מאמר שיטה

סינתזה של Cationized Magnetoferritin עבור המגנטיזציה אולטרה-מהירה של תאים

11.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54785

⸱

13 בדצמבר 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Bristol Centre for Functional Nanomaterials, University of Bristol, 2Department of Materials, Imperial College London, 3Self Assembly Group, CIC nanoGUNE, 4Ikebasque, Basque Foundation for Science, 5School of Cellular and Molecular Medicine, University of Bristol, 6H.H. Wills Physics Laboratory, University of Bristol

במאמר זה

סיכום

מוצג פרוטוקול לסינתזה וקטיונים של מגנטופריטין מסומם בקובלט, כמו גם שיטה למגנט במהירות תאי גזע עם מגנטופריטין קטיוני

.

תקציר

יישומים ביו רבים וחשובים, כגון הדמית תא מניפולציה מרחוק, ניתן להשיג על ידי תיוג תאים עם חלקיקי תחמוצת ברזל פאראמגנטי (SPIONs). השיג ספיגת הסלולר מספקת של SPIONs הוא אתגר כי כבר נפגש באופן מסורתי על ידי חשיפת תאים לריכוזים מוגברים של SPIONs או על ידי הארכת זמן חשיפה (עד 72 שעות). עם זאת, אסטרטגיות אלה צפויות לתווך רעילים. כאן, אנו מציגים את הסינתזה של magnetoferritin SPION מבוסס חלבון וכן פרוטוקול functionalization משטח קליל המאפשר המגנטיזציה תאים מהירה באמצעות ריכוזים בחשיפה נמוכים. ליבת SPION של magnetoferritin מורכב של תחמוצת ברזל מסומם-קובלט עם קוטר חלקיקים ממוצע של mineralized 8.2 ננומטר בתוך החלל-פריטין apo סוס טחול. cationization הכימי של magnetoferritin מיוצר רומן, SPION הקרום פעיל מאוד כי ממוגנט אדם בתאי גזע mesenchymal (hMSCs) באמצעות פעמי דגירה כמוקצר ככל ריכוזים דקים וברזל אחד כמו שפל כמו 0.2 מ"מ.

מבוא

משטח מחייב או הפנמה של חלקיקי תחמוצת ברזל פאראמגנטי (SPIONs) אפשר המגנטיזציה של מגוון סוגי תאים עבור יישומים כגון הדמית מניפולציה מרחוק. 1 עם זאת, השגת המגנטיזציה הסלולר מספיק יכולה להיות אתגר, במיוחד כאשר האינטראקציה בין SPION ואת פני התא חלשה. 2 בעבר, או חשיפה ממושכת לריכוזים גבוהים SPION כבר מועסק אסטרטגיות כדי להתגבר על האתגר הזה. 3,4 עם זאת, אסטרטגיות אלה הם בעייתיים משום שהם להגדיל רעילות 5,6 ויש הצלחה מאוד מוגבלת בסוגי תאים עם שיעורי הפנמה נמוכה, כגון לימפוציטים. 7 כדי לשפר ספיגת הסלולר של SPIONs, מספר גישות functionalization משטח נחקרו. למשל, נוגדנים שימשו לקדם אנדוציטוזה קולטן בתיווך, 8 תוך ספיגת הלא ספציפית יכולה להיות מושגת באמצעות transfectionרבותי 9,10 או מינים חודר תאים, כגון פפטיד-מידה HIV. 11,12 עם זאת, נוגדן וגישות functionalization פפטיד מוגבלים על ידי ריאגנטים יקרים והכנת סינתטי מורכבת, תוך סוכני transfection יכולים לגרום ממטרי nanoparticle ולהשפיע לרעה על תפקוד תא. 13,14

אנחנו דיווחנו לאחרונה על הסינתזה של magnetoferritin cationized הכימי, SPION רומן שהיה יעיל מאוד בתאי גזע mesenchymal אדם magnetizing (hMSCs) באמצעות פעמי דגירה קצרות ככל דקה אחת. 15 Magnetoferritin מסונתז על ידי ומשחזר SPION בתוך חלל mineralized-דה של פריטין חלבון אחסון ברזל. 16 זה SPION מבוסס החלבון המשלב תכונות רבות שהופכות אותו מתאים במיוחד עבור המגנטיזציה תא, כגון שליטה על התכונות המגנטיות של הליבה המגנטית, 17-19 ו biocompatibility ו מסיסות מימית שמעניקות מעטפת החלבון. נוסףיותר, functionalization השטח מושגת בקלות בשל חומצות אמינו addressable שיכול להיות 20-22 או גנטית שינוי כימי. 23-25 הראינו כי cationization הכימי של שאריות חומצת אמינו החומצית של פגז החלבון מייצר ננו-חלקיקים יציבים כי ייקשרו בקלות עם תחומי anionic על פני התא מוביל המגנטיזציה תאים מהירה ומתמשכת. הליך זה מבטל את צורך functionalization המייגע ופרוטוקולי דגירה ארוכים, ובשל מנגנון התיוג הלא ספציפית אסטרטגית המגנטיזציה המהירה הזה צריכה למצוא יישום רחב היקף של סוגי תאים אחרים. כאן, אנו מציגים עומק בדו"ח של שיטת תיוג תא אולטרה מהיר, כולל פרוטוקולים מפורטים של סינתזה, functionalization טיהור השטח של magnetoferritin cationized.

פרוטוקול

אדם בתאי גזע mesenchymal (hMSC) נבצרו ממח עצם ירך העצם הפרוקסימלי של חולי osteoarthritic שעברו ניתוח החלפת מפרק ירך, בהתאם מלא עם הנחיות ועדת אתיקת מחקר חולי Southmead בריסטול (הפניה # 078/01) ולאחר הסכמת המטופל הושגה.

