאים

משטח מחייב או הפנמה של חלקיקי תחמוצת ברזל פאראמגנטי (SPIONs) אפשר המגנטיזציה של מגוון סוגי תאים עבור יישומים כגון הדמית מניפולציה מרחוק. ¹ עם זאת, השגת המגנטיזציה הסלולר מספיק יכולה להיות אתגר, במיוחד כאשר האינטראקציה בין SPION ואת פני התא חלשה. ² בעבר, או חשיפה ממושכת לריכוזים גבוהים SPION כבר מועסק אסטרטגיות כדי להתגבר על האתגר הזה. ^3,4 עם זאת, אסטרטגיות אלה הם בעייתיים משום שהם להגדיל רעילות ^5,6 ויש הצלחה מאוד מוגבלת בסוגי תאים עם שיעורי הפנמה נמוכה, כגון לימפוציטים. ⁷ כדי לשפר ספיגת הסלולר של SPIONs, מספר גישות functionalization משטח נחקרו. למשל, נוגדנים שימשו לקדם אנדוציטוזה קולטן בתיווך, ⁸ תוך ספיגת הלא ספציפית יכולה להיות מושגת באמצעות transfectionרבותי ^9,10 או מינים חודר תאים, כגון פפטיד-מידה HIV. ^11,12 עם זאת, נוגדן וגישות functionalization פפטיד מוגבלים על ידי ריאגנטים יקרים והכנת סינתטי מורכבת, תוך סוכני transfection יכולים לגרום ממטרי nanoparticle ולהשפיע לרעה על תפקוד תא. ^13,14

אנחנו דיווחנו לאחרונה על הסינתזה של magnetoferritin cationized הכימי, SPION רומן שהיה יעיל מאוד בתאי גזע mesenchymal אדם magnetizing (hMSCs) באמצעות פעמי דגירה קצרות ככל דקה אחת. ¹⁵ Magnetoferritin מסונתז על ידי ומשחזר SPION בתוך חלל mineralized-דה של פריטין חלבון אחסון ברזל. ¹⁶ זה SPION מבוסס החלבון המשלב תכונות רבות שהופכות אותו מתאים במיוחד עבור המגנטיזציה תא, כגון שליטה על התכונות המגנטיות של הליבה המגנטית, ^17-19 ו biocompatibility ו מסיסות מימית שמעניקות מעטפת החלבון. נוסףיותר, functionalization השטח מושגת בקלות בשל חומצות אמינו addressable שיכול להיות ^20-22 או גנטית שינוי כימי. ^23-25 הראינו כי cationization הכימי של שאריות חומצת אמינו החומצית של פגז החלבון מייצר ננו-חלקיקים יציבים כי ייקשרו בקלות עם תחומי anionic על פני התא מוביל המגנטיזציה תאים מהירה ומתמשכת. הליך זה מבטל את צורך functionalization המייגע ופרוטוקולי דגירה ארוכים, ובשל מנגנון התיוג הלא ספציפית אסטרטגית המגנטיזציה המהירה הזה צריכה למצוא יישום רחב היקף של סוגי תאים אחרים. כאן, אנו מציגים עומק בדו"ח של שיטת תיוג תא אולטרה מהיר, כולל פרוטוקולים מפורטים של סינתזה, functionalization טיהור השטח של magnetoferritin cationized.

אדם בתאי גזע mesenchymal (hMSC) נבצרו ממח עצם ירך העצם הפרוקסימלי של חולי osteoarthritic שעברו ניתוח החלפת מפרק ירך, בהתאם מלא עם הנחיות ועדת אתיקת מחקר חולי Southmead בריסטול (הפניה # 078/01) ולאחר הסכמת המטופל הושגה.

