שיטת הזרקה אלטרנטיבית והמאומתת עבור גישת שטח subretinal דרך בגישה אחורית Transcleral

Summary

זריקות תת-רשתית הן הטכניקה הנפוצה ביותר להעברת חומרים טיפוליים גדולים כגון חלבונים ווקטורים נגיפיים לקולטני האור ולאפיתל הפיגמנט ברשתית. שיטה חלופית בעכברים המכוונת בהצלחה לחלל התת-רשתית עם נזק אגבי מינימלי וזמני התאוששות מהירים מתוארת כאן.

Abstract

זריקות subretinal שימשו בהצלחה בשני בני אדם ומכרסמים לספק התערבויות טיפוליות של חלבונים, סוכנים ויראלי, ותאי לתא interphotoreceptor / subretinal כי יש חשיפה ישירה קולטני האור ואת אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE). זריקות subretinal של plasminogen וכן ניסויים פרה-קליניים וקליניים האחרונים הוכיחו בטיחות ו / או יעילות של מתן וקטורים ויראליים ותאי גזע ליחידים עם מחלת רשתית מתקדמת. מודלים עכבר של מחלת רשתית, במיוחד dystrophies רשתית תורשתי, חיוניים לבדיקת לטיפולים אלה. הליך ההזרקה הנפוץ ביותר במכרסמים הוא להשתמש transcorneal הקטן או חתכי transcleral עם גישה קדמית לרשתית. עם גישה זו, מחט הזריקה חודר הרשתית הנוירו לשבש את הרשתית הבסיסית ועל החדרת יכול בקלות ניק העדשה, גרימת עכירות העדשה וירידת ערך Imagi פולשניתng. גישה למרחב subretinal באמצעות transcleral, גישה אחורית תמנע בעיות אלה: המחט חוצה את בלובן העין כ 0.5 מ"מ מן עצב הראייה, ללא חדירת רשתית ונמנעה לשבש את הזגוגית. נזק סביבתי מוגבל כי הקשורים מוקדי sclerotomy ואת ההשפעות של חולף, היפרדות רשתית הצפק. הפשטות של השיטה ממזער פגיעה עינית, מבטיחה שחיבור רשתית מהיר והתאוששות, ויש לו שיעור כישלון נמוך. הניזק המינימאלי רשתית הרשתית מאפשר הערכה ברורה של יעילויות התרופות ותופעות ישירות של הסוכנים הטיפוליים עצמם. כתב יד זה מתאר טכניקת ההזרקה subretinal הרומן, שניתן להשתמש בהם כדי למקד וקטורים ויראליים, סוכני תרופתי, תאי גזע או גזע מושרים (iPS) תאים למרחב subretinal בעכברים עם יעילות גבוהה, נזק מינימלי, והתאוששות מהירה.

Introduction

זריקות subretinal הן האמצעי העיקרי של אספקת סוכנים הסלולר ויראלי אל הרשתית של עכברים ללמוד והשפיע על קולטני אור ואת ^1,2 שבבסיס הרשתית. רוב פרוטוקולי הזרקת subretinal בעכברים להשתמש transcorneal או קדמי זריקת transcleral לקו המשווה (איור 1). גישה זו יכולה לגרום נזק סביבתי הגלום הכולל שסחב ו ערפול כתוצאה של העדשה, שיבוש של שלמות, חדירה הזגוגית של הרשתית הנוירו ואיריס, דימום ברשתית, היפרדות רשתית משמעותי ובצקת subretinal קיימא ^3-9. מניפולציות ניסוייות חייבות להתגבר על תופעות אלה על מנת להעריך את ההשפעות של התערבויות טיפוליות ^3,7,10,11. מחקר זה מספק תיאור מפורט ואימות של שיטת הזרקה אחורית transcleral כי תמנע סיבוכים אלה, ממזער טראומה בעל שיעור הצלחה גבוה של מיקוד המשנהשטח הרשתית.