1. סינתזה Magnetoferritin וטיהור

  1. הערות כלליות
    1. בצע סינתזת magnetoferritin בתוך כלי תגובת סגר, פעמים במקטורן על 65 מעלות צלזיוס תחת אווירת חנקן להגביל חמצון של מבשרי המתכת. להזריק פתרונות מלח מתכת מי חמצן דרך נמלי גישה במכסה לתוך כלי התגובה באמצעות משאבת מזרק.
    2. לאחר סינתזה magnetoferritin, לטהר את החלבון על ידי כרומטוגרפיה-אניוני (ראה סעיף 1.4) כדי להסיר חלקיקים לא מגודר בתוך חלל חלבון, ואחריו כרומטוגרפיה בגודל הדרה (ראה סעיף 1.5) כדי לבודד מונומרים חלבון. דהריכוז termine חלבון באמצעות assay ברדפורד (ראה סעיף 1.6).
  2. הכנות לקראת סינתזה
    1. Deoxygenate 500 מ"ל מים ללא יונים על ידי הנחת צינור מחובר בלון גז חנקן במים, איטום כלי בניילון ומבעבעים דרך גז חנקן כ -60 דקות.
    2. מחממים באמבט מים המחובר כלי התגובה כפול במעיל עד 65 מעלות צלזיוס. הוסף 75 מ"ל של 50 מ"מ 4- (2-hydroxyethyl) חומצה -1-piperazineethanesulfonic (HEPES) חיץ (pH 8.6) לתוך כלי התגובה, לאטום את כלי השיט, deoxygenate ידי מבעבע גז חנקן דרך הפתרון חיץ עבור כ 20 דקות. במקביל, מערבבי פתרון החיץ באמצעות בוחש מגנטי.
    3. לאחר deoxygenating פתרון חיץ HEPES, להסיר את הצינור באספקת גז החנקן מן המאגר ולשמור אותו מרחפי הספינה כדי לשמור על אווירת חנקן. להוסיף apo-פריטין כדי להשיג ריכוז סופי של 3 מ"ג / מ 'l. המשך בחישה מגנטית, אך להפחית את מהירות ערבוב אם הקצפה מתרחשת.
    4. הכן פתרון המניות 25 מ"מ של heptahydrate סולפט קובלט ידי המסת 0.19 גרם ב 50 מ"ל של מים ללא יונים deoxygenated.
    5. הכן פתרון 25 מ"מ של פתרון hexahydrate סולפט ברזל אמוניום ידי המסת 0.98 גרם ב 100 מ"ל מים ללא יונים deoxygenated.
    6. הסר 2.5 מ"ל של הפתרון hexahydrate סולפט ברזל אמוניום ולהחליף עם 2.5 מ"ל של heptahydrate סולפט קובלט.
    7. הכן פתרון 8.33 מ"מ של מי חמצן במים deionized deoxygenated ידי הוספת הראשונה 965 μl של פתרון מי חמצן (30% w / w) עד 9 מ"ל מים ללא יונים deoxygenated, ולאחר מכן הוספת 1 מ"ל של תת-המניה הזו ל -99 מ"ל מים ללא יונים deoxygenated.
  3. סינתזת Magnetoferritin
    1. להזריק 10.1 מ"ל של הן מבשר ברזל-קובלט ואת מי חמצן בעת ​​ובעונה אחת לתוך התמיסה apo-פריטין (מגנטית stirred) בקצב זרימה של 0.15 מ"ל / דקה באמצעות שני משאבת מזרק (הנפח הכולל מוזרק: 20.2 מ"ל).
    2. בתקופת הזרקת, deoxygenate עוד 500 מ"ל מים ללא יונים.
      הערה: התוכן של כלי התגובה בהדרגה לאמץ בצבע חום כהה כמו תמורת התגובה.
    3. זמן קצר לפני השלמת הזריקה הראשונה, להכין עוד 100 מ"ל של מבשר ברזל-קובלט פתרון מי חמצן באמצעות מים ללא יונים טרי deoxygenated.
    4. חזור על שלב ההזרקה מתואר 1.3.1 באמצעות פתרונות מוכנים טרי של קובלט-הברזל מי חמצן.
    5. בתקופת הזרקת, deoxygenate עוד 500 מ"ל מים ללא יונים, והמשך כמתואר ב 1.3.3 ו 1.3.4.
    6. לאחר הזריקה השלישית, לעזוב הפתרון להבשיל במשך 15 דקות תחת בחישה.
    7. הוסף 1.5 מ"ל של פתרון ציטראט 1 M נתרן לכלי השיט כתגובה Chelate יוני מתכת חינם בתמיסה.
    8. הסר את הפתרון מן התגובהכלי לתוך צינורות 50 מ"ל צנטריפוגות, צנטריפוגות במשך 30 דקות ב 4,350 XG ולהעביר את supernatant דרך פילטר מזרק 0.22 מיקרומטר. בשלב זה, את supernatant המסונן ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד לטיהור.
  4. כרומטוגרפיה חילוף יונים
    1. טען את המדגם על עמודה (בקוטר 2.5 ס"מ, 20 ס"מ) המכילות מטריצה ​​קטיוני באמצעות משאבת peristaltic בקצב זרימה של 10 מ"ל / דקה.
    2. לשטוף את העמודה עם כ 100 מ"ל של הפעלת המאגר (50 מ"מ טריס (hydroxymethyl) aminomethane (טריס) חיץ, pH 8.0) באמצעות משאבת שיפוע בקצב זרימה של 10 מ"ל / דקה.
    3. כדי elute החלבון, לשטוף את הטור 10 מיליליטר / דקה עם ריכוזים גוברים של נתרן כלורי (NaCl) במאגר טריס: 150, 500 ו -1,000 מ"מ סופי ריכוז NaCl, 150 מיליליטר של כל ריכוז.
    4. כמו חלבון elutes בריכוז NaCl של 500 מ"מ, לאסוף אותו ב -50 שברים מ"ל באמצעות אספן חלק אוטומטי.
      הערה: עבורפרוטוקול מפורט של כרומטוגרפיה חילוף יונים להתייעץ פרוטוקולים שפורסמו בעבר. 26
  5. כרומטוגרפיה הדרת גודל
    1. לרכז את 150 מ"ל של magnetoferritin לנפח של כ 2 מ"ל באמצעות יחידת מסנן צנטריפוגלי 15 מ"ל ואחריו ביחידת נפח 4 מ"ל. עיין בהוראות היצרן של יחידות מסנן צנטריפוגלי (ראה רשימת חומר) עבור פרוטוקול מפורט של הליך זה.
    2. טען המדגם מרוכז על עמודת סינון ג'ל באמצעות לולאת הזרקה.
    3. לשטוף את העמודה עם חיץ ריצה (50 מ"מ טריס חיץ, 8.0 pH, המכיל 150 מ"מ NaCl) בקצב זרימה של 1.3 mL / min.
    4. אסוף 6 מ"ל שברים באמצעות אספן חלק אוטומטי. מונומרים חלבון elute אחרונים. בשלב זה, magnetoferritin מטוהרים ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד cationization.
      הערה: לקבלת פרוטוקול מפורט של כרומטוגרפיה גודל הרחקה באמצעות טור סינון ג'ל להתייעץ previously שפורסם פרוטוקולים. 27
  6. קביעת ריכוז חלבון
    1. הכן סטנדרטים פריטין של 0.06, 0.125, 0.25, 0.5 ו 1 מ"ג / מ"ל ​​ב 50 חיץ מ"מ טריס באמצעות פריטין הטחול סוס זמינים מסחרית.
      הערה: ריכוז החלבון של פריטין הזמין מסחרי נאמרה על הבקבוק. אם לא, פנה לספק את המידע הזה.
    2. לדלל דגימות magnetoferritin של ריכוז ידוע ב 50 מ"מ טריס חיץ עד שהצבע של הפתרון כ תואם את הצבע של התקן 0.5 מ"ג / מ"ל. רשום לעצמך גורם לדילול.
    3. הוסף 10 μl של כל דגימה סטנדרטית magnetoferritin בשלושת עותקים לתוך בארות של צלחת 96 באר.
    4. הוסף 200 μl של מגיב מוכן ברדפורד היטב כל (עיין ברשימת חומרים לפרטים מגיבים assay ברדפורד).
    5. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 8 דקות.
    6. מדוד את הספיגה ב λ = 595 ננומטר באמצעותקורא microplate.
    7. מגרש את ספיגת הממוצע של סטנדרטי פריטין כפונקציה של ריכוז חלבון ולהשתמש המדרון ליירט של ההתאמה ליניארית כדי לחשב את הריכוז של מדגם magnetoferritin.
      הערה: קח בחשבון את גורם לדילול ששימש להתאים המדגם magnetoferritin אל עקומת סטנדרט.