1. סינתזה Magnetoferritin וטיהור

1. הערות כלליות
   1. בצע סינתזת magnetoferritin בתוך כלי תגובת סגר, פעמים במקטורן על 65 מעלות צלזיוס תחת אווירת חנקן להגביל חמצון של מבשרי המתכת. להזריק פתרונות מלח מתכת מי חמצן דרך נמלי גישה במכסה לתוך כלי התגובה באמצעות משאבת מזרק.
   2. לאחר סינתזה magnetoferritin, לטהר את החלבון על ידי כרומטוגרפיה-אניוני (ראה סעיף 1.4) כדי להסיר חלקיקים לא מגודר בתוך חלל חלבון, ואחריו כרומטוגרפיה בגודל הדרה (ראה סעיף 1.5) כדי לבודד מונומרים חלבון. דהריכוז termine חלבון באמצעות assay ברדפורד (ראה סעיף 1.6).
2. הכנות לקראת סינתזה
   1. Deoxygenate 500 מ"ל מים ללא יונים על ידי הנחת צינור מחובר בלון גז חנקן במים, איטום כלי בניילון ומבעבעים דרך גז חנקן כ -60 דקות.
   2. מחממים באמבט מים המחובר כלי התגובה כפול במעיל עד 65 מעלות צלזיוס. הוסף 75 מ"ל של 50 מ"מ 4- (2-hydroxyethyl) חומצה -1-piperazineethanesulfonic (HEPES) חיץ (pH 8.6) לתוך כלי התגובה, לאטום את כלי השיט, deoxygenate ידי מבעבע גז חנקן דרך הפתרון חיץ עבור כ 20 דקות. במקביל, מערבבי פתרון החיץ באמצעות בוחש מגנטי.
   3. לאחר deoxygenating פתרון חיץ HEPES, להסיר את הצינור באספקת גז החנקן מן המאגר ולשמור אותו מרחפי הספינה כדי לשמור על אווירת חנקן. להוסיף apo-פריטין כדי להשיג ריכוז סופי של 3 מ"ג / מ 'l. המשך בחישה מגנטית, אך להפחית את מהירות ערבוב אם הקצפה מתרחשת.
   4. הכן פתרון המניות 25 מ"מ של heptahydrate סולפט קובלט ידי המסת 0.19 גרם ב 50 מ"ל של מים ללא יונים deoxygenated.
   5. הכן פתרון 25 מ"מ של פתרון hexahydrate סולפט ברזל אמוניום ידי המסת 0.98 גרם ב 100 מ"ל מים ללא יונים deoxygenated.
   6. הסר 2.5 מ"ל של הפתרון hexahydrate סולפט ברזל אמוניום ולהחליף עם 2.5 מ"ל של heptahydrate סולפט קובלט.
   7. הכן פתרון 8.33 מ"מ של מי חמצן במים deionized deoxygenated ידי הוספת הראשונה 965 μl של פתרון מי חמצן (30% w / w) עד 9 מ"ל מים ללא יונים deoxygenated, ולאחר מכן הוספת 1 מ"ל של תת-המניה הזו ל -99 מ"ל מים ללא יונים deoxygenated.
3. סינתזת Magnetoferritin
   1. להזריק 10.1 מ"ל של הן מבשר ברזל-קובלט ואת מי חמצן בעת ​​ובעונה אחת לתוך התמיסה apo-פריטין (מגנטית stirred) בקצב זרימה של 0.15 מ"ל / דקה באמצעות שני משאבת מזרק (הנפח הכולל מוזרק: 20.2 מ"ל).
   2. בתקופת הזרקת, deoxygenate עוד 500 מ"ל מים ללא יונים.
      הערה: התוכן של כלי התגובה בהדרגה לאמץ בצבע חום כהה כמו תמורת התגובה.
   3. זמן קצר לפני השלמת הזריקה הראשונה, להכין עוד 100 מ"ל של מבשר ברזל-קובלט פתרון מי חמצן באמצעות מים ללא יונים טרי deoxygenated.
   4. חזור על שלב ההזרקה מתואר 1.3.1 באמצעות פתרונות מוכנים טרי של קובלט-הברזל מי חמצן.
   5. בתקופת הזרקת, deoxygenate עוד 500 מ"ל מים ללא יונים, והמשך כמתואר ב 1.3.3 ו 1.3.4.
   6. לאחר הזריקה השלישית, לעזוב הפתרון להבשיל במשך 15 דקות תחת בחישה.
   7. הוסף 1.5 מ"ל של פתרון ציטראט 1 M נתרן לכלי השיט כתגובה Chelate יוני מתכת חינם בתמיסה.
