התפתחות כאב נוירופתי כרוך שינויים פתולוגיים של תאי גלייה בחוט השדרה. מערכת תרבות גליה אמינה נגזרה רקמת חוט שדרה מבוגרת ועוצבה ללימוד תאים אלה במבחנה חסרה. לכן, אנו מציגים כאן כיצד להקים תרבויות גליה מעורבות עיקריות מרקמות כבל מבוגר עכבר שדרה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הכנת תרבויות גליה מעורבת ראשיים מרקמות קורד למבוגרים עכבר השדרה
במאמר זה
סיכום
תקציר
זה כבר טוב כי קיבל תגובות גליה בחוט השדרה לתרום רבות להתפתחות כאב נוירופתי. מידע עצום בנוגע לפעילות גליה ברמות התאיות ומולקולריות הושג באמצעות מערכות תרבות תאים במבחנה. המערכות חוץ הגופייה המנוצלת, כוללות בעיקר גליה עיקרית נגזרה רקמת קליפת מוח מוח בילוד והנציחו שורות תאים. עם זאת, מערכות אלה לא יכולים לשקף את המאפיינים של תאי גלייה בחוט השדרה in vivo. כדי להמשיך לחקור את התפקידים של תאים גליה בחוט השדרה בפיתוח בכאב עצבי-induced פגיעה עצבית היקפית באמצעות מערכת תרבות משקפת טוב יותר את מצב in vivo, במעבדה שלנו פיתחה שיטה להקים תרבויות גליה מעורבת חוט השדרה העיקרי מן עכברים בוגרים. בקצרה, נאספים מיתרי השדרה של עכברים בוגרים ומעובד באמצעות עיכול פפאין ואחריו הסרת המיאלין עם מאורותity-שיפוע בינוני. המתלים תא בודדים בתרבית תקשורת הנשר השונה של שלמה Dulbecco (cDMEM) בתוספת 2-mercaptoethanol (2-ME) ב 35.9 מעלות צלסיוס תנאי תרבות אלה מותאמים במיוחד עבור הצמיחה של תאי גליה מעורבים. בתנאים אלה, תאים מוכנים לשמש לניסויים בין 12 - 14 ד (תאים הם בדרך כלל בשלב יומן במהלך הזמן הזה) לאחר הקמת התרבות (D 0) ו יכולים להישמר בתנאי תרבות עד D 21. מערכת תרבות זו יכולה לשמש כדי לחקור את התגובות של תאי גלייה בחוט שדרה על גירוי עם חומרי סוכנים שונים. מלבד כאב נוירופתי, מערכת זו יכולה לשמש כדי לחקור תגובות גליה במחלות אחרות שכוללות שינויים פתולוגיים של תאי גלייה בחוט שדרה.
מבוא
כאב כרוני הוא בעיה בריאותית חמורה המשפיעה על כ -100 מיליון מבוגרים בארצות הברית, עם עלות שנתית משוערת של עד 635 מיליארדים $ 1. ראיות מצטבר ציינו תרומה משמעותית של תאי גלייה בחוט שדרה בפיתוח בכאב עצבי, אחד המיני ההרסני ביותר של כאב כרוני 2. מערכת תרבות ראויה במבחנה תעזור משמעותית נוספים חוקרים את התפקידים של ותאי גלייה ברמות התאיות ומולקולריות.
נכון לעכשיו, מערכות התרבות גליה במבחנה מנוצלות על ידי חוקרים כוללות בעיקר תאי גלייה נגזרו רקמות קליפת מוח של מוח עכבר או עכברוש בילוד והנציחו שורות תאי גליה הנגזרות עכבר בילוד או ל....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הפרוטוקול הבא אושר על ידי ועדת הטיפול בבעלי החיים המוסדית השתמש (IACUC) באונ' ניו אינגלנד. פרוטוקול להלן להכנת תרבויות גליה מ -4 מיתרי השדרה עכבר בוגר.
1. הכנת פתרונות במנדף תרבות בתנאי aseptic
- כן תקשורת תרבות: השינוי של Dulbecco המלא של התקשורת של הנשר (cDMEM) המכיל DMEM (עם 4.5 g / גלוקוז L), 10% בסרום שור עובר (FBS), 2 מ"מ L- גלוטמין, 100 פניצילין IU / mL, 100 מ"ג / mL סטרפטומיצין ng, 250 / מ"ל Amphotericin B, ו -50 מיקרומטר 2-mercaptoethanol (2-ME, ראה 1.1.1). ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
שיטה זו יכולה לשמש כדי להכין ותאי גלייה מעורבים משני עכברים וחולדות. מספר התאים הכולל ממוצע לכל היטב צלחת 12 גם ב -12 D-ייזום פוסט של התרבות צריך להיות יציב יחסית, עם כ 100,000 תאים לכל טוב כאשר תאים נגזרים מייתרי שדרת עכבר. תאי גלייה המתקבלים בשיטה זו ניתן להשתמש בניסויים שנועדו לבחון את תגובות גליה בחוט שדרה מבוגרות על מתן חומרים והסוכנים של עניין. איור 3 מספק דוגמא של תגובות ציטוקינים ו chemokine מניסוי טיפוסי אחד שבו microglia .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
זה קריטי כדי לבצע את כל השלבים, כולל בתקשורת שינוי לוח זמנים-באופן עקבי על מנת לקבל תוצאות לשחזור בין ניסויים. השלבים הבאים הם קריטיים במיוחד בהשגת גליה מעורבת מבוגרים באיכות מעולה.