2. Magnetoferritin Cationization

  1. הערות כלליות
    הערה: לקבלת magnetoferritin cationization, N, N--dimethyl 1,3-propanediamine (DMPA) היה מצמידים את שאריות חומצה אספרטית גלוטמית על פני השטח MF באמצעות N - (3-dimethylaminopropyl) - הידרוכלוריד -ethylcarbodiimide 'N (EDC).
    1. לבצע את התגובה בטמפרטורת החדר תחת בחישה. פרוטוקול כדלקמן הוא עבור cationization של 10 מ"ג של magnetoferritin בהיקף כולל של 5 מ"ל (ריכוז החלבון 2 מ"ג / מ"ל). עם זאת, קנה המידה כלפי מעלה או מטהעל ידי שמירה על חלבון: DMPA: יחסי EDC עקבי, כמו גם כרכים של פתרון חיץ magnetoferritin.
    2. לפני התגובה cationization, dialyze דגימות magnetoferritin למאגר פוספט 50 מ"מ (pH 7) המכיל 50 mM NaCl. זה חשוב להסיר חיץ elution טריס ולהימנע תגובות לא רצויות בין אמין טריס ואת שאריות EDC המופעל חומצה קרבוקסילית. קביעת ריכוז חלבון לאחר דיאליזה ולהתאימו 4 מ"ג / מ"ל ​​לפני cationization.
  2. פרוטוקול Cationization
    1. תשקלי 374 מ"ג של DMPA ו להתמוסס 2.5 מ"ל של 200 מ"מ 2 חומצה ethanesulfonic (N -morpholino) (MES) חיץ.
    2. התאם את ה- pH הפתרון כ 7 באמצעות מרוכז (6 M) חומצה הידרוכלורית (HCl).
      זהירות: בצע פעולה זו במנדף, כמו תוספת של חומצה כדי DMPA משחרר אדים רעילים!
    3. להוסיף 2.5 מ"ל של תמיסת magnetoferritin ב 4 מ"ג / מ"ל ​​(concen הסופיtration של MES הוא 100 מ"מ, הריכוז הסופי של magnetoferritin הוא 2 מ"ג / מ"ל, הסכום הכולל של חלבון הוא 10 מ"ג).
    4. הוספת בוחש מגנטי ומערבבים במשך שעה 2. לאזן.
    5. בזהירות לכוון הפתרון 5.0 pH באמצעות 1 M HCl.
    6. להוסיף 141 מ"ג של אבקת EDC לפתרון DMPA / magnetoferritin.
    7. המשך ערבוב במשך 3.5 שעות.
    8. סנן את הפתרון דרך פילטר מזרק 0.22 מיקרומטר כדי להסיר כל משקעים.
    9. מוסיפים את הפתרון צינורות דיאליזה עם חתך משקל מולקולרי 12-14 kDa ו dialyze נגד 4 ליטר של חיץ פוספט 50 מ"מ (pH 7) המכיל 50 מ"מ NaCl עבור 2 ימים על 4 מעלות צלזיוס, החלפת חיץ דיאליזה לפחות שלושה פעמים במהלך אותה תקופה.
      הערה: בשלב זה, cationized magnetoferritin יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.