   8. הסר את הפתרון מן התגובהכלי לתוך צינורות 50 מ"ל צנטריפוגות, צנטריפוגות במשך 30 דקות ב 4,350 XG ולהעביר את supernatant דרך פילטר מזרק 0.22 מיקרומטר. בשלב זה, את supernatant המסונן ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד לטיהור.
4. כרומטוגרפיה חילוף יונים
   1. טען את המדגם על עמודה (בקוטר 2.5 ס"מ, 20 ס"מ) המכילות מטריצה ​​קטיוני באמצעות משאבת peristaltic בקצב זרימה של 10 מ"ל / דקה.
   2. לשטוף את העמודה עם כ 100 מ"ל של הפעלת המאגר (50 מ"מ טריס (hydroxymethyl) aminomethane (טריס) חיץ, pH 8.0) באמצעות משאבת שיפוע בקצב זרימה של 10 מ"ל / דקה.
   3. כדי elute החלבון, לשטוף את הטור 10 מיליליטר / דקה עם ריכוזים גוברים של נתרן כלורי (NaCl) במאגר טריס: 150, 500 ו -1,000 מ"מ סופי ריכוז NaCl, 150 מיליליטר של כל ריכוז.
   4. כמו חלבון elutes בריכוז NaCl של 500 מ"מ, לאסוף אותו ב -50 שברים מ"ל באמצעות אספן חלק אוטומטי.
      הערה: עבורפרוטוקול מפורט של כרומטוגרפיה חילוף יונים להתייעץ פרוטוקולים שפורסמו בעבר. ²⁶
5. כרומטוגרפיה הדרת גודל
   1. לרכז את 150 מ"ל של magnetoferritin לנפח של כ 2 מ"ל באמצעות יחידת מסנן צנטריפוגלי 15 מ"ל ואחריו ביחידת נפח 4 מ"ל. עיין בהוראות היצרן של יחידות מסנן צנטריפוגלי (ראה רשימת חומר) עבור פרוטוקול מפורט של הליך זה.
   2. טען המדגם מרוכז על עמודת סינון ג'ל באמצעות לולאת הזרקה.
   3. לשטוף את העמודה עם חיץ ריצה (50 מ"מ טריס חיץ, 8.0 pH, המכיל 150 מ"מ NaCl) בקצב זרימה של 1.3 mL / min.
   4. אסוף 6 מ"ל שברים באמצעות אספן חלק אוטומטי. מונומרים חלבון elute אחרונים. בשלב זה, magnetoferritin מטוהרים ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד cationization.
      הערה: לקבלת פרוטוקול מפורט של כרומטוגרפיה גודל הרחקה באמצעות טור סינון ג'ל להתייעץ previously שפורסם פרוטוקולים. ²⁷
6. קביעת ריכוז חלבון
   1. הכן סטנדרטים פריטין של 0.06, 0.125, 0.25, 0.5 ו 1 מ"ג / מ"ל ​​ב 50 חיץ מ"מ טריס באמצעות פריטין הטחול סוס זמינים מסחרית.
      הערה: ריכוז החלבון של פריטין הזמין מסחרי נאמרה על הבקבוק. אם לא, פנה לספק את המידע הזה.
   2. לדלל דגימות magnetoferritin של ריכוז ידוע ב 50 מ"מ טריס חיץ עד שהצבע של הפתרון כ תואם את הצבע של התקן 0.5 מ"ג / מ"ל. רשום לעצמך גורם לדילול.
   3. הוסף 10 μl של כל דגימה סטנדרטית magnetoferritin בשלושת עותקים לתוך בארות של צלחת 96 באר.
   4. הוסף 200 μl של מגיב מוכן ברדפורד היטב כל (עיין ברשימת חומרים לפרטים מגיבים assay ברדפורד).
   5. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 8 דקות.
   6. מדוד את הספיגה ב λ = 595 ננומטר באמצעותקורא microplate.
   7. מגרש את ספיגת הממוצע של סטנדרטי פריטין כפונקציה של ריכוז חלבון ולהשתמש המדרון ליירט של ההתאמה ליניארית כדי לחשב את הריכוז של מדגם magnetoferritin.
      הערה: קח בחשבון את גורם לדילול ששימש להתאים המדגם magnetoferritin אל עקומת סטנדרט.