זריקות מיקוד במרחב subretinal בעכברים הן בדרך כלל מאוד קשות לביצוע רוב החוקרים נתקלים בתדירות גבוהה של ניסיונות כושלים שבו הווקטור מועבר על מיקום לא נכון או שיש פגיעה ברשתית משמעותית, למשל היפרדות רשתית מלאה ^6. מספר העיניים מחוץ ניתוח עקב סיבוכי הזרקת בדרך כלל אינו מדווח במחקרי עכבר, אבל הניסיון שלנו והן בדיון עם חוקרים אחרים, מספר זריקות נכשלו יכולה להיות גבוהים ככל 50% ולגוון תלוי הניסיון יכולות של החוקר שמבצע את הזריקות. ההצלחה של ההזרקה נבחנת בדרך כלל על ידי הדמיה הפונדוס ישירה ו / או טומוגרפיה קוהרנטיות אופטית (אוקטובר) ^7,9. שיטה לשלוט בקלות עם שיעורי הצלחה גבוהים עבור זריקות subretinal בעכברים יכול לזרז ניסויים ולהפחית את העלות של מחקרים פרה של טרהatments למחלות רשתית כי הם הגורמים העיקריים לעיוורון בארצות הברית.

האחורי, טכניקת הזרקת subretinal transcleral המתוארת כאן היא עיבוד פרוטוקולים קליניים פרה-קליניים ^9,12. הערכות האבחנתיות פולשנית שבוצעו עכברים שהוזרקו להדגים ניזק עדין מאוד מקומי וחסרי עדשה בטוחה נוספת ברשתית ופגיעת רשתית. יתר על כן, עם קצת אימון יחסית, נסיין יכול להשיג את התוצאות הללו עם שיעור הצלחה גבוה (80 - 90% או יותר), ובכך להפחית את העלויות הכרוכות מחקרים כאלה. הליך זה יכול לשמש כדי לספק הסלולר, ויראלי, או התערבויות טיפוליות תרופתיות כדי קולטני אור ו / או רשתית במחקרים פרה-קליניים להעריך התערבויות ניסיוני בקלות.

Protocol

בעלי חיים: סוג Wild עכברים C57Bl / 6J bred באוניברסיטת קליפורניה בלוס אנג'לס (UCLA). כל בעלי החיים היו בין 11 - בן 17 שבועות, וכלל זכר עכברות. כל העכברים היו שוכן קבוצה, שמור מחזור אור / חושך 12:12 עם כרצונך מזון ומים. כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות של UCLA והאגודה לחקר חזון הצהרת עיניים לשימוש של בעלי חי עיניים ו Vision Research.

הערה: כל התרופות והסוכנים להזרקה הן ארצות הברית Pharmacopeia (USP) ציון.

1. הכנת כירורגים

1. להרדים את העכבר עם זריקת intraperitoneal של 100 מ"ג / קילו קטמין ו xylazine 8 מ"ג / קילו תערובת מלוחה. נהל הרדמה עד לעומק כך העכבר אין קמצוץ בוהן או רפלקסים מגע קרניים.
2. לשמור על טמפרטורת הגוף על 37.0 מעלות צלזיוס עם כרית מים במחזור.
3. מתרחב תלמידים עם ד עין phenylephrine 2.5%ROPs לקצץ שפם כדי להקל להדמיה. שפם לספק קלט חושי משמעותי העכבר, ולכן, זיף זמירה צריך להסיר רק את החלק כי גישה חוסמת ברורה לעין, ולא בבסיס השערה. מניסיוננו, עכברים להראות התאוששות רגילה לאחר הליך זה. החל עין methylcellulose טיפות למניעת יובש ולמזער קטרקט חולף מושרה הרדמת ^13.
4. לעקר מכשירים לפני ניתוח (כלומר, בבטאדין ואתנול או חרוזים חמים).
5. כן והעמסה מדוללת (0.01% באמצעות מי מלח 0.9%) בסביבת סטרילית (כלומר, ארון בטיחות ביולוגי) אם להדמיה תבוצע (ראה סעיף 3 להלן).