3. תיוג תא גזע האדם mesenchymal עם Cationized Magnetoferritin

  1. הערות כלליות
    1. בצע את כל תרבית התאים באמצעות ארונות זרימה למינרית בכיתה שנייה וחממות humidified על 37 מעלות צלזיוס ואווירת פחמן דו חמצני 5%.
    2. התרבות תאים כמו monolayers באמצעות 175 ס"מ 2 צלוחיות 20 מ"ל של מדיום תרבות, אשר מתחדש כל 3 - 4 ימים. בינוני תרבות מורכב הבינוני של הנשר השונה של Dulbecco (DMEM), המכיל 1,000 מ"ג / גלוקוז L, 10% (V / V) בסרום שור עוברי, 1% (v / v) פניצילין / פתרון סטרפטומיצין, 1% (v / v) L -alanyl-L- גלוטמין פתרון 5 ng / ml גורם הגדילה פיברובלסטים אדם טרי בתוספת.
  2. תיוג מגנטי של hMSC עם magnetoferritin cationized
    1. זרע 150,000 hMSCs לתוך 25 ס"מ 2 צלוחיות ולהשאיר לדבוק לילה בשעה 37 ° C.
    2. סנן לעקר magnetoferritin cationized דרך פילטר מזרק 0.22 מיקרומטר ולקבוע את ריכוז החלבון.
    3. שמירה על תנאים סטריליים, להכין פתרון 0.5 מיקרומטר של magnetoferri cationizedפח ב פוספט שנאגר מלוח (PBS). שמור כתרים במנדף תרבות סטרילי עד השימוש.
    4. שוטפים את התאים מצופה עם 2 מ"ל של PBS בטמפרטורת החדר.
    5. הוסף 1 מ"ל של הפתרון magnetoferritin cationized מעוקר אל התאים מצופה דגירה במשך פרק הזמן הרצוי (1 דקות עד 1 שעה).
    6. שטוף תאים עם PBS, ולאחר מכן תאי קציר על ידי הוספת 0.5 מיליליטר של חומצת טריפסין / ethylenediaminetetraacetic (EDTA) ו דוגרים על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    7. הוסף 1 מ"ל של מדיום תרבות להשבית טריפסין / EDTA, להעביר הפתרון צינור צנטריפוגות 15 מ"ל צנטריפוגות במשך 5 דקות ב g 524 x.
    8. בטל supernatant מחדש להשעות את התא גלול ב 0.5 מיליליטר חיץ הפרדה מגנטי, מורכב 0.5% (w / v) בסרום שור עוברי 2 mM EDTA ב PBS.
  3. פרדת תא מגנטית
    1. צרף המגנט אל הדוכן הרב, ולהוסיף עמודת פרדת מגנטי המגנט. מקום מסנן שלפני פרידה על הבעמודה E.
    2. מניח 0.5 מיליליטר של חיץ הפרדה מגנטי במסנן שלפני הפרידה ולתת לו לרוץ דרך שני המסנן בעמודה לכבס להרטיב אותם.
    3. מניחים צינור צנטריפוגות 15 מ"ל תחת העמודה.
    4. הוסף 0.5 מיליליטר של השעית תא מאגר מסנן טור הפרדה המגנטית.
    5. כאשר המאגר ריק, להוסיף 0.5 מ"ל של חיץ הפרדה מגנטי.
    6. כאשר המאגר ריק, להוסיף 0.5 מיליליטר נוסף של חיץ הפרדה מגנטי.
    7. חזור עוד פעם אחת (הנפח הכולל של חיץ הפרדה מגנטי המשמש לשטיפה צריך להיות 1.5 מיליליטר). שלב זה לשטוף elutes כל התאים הלא-ממוגנטים מהעמודה (שבריר של התאים הלא-ממוגנטים).
    8. הסר את העמודה מן המגנט ולמקם אותו צינור צנטריפוגות 15 מיליליטר טרי. הסר מסנן ממאגר העמודה.
    9. הוסף 1 מ"ל של חיץ הפרדה מגנטי המאגר ומיד לדחוף דרך העמודה באמצעות הבוכנה מסופק על ידי ייצורr. זה elutes התאים הממוגנטים מהעמודה לתוך צינור צנטריפוגות (חלק תא ממוגנט).
    10. צנטריפוגה שני צינורות במשך 5 דקות ב 524 x ז.
    11. בטל supernatant מחדש להשעות את כדורי תא 0.3 מ"ל PBS.
    12. ספירת מספרי תאים בכל שבריר באמצעות hemocytometer.
    13. לקבוע את החלק היחסי של תאים ממוגנטים, M (%), באמצעות המשוואה הבאה:
      figure-protocol-1
      כאשר n (M) הוא מספר תאים בשבריר הממוגנט n (M + NM) הוא הסכום של מספר התאים שהברים הממוגנטים והלא-ממוגנטים.
  4. הכנת hMSCs שכותרתו עם magnetoferritin cationized כימות ברזל באמצעות ספקטרוסקופית פליטה אופטי פלזמה מצמידים אינדוקטיבי (ICP-OES)
    הערה: הפרוטוקול ייתכן שיהיה צורך מותאם למכשירי ICP-OES אחרים. מומלץ להתייעץ עם מחדשטכנאי sponsible.
    1. צנטריפוגה מספר ידוע של תאים למשך 5 דקות ב 524 x גרם.
    2. הסר את supernatant PBS ולהוסיף 0.25 מ"ל של 50% (v / v) חומצה חנקתית.
    3. וורטקס לערבב את ההשעיה תא acidified.
    4. דגירה בטמפרטורת החדר למשך הלילה.
    5. להוסיף 4.75 מ"ל של מים מזוקקים לכל תערובת מדגם ו מערבולת.
    6. לנתח עם ICP-OES. 28
    7. לנרמל את תכולת הברזל נמדדה למספר התאים כדי לקבוע ערך עבור תוכן ברזל הסלולר.

תוצאות

TEM שימש כדי לאשר מינרליזציה ננו-חלקיקים בתוך חלל apoferritin ולקבוע את גודל הליבה הממוצע (איורים 1 א ו -1 B). ניתוח תמונה של דגימות magnetoferritin בלא כתם נתן קוטר ליבה ממוצע של 8.2 ± 0.7 ננומטר, ואת כתם aurothioglucose אשר את נוכחותו של חלקיקים בתוך כלוב החלבון. ראוי לציין, כי תמונות מראות מדגם magnetoferritin כי היה מטוהרים נוספים באמצעות פרדה מגנטית לבודד ליבות ננו-חלקיקים אחידים. דגימות Magnetoferritin כי לא היו מטוהרים מגנטיים יש התפלגות גודל ליבה רחבה מעט. 29 ניתוח של מבנה הליבה magnetoferritin באמצעות התאבכות אלקטרונים נבחרים באזור הצביעו על נוכחות אפשרית של מבנה ספינל ההופכי מבוסס על מגנטיט (Fe 3 O 4) ו / או מגהמיט (γ-Fe 2 O 3), כמו גם את מבנה ספינל בשל Co 3 O 4. יתר על כן, ספקטרום ראמאן חשף פסגות לייחס Fe 3 O 4, כמויות קטנות של γ-Fe 2 O 3, ו פרית קובלט (איור 1 ג). ICP-OES ניתוח magnetoferritin הראה בממוצע 102 מיקרוגרם של ברזל ו -0.9 מיקרוגרם של קובלט מיליגרם של magnetoferritin.

סכימטי כלול, הממחישות את הצעד cationization עוקבות (איור 2 א). הקוטר הידרודינמית של magnetoferritin ו cationized magnetoferritin היה 11.8 ± 1.1 ננומטר ו -12.5 ± 1.4 ננומטר, בהתאמה, כפי שנקבע על ידי פיזור אור דינאמי. היעילות cationization של צימוד DMPA קוולנטיים כדי magnetoferritin הוערכה באמצעות potentiometry zeta ו יינון desorption לייזר בסיוע מטריקס הזמן של הטיסה (MALDI-TOF) ספקטרומטריית מסה. הפוטנציאל זטא שונה מ -10.5 mV עבור MF כדי + 8.3 mV עבור magnetoferritin cationized, המאשרלשנות בפוטנציאל משטח משלילי לחיובי (טבלה 1). ניסויים ספקטרומטריית מסה מצאו משקל מולקולרי למקטע של 20.1 kDa עבור apo-פריטין ו- 21.1 kDa מקוריים עבור (B איור 2) apo-פריטין cationized. עלייה המונית זו תואמת כ -12 מולקולות DMPA מצמידים לכל למקטע חלבון, ואת cationization של 288 שאריות על חלבון 24 למקטע כולו.

רווית רגישות מגנטית נמדדו באמצעות magnetometry תמנונים, רוחבי relaxivity האורך נמדדו באמצעות תהודה מגנטית. תכונות מגנטיות היו דומות magnetoferritin ו magnetoferritin cationized, המציין כי היה cationization השפעה זניחה על התכונות המגנטיות של SPION הסגור (טבלת 1). יתר על כן, מאפיינים אלה דומים חלקיקים מבוססי תחמוצת ברזל אחרים, 19,30 הוכחה כי cationized Magnetoferritin יהיה מתאים כמו סוכני SPION מבוסס קונבנציונליים ניגוד MRI בשיפור לעומת הדמיה.