2. Magnetoferritin Cationization

1. הערות כלליות
   הערה: לקבלת magnetoferritin cationization, N, N--dimethyl 1,3-propanediamine (DMPA) היה מצמידים את שאריות חומצה אספרטית גלוטמית על פני השטח MF באמצעות N - (3-dimethylaminopropyl) - הידרוכלוריד -ethylcarbodiimide 'N (EDC).
   1. לבצע את התגובה בטמפרטורת החדר תחת בחישה. פרוטוקול כדלקמן הוא עבור cationization של 10 מ"ג של magnetoferritin בהיקף כולל של 5 מ"ל (ריכוז החלבון 2 מ"ג / מ"ל). עם זאת, קנה המידה כלפי מעלה או מטהעל ידי שמירה על חלבון: DMPA: יחסי EDC עקבי, כמו גם כרכים של פתרון חיץ magnetoferritin.
   2. לפני התגובה cationization, dialyze דגימות magnetoferritin למאגר פוספט 50 מ"מ (pH 7) המכיל 50 mM NaCl. זה חשוב להסיר חיץ elution טריס ולהימנע תגובות לא רצויות בין אמין טריס ואת שאריות EDC המופעל חומצה קרבוקסילית. קביעת ריכוז חלבון לאחר דיאליזה ולהתאימו 4 מ"ג / מ"ל ​​לפני cationization.
2. פרוטוקול Cationization
   1. תשקלי 374 מ"ג של DMPA ו להתמוסס 2.5 מ"ל של 200 מ"מ 2 חומצה ethanesulfonic (N -morpholino) (MES) חיץ.
   2. התאם את ה- pH הפתרון כ 7 באמצעות מרוכז (6 M) חומצה הידרוכלורית (HCl).
      זהירות: בצע פעולה זו במנדף, כמו תוספת של חומצה כדי DMPA משחרר אדים רעילים!
   3. להוסיף 2.5 מ"ל של תמיסת magnetoferritin ב 4 מ"ג / מ"ל ​​(concen הסופיtration של MES הוא 100 מ"מ, הריכוז הסופי של magnetoferritin הוא 2 מ"ג / מ"ל, הסכום הכולל של חלבון הוא 10 מ"ג).
   4. הוספת בוחש מגנטי ומערבבים במשך שעה 2. לאזן.
   5. בזהירות לכוון הפתרון 5.0 pH באמצעות 1 M HCl.
   6. להוסיף 141 מ"ג של אבקת EDC לפתרון DMPA / magnetoferritin.
   7. המשך ערבוב במשך 3.5 שעות.
   8. סנן את הפתרון דרך פילטר מזרק 0.22 מיקרומטר כדי להסיר כל משקעים.
   9. מוסיפים את הפתרון צינורות דיאליזה עם חתך משקל מולקולרי 12-14 kDa ו dialyze נגד 4 ליטר של חיץ פוספט 50 מ"מ (pH 7) המכיל 50 מ"מ NaCl עבור 2 ימים על 4 מעלות צלזיוס, החלפת חיץ דיאליזה לפחות שלושה פעמים במהלך אותה תקופה.
      הערה: בשלב זה, cationized magnetoferritin יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.