2. הזרקת הכנת האתר

1. הכין מזרק (למשל, 5 μl מזרק) עם נפח ההזרקה המתאים (למשל, 0.3 כדי 1.0 מיקרוליטר).
2. מקם את העכבר כך העין פונה כלפי מעלה נראה בבירור dissecting מיקרוסקופ.
3. בעדינות קמצוץ הלחמית הזמני עם מלקחיים קנס היטה. לעשות חתך היקפי של כ 90 מעלות באמצעות מספרי Vannas מעוקלים.
4. חזור על שלב 2.3 עם הקפסולה של שבבסיס שֶׁגֶם.
5. לכרות את רקמת החיבור שמסביב עם מלקחיים קנס היטה תוך סיבוב הגלובוס nasally. לפעול הזריקה כ 0.5 מ"מ הזמני אל עצב הראייה. השתמש בזהירות רבה כדי למנוע שיבוש סינוס רטרו מסלולית.

הזרקת 3. Sclerotomy ו subretinal

הערה: מומלץ כי הזרקת והעמסת 0.01% ב 0.9% מלוחים לשמש כדי לסייע עם להדמיה תוך לימוד הליך זה. החלוקה הטופוגרפית של והעמסה אפשר לתעד בצורה יעילה עם הדמיה הפונדוס (ראה סעיף 4 להלן).

1. ביצוע חתך scleral קטן במקום הזרקה ידי גירוד עיינית בעדינות עם להב עיני 22.5 מעלות. שו חתך זהLD להיות גדול מספיק רק כדי לאפשר את קצה המחט לעבור דרך בלובן העין.
2. הכנס את המחט מהשופעת 33 G (זוויתי 5 -. 10 ° לתוך sclerotomy עם שפוע פונה ובמקביל זוויתי לרשתית להזריק נפח רצוי (למשל, 0.3 ל 1.0 מיקרוליטר של 0.01% והעמיסו למטרות למידה).
   הערה: לשמור על סטריליות של המזרק על ידי ניקוי יסודי עם שטיפות רצופות של ממס מתאים DI מים לפני כל זריקה.
3. לוחץ על המתג לאט (מעל ~ 3 שניות) מבלי להזיז את המחט עם הפעלת לחץ.
   הערה: כאשר המחט נמצאת במרחב subretinal, התנגדות קלה תורגש בעוד מדכא את הבוכנה. לא יהיה התנגדות מינימאלית אם מחט מפוצצת הרשתית, עמידות גבוהה אם המחט אינה חודרת בלובן העין או רשתית.
4. חכו כמה שניות לפני הוצאת המחט כדי למזער backflow.
5. יש לשטוף את העין עם בופר סטרילי ולהבטיח את h העיןכמו לסובב בחזרה למצב הרגיל שלו.

הערכה 4. של הפרדות רשתית על ידי אוקטובר ו הפונדוס הדמיה

1. בצע הדמיה אוקטובר מיד לאחר ההזרקה כדי להעריך את איכות הזריקה בשלב המתאים מצביע לאחר ההזרקה לפי הצורך להעריך מבנה הרשתית.
   הערה: דוגמאות לשימוש של אוקטובר במחקרים דומים תוארו בעבר ^7,14.
   1. התאם וליישר את התמונה אוקטובר למקד באתר ההזרקה. הזריקה צריכה להיות קו אמצע ו -0.5 מ"מ זמני אל ראש עצב הראייה. חזור לפי הצורך אם ההתנתקות היא מחוץ למסגרת או לא מרוכז בצורה אופטימלית.
2. דמיינו היפרדות רשתית לצבוע באזור ההזרקה עם הדמיה הפונדוס en פנים ^7,14.
   הערה: אם מערכת הדמית אוקטובר אינה זמינה, הזרקה של כמות קטנה של והעמסה עם וקטור לאימון תאפשר להדמיה עם כל מצלמת הפונדוס שמבצעת angio והעמיסgraphy באמצעות אותו אורכי גל עירור וחסימת מסננים. באזורי נקודות של קרינת Hyper יוצגו מתחת בכלי הדם ואת כלי הדם יהיו גבולות חדים וברורים ככל ששטחי subretinal הוא ממוקדים בצורה נכונה. הקצה של הבועה מן הזריקה יהיה מוגדר על ידי מעבר פיגמנטציית-יתר פלואורסצנטי הצבועה. מכשירים אחדים לספק יכולת זו העכבר; המכשור משמש כאן מתואר במקומות אחרים ^14.