לאחר חשיפה של 30 דקות, פני התא היה מכוסה בצפיפות magnetoferritin cationized (איור 3 א). עם זאת, לאחר שבוע, לא נמצאו חלקיקים על פני התא (איור 3 ב '). magnetoferritin Cationized היה יעיל להפליא hMSCs תיוג מגנטי. יש לציין, חשיפת תאי magnetoferritin cationized למשך דקה אחת הביאה המגנטיזציה של 92% של אוכלוסיית התא ואת הביצוע של 3.6 pg של ברזל לכל תא. הגדלת זמן הדגירה עד 15 דקות הביאו את המגנטיזציה של אוכלוסיית התא כולו (C איור 3).

figure-results-1
איור 1: אפיון magnetof ליבות erritin מסוממים עם 5% קובלט. תמונות TEM של magnetoferritin מוכתם aurothioglucose (א) ו בלא כתם (B). הבלעה מראה עקיפת אלקטרונים מקבילה עם מדדי מגנטיט. סרגל קנה מידה: 20 ננומטר. (C) ראמאן הספקטרום עבור magnetoferritin. החצים מציינים את מצבי רטט ראמאן העיקריים פרית קובלט (2G T), מגנטיט מגהמיט (הן A 1G). 31,32 אורך הגל לייזר המשמש היה 532 ננומטר. (תמונה מותאמת Okuda et al. 18). שים לב מדגם magnetoferritin זה היה מטוהרים נוספים באמצעות פרדה מגנטית, אשר מבודדת חלקיקי magnetoferritin טעונים באופן אחיד. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

785fig2.jpg "/>
איור 2: Cationization של magnetoferritin. א) ייצוגים שטח פנים נגישים מרכך המציגים את ההתפלגות (אדום חומצי) ובסיסיות (צהובות) שאריות חומצת אמינו על פני החלבון. Magnetoferritin (1) הוא שונה magnetoferritin cationized (2) על ידי crosslinking בתיווך carbodiimide של DMPA שאריות חומצת אמינו חומצי על פני החלבון (3). ב) ניתוח ספקטרומטריית מסה של יחידות משנה apo-פריטין ו cationized apo-פריטין. Mass-ל-תשלום (m / z) ספקטרום של apoferritin (ApoF) ו apoferritin cationized (חתול-ApoF) שנוצר על ידי MALDI-TOF. עלייה המונית 20.1 kDa כדי 21.1 kDa הוא ציין לאחר cationization. (תמונה המותאמת קוריאה Carreira et al. 15) נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

EP-together.within-page = "1"> figure-results-2
איור 3: תיוג מגנטי תא הפרדת hMSCs מודגרות עם magnetoferritin cationized. א) תמונת TEM של hMSCs לאחר הדגירה 30 דקות עם magnetoferritin cationized. החץ מעיד על קיומו של ליבות magnetoferritin צפופים על פני התא. ברי סולם: 200 ננומטר. B) תמונת TEM של hMSC שבוע לאחר תיוג. פני התא ברור של magnetoferritin cationized. ג) לחקור את המהירות של תיוג מגנטי: 92% מאוכלוסיית התא היה ממוגנטים לאחר חשיפה של דקה אחת עם 0.5 מיקרומטר cationized magnetoferritin, לבין אוכלוסיית התא כולו ממוגנטת תוך 15 דקות. תוכן ברזל לכל תא נקבע באמצעות ICP-OES. ממוצע וסטיית תקן משלושה ביולוגי משכפל מוצגת. (תמונה מותאמת קוריאה Carreira et al. 15) נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

MF חתול-MF
קוטר הידרודינמית [nm] 11.8 ± 1.1 12.5 ± 1.4
[MV] פוטנציאל זטה (-) 10.4 ± 0.2 8.3 ± 0.7
רגע רוויה מגנטי [Am 2 קילו -1] 54.9 ± 1.6 55.3 ± 1.4
רגישות Mass [x 10 4 מ 3 קילו -1] 1.75 ± 0.08 1.75 ± 0.07
Relaxivity אורך [sec -1 מ"מ -1] 2.6 ± 0.1 2.3 ± 0.1
Relaxivity רוחבי [sec -1 מ"מ -1] 44.6 ± 1.0 52.8 ± 0.8

טבלה 1: אפיון physicochemical של magnetoferritin (MF) ו magnetoferritin cationized (חתול-MF). (לוח מותאם קוריאה Carreira et al. 15)

דיון

TEM של דגימות magnetoferritin מוכתמות aurothioglucose חשף את מינרליזציה המוצלח של חלקיקים בתוך כלוב החלבון. עקיפת אלקטרוני ראמאן ניתוח של ליבת nanoparticle הצביעו על הנוכחות של פרית קובלט, המציין סימום מוצלח של ליבת ננו-חלקיקים עם קובלט. מכך ניתן להסיק כי חלקיקים מעורבת-תחמוצת יכול להיות mineralized בהצלחה בתוך חלל apo-פריטין. יתר על כן, אנו הראינו בעבר כי סימום קובלט ניתן לשנות על ידי שינוי כמות מבשר קובלט הוסיפה לתערובת התגובה, המאפשרת כוונון של התכונות המגנטיות. 18

סינתזת Magnetoferritin יכולה להתבצע במגוון של כלי, כל עוד הם בחוזקה סגר ויש יציאות גישה שדרכו מגיבים יכולים להיות הציגו (למשל, בקבוק תחתי עגול שלושה צוואר). טמפרטורת התגובה צריכה להישמר על 65 מעלות צלזיוס או על ידי נחת כלי השיטבאמבט מים / שמן או מתוך כלי כפול במעיל. הנה, השתמשנו במערכת של תא אלקטרוכימי פעמיים במקטורן לבצע את הסינתזה. כדי להבטיח סינתזה מוצלחת, שמירה על pH הנכונה והימנעות זיהום החמצן של התמיסות המימיות הוא קריטי. פתרונות מלח מתכת צריך תמיד להיות מוכן טרי לפני השימוש ולא מראש. יתר על כן, פתרונות apoferritin מסחריים יכולים להשתנות באיכות ולהשפיע תוצאת סינתזה (למשל., גודל mineralized ליבת ננו-חלקיקים). היא יכולה לסייע בהפחתת dialyze הפתרון apoferritin לתוך 50 מ"מ HEPES חיץ (pH 8.6) לפני סינתזה כדי להסיר כל סוכן שיורית צמצום בשימוש על ידי היצרן. כדאי לעשות לעצמך את מספר האצווה של הפתרון apo-פריטין המשמש לסינתזה, כך שהוא יכול להיות ביקש במפורש לקבל מהיצרן צריך הצורך חומר נוסף כדי לרכוש. יתר על כן, את ריכוז החלבון של זמינים מסחריים-פריטין apo יצוין על הבקבוק, אשר יכוללשמש כדי לחשב את עוצמת הקול של פתרון apo-פריטין הדרושים סינתזה. אם זה לא המקרה, פנה אל הספק לקבלת מידע זה.