3. תיוג תא גזע האדם mesenchymal עם Cationized Magnetoferritin

1. הערות כלליות
   2. התרבות תאים כמו monolayers באמצעות 175 ס"מ ² צלוחיות 20 מ"ל של מדיום תרבות, אשר מתחדש כל 3 - 4 ימים. בינוני תרבות מורכב הבינוני של הנשר השונה של Dulbecco (DMEM), המכיל 1,000 מ"ג / גלוקוז L, 10% (V / V) בסרום שור עוברי, 1% (v / v) פניצילין / פתרון סטרפטומיצין, 1% (v / v) L -alanyl-L- גלוטמין פתרון 5 ng / ml גורם הגדילה פיברובלסטים אדם טרי בתוספת.
2. תיוג מגנטי של hMSC עם magnetoferritin cationized
   1. זרע 150,000 hMSCs לתוך 25 ס"מ ² צלוחיות ולהשאיר לדבוק לילה בשעה 37 ° C.
   2. סנן לעקר magnetoferritin cationized דרך פילטר מזרק 0.22 מיקרומטר ולקבוע את ריכוז החלבון.
   3. שמירה על תנאים סטריליים, להכין פתרון 0.5 מיקרומטר של magnetoferri cationizedפח ב פוספט שנאגר מלוח (PBS). שמור כתרים במנדף תרבות סטרילי עד השימוש.
   4. שוטפים את התאים מצופה עם 2 מ"ל של PBS בטמפרטורת החדר.
   5. הוסף 1 מ"ל של הפתרון magnetoferritin cationized מעוקר אל התאים מצופה דגירה במשך פרק הזמן הרצוי (1 דקות עד 1 שעה).
   6. שטוף תאים עם PBS, ולאחר מכן תאי קציר על ידי הוספת 0.5 מיליליטר של חומצת טריפסין / ethylenediaminetetraacetic (EDTA) ו דוגרים על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
   7. הוסף 1 מ"ל של מדיום תרבות להשבית טריפסין / EDTA, להעביר הפתרון צינור צנטריפוגות 15 מ"ל צנטריפוגות במשך 5 דקות ב g 524 x.
   8. בטל supernatant מחדש להשעות את התא גלול ב 0.5 מיליליטר חיץ הפרדה מגנטי, מורכב 0.5% (w / v) בסרום שור עוברי 2 mM EDTA ב PBS.
3. פרדת תא מגנטית
   1. צרף המגנט אל הדוכן הרב, ולהוסיף עמודת פרדת מגנטי המגנט. מקום מסנן שלפני פרידה על הבעמודה E.
   2. מניח 0.5 מיליליטר של חיץ הפרדה מגנטי במסנן שלפני הפרידה ולתת לו לרוץ דרך שני המסנן בעמודה לכבס להרטיב אותם.
   3. מניחים צינור צנטריפוגות 15 מ"ל תחת העמודה.
   4. הוסף 0.5 מיליליטר של השעית תא מאגר מסנן טור הפרדה המגנטית.
   5. כאשר המאגר ריק, להוסיף 0.5 מ"ל של חיץ הפרדה מגנטי.
   6. כאשר המאגר ריק, להוסיף 0.5 מיליליטר נוסף של חיץ הפרדה מגנטי.
   7. חזור עוד פעם אחת (הנפח הכולל של חיץ הפרדה מגנטי המשמש לשטיפה צריך להיות 1.5 מיליליטר). שלב זה לשטוף elutes כל התאים הלא-ממוגנטים מהעמודה (שבריר של התאים הלא-ממוגנטים).
   8. הסר את העמודה מן המגנט ולמקם אותו צינור צנטריפוגות 15 מיליליטר טרי. הסר מסנן ממאגר העמודה.
   9. הוסף 1 מ"ל של חיץ הפרדה מגנטי המאגר ומיד לדחוף דרך העמודה באמצעות הבוכנה מסופק על ידי ייצורr. זה elutes התאים הממוגנטים מהעמודה לתוך צינור צנטריפוגות (חלק תא ממוגנט).
   10. צנטריפוגה שני צינורות במשך 5 דקות ב 524 x ז.
   11. בטל supernatant מחדש להשעות את כדורי תא 0.3 מ"ל PBS.
   12. ספירת מספרי תאים בכל שבריר באמצעות hemocytometer.
   13. לקבוע את החלק היחסי של תאים ממוגנטים, M (%), באמצעות המשוואה הבאה:
       