טיפול 5. לאחר ניתוח

1. החל מעייל עבה של קרם עיניים אנטיביוטי משולש אל פני השטח של הקרנית של העין המוזרקת.
2. מניח עכברים בכלובים בודדים נקיים להתאוששות. אין לשלב עכברים שעברו ניתוח עד שהם החלימו לחלוטין.
3. צג נשימה וטמפרטורה במהלך התאוששות הרדמה. צג חיות עד שהם יכולים לשמור על שכיבה sternal.
4. לבצע ניטור שלאחר הניתוח מתאים נוסףוטיפול, כולל הזרקה תת-עורית של carprofen (5 מ"ג / ק"ג) לניהול כאב לאחר ניתוח.

6. הערכה של תפקוד רשתית ידי Electroretinography (ERG)

1. בצע מראש הזרקת ניתוח ERG ובזמנים המתאימים לאחר ההזרקה לפי הצורך להעריך תפקוד הרשתית. אם נעשתה הזריקה לחלל subretinal, הפרדות הרשתית צריכות לפתור תוך 72 שעות.
   1. השתמש בטכניקות ERG תקן לאבחון תפקוד רשתית לפני ואחרי ההזרקה כפי שתואר לעיל ^14,15.

שחזור 3D 7. וכימות נפח בועה

הערה: Oct סריקות עם ניגודיות גבוהה המקיפה את הניתוק כולו בתוך המסגרת של נוף הם אופטימליות לשימוש. ImageJ / פיג'י ^17,18 ו Imaris שימשו, אך ניתן להשתמש בתוכנה אחרת.

1. לייצא את הסריקה-ב של עניין, לייבא ImageJ / פיג'י היבול (תמונה> Crop) את החלק של SC אוקטוברלהיות המודל באמצעות כלי הבחירה המלבני.
   1. לכוונון ניגודיות (תמונה> התאם> הבהירות / ניגודיות) להתוות שום גבולות חסרים על ידי חיבור שני חלקים עם קו.
   2. לצייר קו ישר עם כלי שורה (המשמרת מחזיקה) החובק את הרשתית לשכבת קולטי האור. מדוד (לנתח> מדוד) אורך הקו כדי להשיג גודל של ניתוק מירבי צעד 7.8.
2. יבוא קצוץ מסגרות תוכנת 3D-השחזור (ראה טבלה של חומרים) באמצעות "RGB לאפור" תוסף ו MATLAB מהדר זמן ריצה.
3. הגדר את גודל voxel (תחת מאפייני תמונה) באמצעות פרמטרים כיול מן הסריקה אוקטובר (x, y, z).
4. הפעל את התוסף "RGB כדי גריי" (תחת מאפייני תמונה), עם שקלול שווה כל ערוץ, כדי ליצור ערוץ רביעי. מחק ערוצים האדום-ירוק-כחול המקורי.
5. הפוך את הערוץ האפור באמצעות שינוי הניגודיות. Image Store.
6. לחץ על "להוסיףEW שטח "כפתור על כרטיסיית 3D-View, ולהתחיל בתהליך צעד 4 מודרך יוצר את פני השטח.
   1. הגדר את הפירוט פני השטח (שלב 1 מתוך 4).
      הערה: מניסיוננו 8.0 כדי 12.0 היה הטווח היעיל ביותר.
   2. הגדר את גודל כדור המרבי (תחת בחירת רקע) כדי מעט פחות מגודל הניתוק המרבי שנמדד 7.1.2. צור את השטח ולבטל היפוך ערוץ אפור (שלב 2 מתוך 4).
   3. הגדר את סף לערך המקסימאלי כך את פני השטח של הרווחים השליליים מחוץ הרשתית ושל היחידה אינו באים במגע (שלב 3 מתוך 4).
   4. הגדרת הסוג מסנן למספר ווקסלים ולבודד את החלל השלילי באתר הניתוק לפי גודל. לסיים את פני השטח (שלב 4 מתוך 4).
      הערה: היקף שטח הניתוק ממוקם מתחת נפח בלשונית הסטטיסטיקה.