היתרון של תוספת ההדרגתית של מלחי מתכות ואת מי חמצן - כפי שהוצג פה בדוחות קודמות - הוא כי מינרליזציה של ליבת nanoparticle ניתן לשלוט כאלה שגורמים טעינה שונה (כלומר, בגדלי ננו-חלקיקים) יכולים להיות מושגת. 33 יתר על כן, אפשר לטהר magnetoferritin נוספת באמצעות טור פרדה מגנטי, למשל, טור ארוז עם אבקת נירוסטה המאובטחת בתוך אלקטרומגנט. 34 לכן, מאוד ליבות nanoparticle monodisperse ניתן לבודד מן המדגם magnetoferritin בתפזורת. עם זאת, עבור תא תיוג מגנטי כפי שהוצג כאן זו אינה נדרשת. הגבלה של סינתזת magnetoferritin נקבעה בהתאם לתשואת סינתזה הנמוכה יחסית של כ -10%, ואת העלות הגבוהה יחסית של מסחר apo-Feפתרונות rritin. עם זאת, apo-פריטין יכול גם להיות מוכן מן טחול סוס בזול זמין פריטין ידי ביצוע פרוטוקולי דה-מינרליזציה הוקמו. 16

Cationization של magnetoferritin הושגה על ידי הוספת טוחנת יחס של 250 מולקולות של DMPA ו -50 מולקולות של EDC לכל שאריות מטען שלילי (חישובים המבוססים על רצף החומצות האמיניות של פריטין הטחול סוס). עודף זה של מגיב על חלבון הביא יעילות גבוהה cationization, דומה גם שדווח בעבר תוצאות עבור cationization של פריטין. 35 לניתוח MALDI-TOF, apoferritin ו cationized apoferritin שימשו בגלל המסה המולקולרית יתר של הליבה magnetoferritin. תשואה גבוהה יעילות cationization, חומציות אופטימלית היא גם חיונית. crosslinking בתיווך EDC הוא יעיל ביותר בתנאים חומציים במקצת, ומצאנו כי pH 5 הניבה תוצאות cationization אופטימליות magnetoferritin. עם זאת, עבור ג חלבונים אחריםpH ationization עשוי צריך להיות מותאם. Cationization בבית או קרוב לנקודת איזואלקטרית של חלבון יש להימנע, כיוון שהדבר עלול להוביל משקעים קשים.

המגנטיזציה תא גזע עם magnetoferritin cationized הייתה יעילה מאוד יכולה להיות מושגת באמצעות פעמי דגירה גם מתחת ל -30 דקות. אפילו דגירה של דקה אחת הביאה תכולת ברזל הסלולר של 3.6 pg, אשר נמצא בטווח דיווח נדרש להשפיע T2 ו- T2 * בניגוד עבור MRI. 36,37 זה גם ראוי לציון, כי תיוג יעיל זו מושגת עם ריכוזי ברזל תאיים נמוכים. לדוגמה, מחקרים קודמים באמצעות חלקיקים anionic מדווחים על רמות ברזל של 10 pg לכל תא לאחר תקופת דגירה של 30 דקות עם ברזל 5 מ"מ. 38 לשם השוואה, דגירה עם פתרון magnetoferritin cationized המכיל 0.5 מיקרומטר חלבון מתאימות דגירה עם כ 0.2 ברזל המ"מ וגם בתשואה של כ -10 pg של ברזל ל cell אחרי 30 דקות. לא הצלחנו לזהות שום שלפוחית ​​endocytotic בבירור באמצעות TEM. עם זאת, מחקרים קודמים באמצעות פריטין cationized מצאו כי הפנמה התרחשה בתוך עשר הדקות הראשונות של חשיפה. פריטין 39,40 Cationized יכול להיות מקומי שלפוחית מצופית, המציין אנדוציטוזה clathrin- או caveolin התלוי. אותו מחקרים דיווחו גם כי לאחר 30 דקות של דגירה, פריטין cationized היה עדיין קיים על פני התא, כמו גם בגופים multivesicular, הדומה lysosomes.