       כאשר n (M) הוא מספר תאים בשבריר הממוגנט n (M + NM) הוא הסכום של מספר התאים שהברים הממוגנטים והלא-ממוגנטים.
4. הכנת hMSCs שכותרתו עם magnetoferritin cationized כימות ברזל באמצעות ספקטרוסקופית פליטה אופטי פלזמה מצמידים אינדוקטיבי (ICP-OES)
   הערה: הפרוטוקול ייתכן שיהיה צורך מותאם למכשירי ICP-OES אחרים. מומלץ להתייעץ עם מחדשטכנאי sponsible.
   1. צנטריפוגה מספר ידוע של תאים למשך 5 דקות ב 524 x גרם.
   2. הסר את supernatant PBS ולהוסיף 0.25 מ"ל של 50% (v / v) חומצה חנקתית.
   3. וורטקס לערבב את ההשעיה תא acidified.
   4. דגירה בטמפרטורת החדר למשך הלילה.
   5. להוסיף 4.75 מ"ל של מים מזוקקים לכל תערובת מדגם ו מערבולת.
   6. לנתח עם ICP-OES. ²⁸
   7. לנרמל את תכולת הברזל נמדדה למספר התאים כדי לקבוע ערך עבור תוכן ברזל הסלולר.

TEM שימש כדי לאשר מינרליזציה ננו-חלקיקים בתוך חלל apoferritin ולקבוע את גודל הליבה הממוצע (איורים 1 א ו -1 B). ניתוח תמונה של דגימות magnetoferritin בלא כתם נתן קוטר ליבה ממוצע של 8.2 ± 0.7 ננומטר, ואת כתם aurothioglucose אשר את נוכחותו של חלקיקים בתוך כלוב החלבון. ראוי לציין, כי תמונות מראות מדגם magnetoferritin כי היה מטוהרים נוספים באמצעות פרדה מגנטית לבודד ליבות ננו-חלקיקים אחידים. דגימות Magnetoferritin כי לא היו מטוהרים מגנטיים יש התפלגות גודל ליבה רחבה מעט. 29 ניתוח של מבנה הליבה magnetoferritin באמצעות התאבכות אלקטרונים נבחרים באזור הצביעו על נוכחות אפשרית של מבנה ספינל ההופכי מבוסס על מגנטיט (Fe 3 O 4) ו / או מגהמיט (γ-Fe 2 O 3), כמו גם את מבנה ספינל בשל Co 3 4. יתר על כן, ספקטרום ראמאן חשף פסגות לייחס Fe 3 O 4, כמויות קטנות של γ-Fe 2 O 3, ו פרית קובלט (איור 1 ג). ICP-OES ניתוח magnetoferritin הראה בממוצע 102 מיקרוגרם של ברזל ו -0.9 מיקרוגרם של קובלט מיליגרם של magnetoferritin.

סכימטי כלול, הממחישות את הצעד cationization עוקבות (איור 2 א). הקוטר הידרודינמית של magnetoferritin ו cationized magnetoferritin היה 11.8 ± 1.1 ננומטר ו -12.5 ± 1.4 ננומטר, בהתאמה, כפי שנקבע על ידי פיזור אור דינאמי. היעילות cationization של צימוד DMPA קוולנטיים כדי magnetoferritin הוערכה באמצעות potentiometry zeta ו יינון desorption לייזר בסיוע מטריקס הזמן של הטיסה (MALDI-TOF) ספקטרומטריית מסה. הפוטנציאל זטא שונה מ -10.5 mV עבור MF כדי + 8.3 mV עבור magnetoferritin cationized, המאשרלשנות בפוטנציאל משטח משלילי לחיובי (טבלה 1). ניסויים ספקטרומטריית מסה מצאו משקל מולקולרי למקטע של 20.1 kDa עבור apo-פריטין ו- 21.1 kDa מקוריים עבור (B איור 2) apo-פריטין cationized. עלייה המונית זו תואמת כ -12 מולקולות DMPA מצמידים לכל למקטע חלבון, ואת cationization של 288 שאריות על חלבון 24 למקטע כולו.