עיכול אנזימטי הוא היבט חשוב של פרוטוקול זה. זה חיוני כי פיסות הרקמה הם גם מתעכל כדי לקבל השעיה תא בודד. עם זאת, יתר העיכול יגרום פחות תאים משמעותיים. מעבדה כל צריך לבצע בדיקות ניסיוניות לקביעת זמן עיכול המדויק המבוסס על סוגי הבקבוקוני.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
תרביות מעורבות של חוט השדרה למבוגרים פותחו לראשונה באמצעות חולדות בתמיכת מענק מפרס NIH/NIDA R01 (PI De Leo) ומענק הכשרה של NIH T32 (PI Green). שיטות אלה הותאמו עוד יותר לחוט השדרה של עכברים בתמיכת המענקים הבאים: NIH/NIDA 5K01DA023503 (PI Cao), NIH/NINDS 5R21NS066130 (PI Cao) ו-NIH/NIGMS P20GM103643 (PI Meng). המחברים רוצים גם להודות לד"ר אלחנדרו מאייר, המחלקה לפרמקולוגיה, מכללת שיקגו לרפואה אוסטאופתית, על עזרתו הטכנית בהשגת תאי גליה מעורבים עשירים במיקרוגליה.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| דולבקו s שינוי של Eagle' s media (DMEM) עם 4.5 גרם/ליטר גלוקוז | Lonza | 12-709F | מדיית cDMEM היא מדיית תרבית סטנדרטית בשימוש נרחב. חוקרים בודדים יכולים להחליט היכן לרכוש את ה-DMEM ואת כל הרכיבים האחרים המשמשים לייצור מדיה cDMEM. |
| L-גלוטמין (100x) | לונזה | 17-605E | ה-L-גלוטמין הוא רכיב סטנדרטי בשימוש נרחב עבור מדיות תרבית שונות. חוקרים בודדים יכולים להחליט היכן לרכוש L-גלוטמין. |
| תמיסה אנטיביוטית-אנטי-פטרייתית (100x) | Corning-Mediatech | 30-004-CI | זהו שילוב של פניצילין, סטרפטומיצין ואמפוטריצין שנוסח להכיל 10,000 יחידות/מ"ל פניצילין G, 10 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין סולפט ו-25 מיקרו; גרם/מ"ל אמפוטריצין B. חוקרים בודדים יכולים להחליט היכן לרכוש רכיבים בודדים. |
| 2-מרקפטואתנול (2-ME) | סיגמא-אולדריץ' | M3148 | מגיב ביולוגי, מתאים לתרבית תאים, ביולוגיה מולקולרית ואלקטרופורזה. |
| מערכת דיסוציאציה פפאין | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | ניתן לרכוש רכיבים בודדים של ערכה זו בנפרד. |
| Percoll | GE Health Care | 17-0891-01 | Percoll נמכר כתמיסה סטרילית. ניתן לבצע חיטוי מחדש של פרקול לא מדולל במידת הצורך. |
| חממה/שייקר של קו מעבדה | Barstead/Lab-line | MaxQ4000 | זו החממה/שייקר שיש לנו כרגע. ניתן להשתמש בסוגים אחרים של שייקרים במקום. |
| ליפופוליסכרידים, Salmonella Minnesota Re595 | Sigma-Aldrich | L-9764 | זנים אחרים של LPS יכולים גם הם לגרום לתגובות גליה. עם זאת, היקף התגובות עשוי להשתנות. |
| עכבר IL-6 DuoSet ELISA | מו"פ D Systems | DY406 | כל חוקר בודד יכול לבחור את ערכת ELISA המועדפת עליו. |
| עכבר TNF-alpha DuoSet ELISA | R& D Systems | DY410 | כל חוקר בודד יכול לבחור את ערכת ELISA המועדפת עליו. |
| עכבר IP-10 (CXCL10) DuoSet ELISA | R& D Systems | DY466 | כל חוקר בודד יכול לבחור את ערכת ELISA המועדפת עליו. |
| עכבר MCP-1 (CCL2) ELISA Opteia set | BD Biosciences | 555260 | כל חוקר בודד יכול לבחור את ערכת ELISA המועדפת עליו. |
| כימוקין עכבר Q-Plex | Quansys Biosciences | 120251MS | מוצר זה לא היה זמין לבדיקה פנימית באותה עת. במקום זאת, שלחנו דגימות ליצרן לניתוח. |
| APC-anti-mouse-CD45 (clone 30-F11) | eBioscience | 17-0451 | ניתן להשתמש בנוגדנים מאותו שיבוט אך מספקים אחרים. |
| FITC-anti-mouse-CD11b (clone M1/70) | eBioscience | 11-0112 | ניתן להשתמש בנוגדנים מאותו שיבוט אך מספקים אחרים. |
| ציטומטר זרימה Accuri C6 | BD Biosciences | BD Accuri C6 | כל חוקר יכול להשתמש בכל ציטומטר זרימה שהוא מעדיף. |
| תוכנת FlowJo | Tree Star, Inc. | FlowJo7.6.5 | כל חוקר יכול להשתמש בכל תוכנת ניתוח שהוא מעדיף. |
מקורות
- Gaskin, D. J., Richard, P. The economic costs of pain in the United States. J Pain. 13 (8), 715-724 (2012).
- Ji, R. R., Berta, T., Nedergaard, M. Glia and pain: Is chronic pain a gliopathy? Pain. 154 (01), S10-S28 (2013).
- Ni, M., Aschner, M., et al. Neonatal rat primary icroglia: isolation....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