יישומים נוספים יכולים לכלול cationization של כלובי apo-פריטין עמוס חלקיקים אחרים ו / או מולקולות תפקודיות, כגון תרופות נוגדת סרטן 41 או 42 נקודות קוונטיות. Cationization של מבנים פריטין אלה עלולים לגרום משלוח מהיר ויעיל יותר של המטענים שלהם לתאים.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו מומנה באמצעות מרכז בריסטול לננו-חומרים פונקציונליים, בחסות מועצת המחקר להנדסה ומדעי הפיזיקה (קוד מענק EPSRC EP/G036780/1).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-פיפראזין-חומצה סולפונית (HEPES)Fisher ScientificBPE310-1; להכין תמיסת מלאי של 1 M ב-pH 8.6 ולדלל ל-50  מ"מ לפני השימוש. בדוק היטב את ה-pH לפני הסינתזה!
אפופריטין מטחול סוסיםסיגמא אולדריץ'A3641השתמשנו ב- LOT # 081M7011V
קובלט סולפט heptahydrate Sigma AldrichC6768מכינים תמיסות טריות מהמלח לפני הסינתזה
אמוניום ברזל סולפט hexahydrate Sigma AldrichF1543מכינים תמיסות טריות מהמלח לפני הסינתזה
תמיסת מי חמצן (30%)Sigma Aldrich216763מכינים תמיסות טריות מהמלח לפני הסינתזה
נתרן ציטראטSigma AldrichS1804; ניתן להכין תמיסה של 1 M ולשמור בטמפרטורת החדר למשך מספר חודשים
יחידת סינון Millex GP, 0.22  מיקרוןMerck Milliporeמסנן מזרקSLGP033RS
TrizmaSigma AldrichT1503; להכין תמיסת מלאי של 1 M ב-pH 8.0 ולדלל ל-50  mM לפני השימוש
בנתרן כלוריSigma Aldrich31434poweder; להוסיף למאגרים לפי הצורך
יחידות סינון צנטריפוגליות CentriprepMerck Millipore4310Ultracel YM-50 ממברנה, נפח 12 מ"ל; להשתמש לריכוז ראשוני עד לריכוז תמיסת המגנטופריטין מכ-150 מ"ל ל-20  מ"ל
מסנן צנטריפוגלי Amicon Ultra-4 untisMerck MilliporeUFC801024Ultracel-10 ממברנה, 4  נפח מ"ל; להשתמש לריכוז תמיסת מגנטופריטין מכ-20 מ"ל ל-  2 מ"ל
ANX Sepharose 4 זרימה מהירהGE Healthcare17-1287-04ארזנו את הטור הזה בעצמנו
HiPrep 26/60 Sephacryl S-300 HR טור GE Healthcare17-1196-01טור זה נקנה מוכן ארוז
Ä מערכת מטהר KTAHealthcare28406264
משאבת דגימה P-960GE Healthcare18-6727-00דגימת עומס בקצב זרימה של 10 מ"ל לדקה
אספן שברים אוטומטי Frac-950GE Healthcare18-6083-00
מגיב בדיקת ברדפורדסיגמא אולדריץ'B6916מוכן לשימוש
פריטין, סוג I: מטחול סוססיגמא אולדריץ'F4503מכינים תקני פריטין מתמיסה זו לקביעת ריכוז מגנטופריטין
N,N-dimethyl-1,3-propanediamine (DMPA)Sigma Aldrich308110זהירות: בעת התאמת ה-pH של תמיסת DMPA, בצע שלב זה במכסה אדים
N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride ( EDC)Sigma AldrichE6383שומרים במקפיא אך מביאים לטמפרטורת החדר לפני פתיחת הבקבוק
2-(N-morpholino) חומצה אתנסולפונית (MES)AppliChemA0689,0500אבקה; הכן תמיסת מלאי של 200 M ב-pH 5
צינורות דיאליזה קרום תאיתSigma AldrichD9652יש להשרות 10 דקות במים נטולי יונים לפני השימוש
דולבקו s Modified Eagle' s בינוני (DMEM), 1,000 מ"ג/ליטר גלוקוזSigma AldrichD5546חם ב-37 מעלות; אמבט מים C לפני השימוש
סרום בקר עובריSigma AldrichF7524הוסף למלאי בקבוק DMEM, 10% (v/v)
תמיסת פניצילין/סטרפטומיציןSigma AldrichP0781הוסף למלאי בקבוק DMEM, 1% (v/v)
תמיסת גלוטמקסGibco35050-087הוסף למלאי בקבוק DMEM, 1% (v/v) ריכוז סופי
גורם גדילה פיברובלסטים אנושיPeproTech100-18Bמוסיפים ל-DMEM טרי לתוך בקבוק תרבית תאים עם כל החלפת מדיה; ריכוז סופי 5 ננוגרם/מ"ל
תמיסת מלח חוצצתפוספט Sigma AldrichD8537תמיסה סטרילית,
לתמיסת טריפסין/EDTASigma AldrichE5134שומרים במקפיא ומפשירים ב-37  ° אמבט מים C לפני השימוש
בחומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA)אבקת Sigma AldrichE5134; הכינו תמיסה של 2 מ"מ ב-PBS 
אלבומין סרום בקרSigma AldrichA7030מוסיף 0.5% (w/v) ל-2  פתרון mM EDTA ב-PBS; מערבבים בזהירות עם מערבל מגנטי, הימנעו מקצף; מסנן לעקר דרך מסנן מזרק 0.22 מיקרון
MACS multi stand Miltenyi Biotec130-042-303לחיבור מגנט MACS
עמודות MACS MSMiltenyi Biotec130-042-201חד פעמי; מיועד לשימוש חד פעמי, אך אם אין צורך בסטריליות, ניתן לעשות בהם שימוש חוזר: לשטוף במים נטולי יונים ו-100% אתנול, ולהכניס לתנור ייבוש; להשליך אם אתה מבחין במדבקות חלודות
מגנט מפריד MiniMACSMiltenyi Biotec130-042-102ניתן לקנות כערכת התחלה, יחד עם עמודים ומעמדים
מסנן הפרדה מראש של עמודות MACSMiltenyi Biotec130-041-407מסנן 30 מ"מ
תמיסת חומצה חנקתית, 64-66%סיגמא אולדריץ'7006
טיטרנדו 907, משאבת מזרקMetrohm2.907.0020
<חזק>ציוד המשמש לאפיון מגנטופריטין ומגנטיטופריטין קטיונימכשירים מולקולריים
SpectraMax M5המשמשים למדידת ספיגה בבדיקת ברדפורד
UltrafleXtremeApplied Biosystemsהמשמש לניתוח MALDI-TOF של אפופריטין ואפופריטין קטיוני
ZetaSizer Nano-ZSMalvern מכשיריםהמשמשים למדידת קוטר הידרודינמי ופוטנציאל זטה של מגנטופריטין ומגנטיטופריטין קטיוני
מערכת מדידת מאפיינים מגנטייםעיצובמשמש למדידת מומנט רוויה מגנטית ורגישות מגנטית
מגנטום SkyraSiemensמשמש לקביעת הרפיה אורכית ורוחבית 
Tecnai 12 BioTwin SpiritFEIמשמש להדמיית TEM של hMSC המסומן במגנטופריטין קטיוני
710 ICP-OESAgilentמשמש לקביעת תכולת ברזל בתאים
אבקת בסיס אבקת GE בריכוז סופי בריכוז סופי של תאים JEM 1200 EX JEOL משמש להדמיית TEM של מגנטופריטין ספקטרומטר InVia Raman Renishaw משמש לספקטרוסקופיה של רמאן טורוס DPSS לייזר לייזר קוונטי המשמש לספקטרוסקופיה של ראמאן ברוקר קוונטי