רווית רגישות מגנטית נמדדו באמצעות magnetometry תמנונים, רוחבי relaxivity האורך נמדדו באמצעות תהודה מגנטית. תכונות מגנטיות היו דומות magnetoferritin ו magnetoferritin cationized, המציין כי היה cationization השפעה זניחה על התכונות המגנטיות של SPION הסגור (טבלת 1). יתר על כן, מאפיינים אלה דומים חלקיקים מבוססי תחמוצת ברזל אחרים, 19,30 הוכחה כי cationized Magnetoferritin יהיה מתאים כמו סוכני SPION מבוסס קונבנציונליים ניגוד MRI בשיפור לעומת הדמיה.

לאחר חשיפה של 30 דקות, פני התא היה מכוסה בצפיפות magnetoferritin cationized (איור 3 א). עם זאת, לאחר שבוע, לא נמצאו חלקיקים על פני התא (איור 3 ב '). magnetoferritin Cationized היה יעיל להפליא hMSCs תיוג מגנטי. יש לציין, חשיפת תאי magnetoferritin cationized למשך דקה אחת הביאה המגנטיזציה של 92% של אוכלוסיית התא ואת הביצוע של 3.6 pg של ברזל לכל תא. הגדלת זמן הדגירה עד 15 דקות הביאו את המגנטיזציה של אוכלוסיית התא כולו (C איור 3).

איור 1: אפיון magnetof ליבות erritin מסוממים עם 5% קובלט. תמונות TEM של magnetoferritin מוכתם aurothioglucose (א) ו בלא כתם (B). הבלעה מראה עקיפת אלקטרונים מקבילה עם מדדי מגנטיט. סרגל קנה מידה: 20 ננומטר. (C) ראמאן הספקטרום עבור magnetoferritin. החצים מציינים את מצבי רטט ראמאן העיקריים פרית קובלט (2G T), מגנטיט מגהמיט (הן A 1G). 31,32 אורך הגל לייזר המשמש היה 532 ננומטר. (תמונה מותאמת Okuda et al. 18). שים לב מדגם magnetoferritin זה היה מטוהרים נוספים באמצעות פרדה מגנטית, אשר מבודדת חלקיקי magnetoferritin טעונים באופן אחיד. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

785fig2.jpg "/>
איור 2: Cationization של magnetoferritin. א) ייצוגים שטח פנים נגישים מרכך המציגים את ההתפלגות (אדום חומצי) ובסיסיות (צהובות) שאריות חומצת אמינו על פני החלבון. Magnetoferritin (1) הוא שונה magnetoferritin cationized (2) על ידי crosslinking בתיווך carbodiimide של DMPA שאריות חומצת אמינו חומצי על פני החלבון (3). ב) ניתוח ספקטרומטריית מסה של יחידות משנה apo-פריטין ו cationized apo-פריטין. Mass-ל-תשלום (m / z) ספקטרום של apoferritin (ApoF) ו apoferritin cationized (חתול-ApoF) שנוצר על ידי MALDI-TOF. עלייה המונית 20.1 kDa כדי 21.1 kDa הוא ציין לאחר cationization. (תמונה המותאמת קוריאה Carreira et al. 15) נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

EP-together.within-page = "1">
איור 3: תיוג מגנטי תא הפרדת hMSCs מודגרות עם magnetoferritin cationized. א) תמונת TEM של hMSCs לאחר הדגירה 30 דקות עם magnetoferritin cationized. החץ מעיד על קיומו של ליבות magnetoferritin צפופים על פני התא. ברי סולם: 200 ננומטר. B) תמונת TEM של hMSC שבוע לאחר תיוג. פני התא ברור של magnetoferritin cationized. ג) לחקור את המהירות של תיוג מגנטי: 92% מאוכלוסיית התא היה ממוגנטים לאחר חשיפה של דקה אחת עם 0.5 מיקרומטר cationized magnetoferritin, לבין אוכלוסיית התא כולו ממוגנטת תוך 15 דקות. תוכן ברזל לכל תא נקבע באמצעות ICP-OES. ממוצע וסטיית תקן משלושה ביולוגי משכפל מוצגת. (תמונה מותאמת קוריאה Carreira et al. 15) נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

טבלה 1: אפיון physicochemical של magnetoferritin (MF) ו magnetoferritin cationized (חתול-MF). (לוח מותאם קוריאה Carreira et al. 15)

למחברים אין מה לחשוף.