Results

אחורי גישת זריקות subretinal transcleral בוצעו ב -31 עיני בריאות מ -16 עכברים פראיים סוג עם זריקות של 0.3 μl (n = 18), 0.5 μl (n = 8) ו 1.0 מיקרוליטר (n = 5) של והעמסת 0.01%. עין אחת לא נכללה הזרקה בשל אטימות קרניות קיימות שמנעו ניתוח מבני ותפקודי. כל עין מוזרקת נכללת בדוח זה. אין היפרדות רשתית לא מכוונת, דקירות של רשתית הנוירו, או דליפה לתוך הזגוגית אותרו ולא הייתה שום ראיה של nicking עדשה, תגובות דלקתיות, אובאיטיס, או לאחר ניתוח זיהומים בכל עיניי...

Discussion

זריקות subretinal הן את שיטת בחירה עבור המשלוח של וקטורים ויראליים גזע טיפול תאים שמקורם מניפולציה קולטני אור ואת הרשתית הוא במחקר בסיסי טיפול מרפאתי. בחולים, זריקות subretinal נעשים בדרך כלל עם sclerotomy הקדמי ליד פלאנה Pars, vitrectomy הליבה האחורי וחדירה של הרשתית על ידי מחט עם להדמיה ישירה. כמו במרבית ההליכים vitrectomy, זה נפוץ היווצרות קטרקט להתרחש בטרם עת, אלא אם העין היא כבר pseudophakic. בעכברים, זריקות subretinal נעשות באופן מסורתי עם קדמי sclerotomy לרשתית, שיטה קשורה ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
המילטון דגם 62 RN SYR	המילטון	87942	מזרק x 1
מחט המילטון 33 גרם, 1.0 אינץ', 20 מעלות, נקודה 3 (304 נירוסטה)	המילטון	7803-05	מחטים x 6
מספריים מעוקלים של Vannas	טד פלה, INC.	1347	5 מ"מ להב
22.5 מעלות סכין מיקרו-כירורגיה	Wilson Ophthalmic Corp.	91204
קטג'קט	Phoenix	NDC 57319-609-02	קטמין
Anased	Lloyd Laboratories	NDC 61311-482-10	קסילזין
פלואורסצאין 10% AK-Fluor	Akorn	NDC 17478-253-10	100 מ"ג/מ"ל
0.9% מי מלח USP	Hospira	NDC 0409-4888-50	0.9% NaCl
משחה אנטיביוטית	Akorn	NDC 17478-235-35
מי עיניים משאבת מחזור	Gaymar	TP-500 T / משאבה	מקט יצרן 07999-000
sd-OCT	Bioptigen	R-Series
מצלמת פונדוס	מסחרית מעבדות מחקר פניקס	MICRON III
פינצטה מסוג 3	טד פלה, INC.	5385-3SU
2.5% פנילפרין	פרגון BioTeck	NDC 42702-102-15
IMARIS8	עיניים Bitplane		גרסה 8.1.2
ImageJ	NIH		V1.8.0_77
Hypromellose  2.5%	Goniovisc	AX0401	מתיל צלולוז
(שטיפה)	Bausch & תמיסת מלח Lomb
מיקרוסקופ	Zeiss	Stemi 2000	מיקרוסקופ
מקור אור	Fostec	P/N 20520	מקור אור