מקורות

  1. Gupta, A. K., Gupta, M. Synthesis and surface engineering of iron oxide nanoparticles for biomedical applications. Biomaterials. 26 (18), 3995-4021 (2005).
  2. Decuzzi, P., Ferrari, M. The role of specific and non-specific interactions in receptor-mediated endocytosis of nanoparticles. Biomaterials. 28 (18), 2915-2922 (2007).
  3. Cunningham, C. H., et al. Positive contrast magnetic resonance imaging of cells labeled with magnetic nanoparticles. Magn. Reson. Med. 53 (5), 999-1005 (2005).
  4. Song, H. T., et al. Surface modulation of magnetic nanocrystals in the development of highly efficient magnetic resonance probes for intracellular labeling. J. Am. Chem. Soc. 127 (28), 9992-9993 (2005).
  5. Daldrup-Link, H. E., et al. Targeting of hematopoietic progenitor cells with MR contrast agents. Radiology. 228 (3), 760-767 (2003).
  6. Singh, N., Jenkins, G. J., Asadi, R., Doak, S. H. Potential toxicity of superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPION). Nano Rev. 1, (2010).
  7. Dodd, S. J., et al. Detection of single mammalian cells by high-resolution magnetic resonance imaging. Biophys. J. 76 (1), 103-109 (1999).
  8. Ahrens, E. T., Feili-Hariri, M., Xu, H., Genove, G., Morel, P. A. Receptor-mediated endocytosis of iron-oxide particles provides efficient labeling of dendritic cells for in vivo MR imaging. Magn. Reson. Med. 49 (6), 1006-1013 (2003).
  9. Arbab, A. S., et al. Efficient magnetic cell labeling with protamine sulfate complexed to ferumoxides for cellular MRI. Blood. 104 (4), 1217-1223 (2004).
  10. Bulte, J. W. M., et al. Magnetodendrimers allow endosomal magnetic labeling and in vivo tracking of stem cells. Nat. Biotechnol. 19 (12), 1141-1147 (2001).
  11. Josephson, L., Tung, C. H., Moore, A., Weissleder, R. High-efficiency intracellular magnetic labeling with novel superparamagnetic-tat peptide conjugates. Bioconjugate Chem. 10 (2), 186-191 (1999).
  12. Lewin, M., et al. Tat peptide-derivatized magnetic nanoparticles allow in vivo tracking and recovery of progenitor cells. Nat. Biotechnol. 18 (4), 410-414 (2000).
  13. Hunter, A. C. Molecular hurdles in polyfectin design and mechanistic background to polycation induced cytotoxicity. Adv. Drug Delivery Rev. 58 (14), 1523-1531 (2006).
  14. Montet-Abou, K., Montet, X., Weissleder, R., Josephson, L. Cell internalization of magnetic nanoparticles using transfection agents. Mol. Imaging. 6 (1), 1-9 (2007).
  15. Correia Carreira,, S,, et al. Ultra-fast stem cell labelling using cationised magnetoferritin. Nanoscale. 8 (14), 7474-7483 (2016).
  16. Meldrum, F. C., Heywood, B. R., Mann, S. Magnetoferritin: in vitro synthesis of a novel magnetic protein. Science. 257 (5069), 522-523 (1992).
  17. Klem, M. T., et al. Synthetic control over magnetic moment and exchange bias in all-oxide materials encapsulated within a spherical protein cage. J. Am. Chem. Soc. 129 (1), 197-201 (2007).
  18. Okuda, M., Eloi, J. C., Sarua, A., Jones, S. E. W., Schwarzacher, W. Energy barrier distribution for dispersed mixed oxide magnetic nanoparticles. J. Appl. Phys. 111 (7), (2012).
  19. Uchida, M., et al. A human ferritin iron oxide nano-composite magnetic resonance contrast agent. Magn. Reson. Med. 60 (5), 1073-1081 (2008).
  20. Danon, D., Skutelsk E, M. arikovsY., Goldstei, L. Use of Cationized Ferritin as a Label of Negative Charges on Cell Surfaces. J. Ultrastruc. Res. 38 (5-6), 500-510 (1972).
  21. Valero, E., et al. Magnetic Nanoparticles-Templated Assembly of Protein Subunits: A New Platform for Carbohydrate-Based MRI Nanoprobes. J. Am. Chem. Soc. 133 (13), 4889-4895 (2011).
  22. Zborowski, M., et al. Immunomagnetic isolation of magnetoferritin-labeled cells in a modified ferrograph. Cytometry. 24 (3), 251-259 (1996).
  23. Ikezoe, Y., et al. Growth of Giant Two-Dimensional Crystal of Protein Molecules from a Three-Phase Contact Line. Langmuir. 24 (22), 12836-12841 (2008).
  24. Uchida, M., et al. Targeting of cancer cells with ferrimagnetic ferritin cage nanoparticles. J. Am. Chem. Soc. 128 (51), 16626-16633 (2006).
  25. Yamashita, K., et al. Selective nanoscale positioning of ferritin and nanoparticles by means of target-specific peptides. Small. 2 (10), 1148-1152 (2006).
  26. Williams, A., Frasca, V., et al. UNIT 8.2 Ion-Exchange Chromatography. Current Protocols in Protein Science. Coligan, J. E., et al. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
  27. Hagel, L., et al. UNIT 8.3 Gel-Filtration Chromatography. Current Protocols in Protein Science. Coligan, J. E., et al. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
  28. Hou, X., Jones, B. T. Inductively coupled plasma-optical emission spectrometry. In Encyclopedia of Analytical Chemistry. Meyers, R.A. ed. , John Wiley & Sons, Ltd. 1(2000).
  29. Correia Carreira, S., et al. Ultra-fast stem cell labelling using cationised magnetoferritin. Nanoscale. , (2016).
  30. Simon, G. H., et al. T1 and T2 relaxivity of intracellular and extracellular USPIO at 1.5 T and 3T clinical MR scanning. Eur. J. Radiol. 16 (3), 738-745 (2006).
  31. Jubb, A. M., Allen, H. C. Vibrational Spectroscopic Characterization of Hematite, Maghemite, and Magnetite Thin Films Produced by Vapor Deposition. ACS Appl. Mater. Interfaces. 2 (10), 2804-2812 (2010).
  32. Wang, Z. W., et al. High-pressure x-ray diffraction and Raman spectroscopic studies of the tetragonal spinel CoFe2O4. Phys. Rev. B. 68 (9), (2003).
  33. Wong, K. K., Douglas, T., Gider, S., Awschalom, D. D., Mann, S. Biomimetic synthesis and characterization of magnetic proteins (magnetoferritin). Chem. Mater. 10 (1), 279-285 (1998).
  34. Okuda, M., et al. Fe3O4 nanoparticles: protein-mediated crystalline magnetic superstructures. Nanotechnology. 23 (41), 415601(2012).
  35. Perriman, A. W., Cölfen, H., Hughes, R. W., Barrie, C. L., Mann, S. Solvent-Free Protein Liquids and Liquid Crystals. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (34), 6242-6246 (2009).
  36. Billotey, C., et al. T-cell homing to the pancreas in autoimmune mouse models of diabetes: in vivo MR imaging. Radiology. 236 (2), 579-587 (2005).
  37. Smirnov, P., et al. In vivo cellular imaging of lymphocyte trafficking by MRI: a tumor model approach to cell-based anticancer therapy. Magn. Reson. Med. 56 (3), 498-508 (2006).
  38. Wilhelm, C., et al. Magnetic control of vascular network formation with magnetically labeled endothelial progenitor cells. Biomaterials. 28 (26), 3797-3806 (2007).
  39. MacLean, I., Sanders, E. Cationized ferritin and phosvitin uptake by coated vesicles of the early chick embryo. Anat. Embryol. 166 (3), 385-397 (1983).
  40. Van Deurs, B., Nilausen, K., Faergeman, O., Meinertz, H. Coated pits and pinocytosis of cationized ferritin in human skin fibroblasts. Eur. J. Cell Biol. 27 (2), 270-278 (1982).
  41. Xing, R. M., et al. Characterization and cellular uptake of platinum anticancer drugs encapsulated in apoferritin. J Inorg Biochem. 103 (7), 1039-1044 (2009).
  42. Wong, K. K., Mann, S. Biomimetic synthesis of cadmium sulfide-ferritin nanocomposites. Adv. Mater. 8 (11), 928-932 (1996).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

TEM

מאמרים קשורים