מאמר שיטה

Optogenetic mutagenesis אקראי באמצעות היסטון-miniSOG ב C. elegans

DOI:

10.3791/54810

⸱

14 בנובמבר 2016

 , 
1Division of Biological Sciences, Section of Neurobiology, University of California in San Diego and Howard Hughes Medical Institute, 2Department of Cellular and Molecular Medicine, University of California in San Diego School of Medicine and Howard Hughes Medical Institute

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גנטי בקידוד היסטון-miniSOG גורם מוטציות תורשתי הגנום כולו באופן אור תלוי כחול. שיטת mutagenesis זה היא פשוטה, מהירה, ללא כימיקלים רעילים, מתאים היטב סריקה גנטית קדימה ואינטגרציה transgene.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סריקה גנטית קדימה באורגניזמים מודלים היא סוס העבודה לגילוי גנים ומסלולים חשובים מבחינה תפקודית בתהליכים ביולוגיים רבים. ברוב המסכים המבוססים על מוטגנזה, החוקרים הסתמכו על שימוש בכימיקלים רעילים, חומרים מסרטנים או הקרנה, הדורש ציוד ייעודי, הגדרת בטיחות ו/או סילוק חומרים מסוכנים. פיתחנו גישה פשוטה לגרימת מוטציות תורשתיות ב-C. elegans באמצעות היסטון-miniSOG המתבטא בקו הנבט, מחולל חזק הניתן להשראת אור של מיני חמצן תגובתיים. שיטת מוטגנזה זו נקייה מכימיקלים רעילים ודורשת בטיחות מעבדה מינימלית וניהול פסולת. שינויי ה-DNA המושרים כוללים שינויים חד-נוקלאוטידים ומחיקות קטנות, ומשלימים את אלה הנגרמים על ידי מוטגנזה כימית קלאסית. ניתן להשתמש במתודולוגיה זו גם כדי לגרום לאינטגרציה של טרנסגנים חוץ-כרומוזומליים. כאן, אנו מספקים את הפרטים של הגדרת ה-LED והפרוטוקולים למוטגנזה סטנדרטית ואינטגרציה טרנסגנית.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מסך גנטי קדימה כבר בשימוש נרחב כדי ליצור מוטציות גנטיות לשבש תהליכים ביולוגיים שונים באורגניזמים מודל כגון elegans Caenorhabditis (ג elegans) 1. ניתוח של מוטציות כאלה להוביל לגילוי של גנים חשובים מבחינה תפקודית והאיתות שלהם מסלולי 1,2. באופן מסורתי, mutagenesis ב C. elegans מושגת באמצעות כימיקלים מוטגנים, קרינה, או transposons 2. כימיקלים כגון methanesulfonate אתיל (EMS) ו- N -ethyl- -nitrosourea N (ENU) הם רעילים לבני אדם; קרני גאמא או אולטרה סגול (UV) mutagenesis קרינה דורש ציוד מיוחד; זני transposon-פעיל, כגון זנים המוטטורי 3, יכולים לגרום מוטציות מיותרות במהלך תחזוקה. פיתחנו גישה פשוטה לגרום מוטציות תורשתיות באמצעות פוטוסנסיטייזר גנטית בקידוד 4.

(Reactive oxygen species ROS) יכול לגרום נזק לדנ"א 5.מחולל חמצן גופיה מיני (miniSOG) הוא חלבון פלואורסצנטי ירוק של 106 חומצות אמינו כי תוכננה מן LOV (אור, חמצן, ואת מתח) תחום של ארבידופסיס phototropin 2 6. בחשיפה לאור כחול (~ 450 ננומטר), miniSOG מייצר חמצן גופיית ROS כולל עם fl יבין mononucleotide בתור פקטור 6-8, אשר שוהה בכל התאים. בנינו חלבון היתוך-mSOG שלו על ידי תיוג miniSOG אל C- הסופי של היסטון-72, ג elegans וריאנט של היסטון 3. אנחנו שנוצר transgene חד עותק 9 להביע-mSOG שלו ב germline של ג elegans. בתנאי תרבות נורמלים בחושך, התולעים המהונדסים-mSOG שלו יש גודל גוזלים נורמלי תוחלת חי 4. בחשיפה לאור LED כחול, התולעים שלו-mSOG לייצר מוטציות תורשתיות בקרב הצאצאים שלהם 4. הספקטרום של מוטציות מושרות כולל שינויי נוקלאוטיד, כגון G: C ל- T: A ו- G: C ל- C: G ו- chromoso הקטןלי מחיקות 4. הליך mutagenesis זה הוא פשוט לביצוע, ודורש התקנת בטיחות במעבדה מינימאלית. כאן, אנו מתארים את התקנת תאורת LED ונהלי mutagenesis optogenetic.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. בנייה של ה- LED הפנס

הערה: ציוד LED הנדרש מסוכם הרשימה של חומרים. ההתקנה LED כולו הוא קטן והוא יכול להיות ממוקם בכל מקום במעבדה, אם כי מומלץ להשתמש בו יוצב בחדר חשוך לשלוט חשיפה לאור של תולעים 4.

  1. חבר את LED לבקר עם כבלים (איור 1 א, ד).
  2. חבר את בקר מגבר גנרטור / פונקציה דיגיטלי באמצעות כבל BNC (איור 1 א ', ג', ד).
  3. תקן 10 ס"מ הנורית מעל לבמה בעזרת בעל מותאם אישית (איור 1 א).
    הערה: עשינו בעל עם חלקי מתכת.
  4. מכסה את התקנת תאורת LED חלקית, אבל למנוע הצטברות חומה (איור 1 ב '), מה שהופך תולעים חולים.
    הערה: אנו משתמשים כיסוי פלסטיק קשיח מחוייט עם העליון פתוח והתחתון (איור 1 א). הכיסוי אינו נדרש עבור mutagenesis עצמו, אך משמש to להגביל את החשיפה המיותרת של האור הכחול אל הסביבה. אנו ממליצים לא לכסות את התקנת LED לחלוטין (איור 1B) כדי למנוע התחממות יתר של התולעים.
  5. יש להרכיב משקפיים בלייזר-מגן.
    הערה: אנו להרכיב משקפיים בלייזר-מגן מפני שהאור הוא בהיר מאוד. משקפי שמש יפעלו גם כן.
  6. החלף את הידית של הבקר LED ל 'Int.' עבור תאורה רציפה (1D איור) ולהגדיר אותו ב 65% של הכוח המרבי (תרשים 1C).
  7. השתמש פוטומטר כדי למדוד את עוצמת האור הכחולה על הבמה שבו התולעים ממוקמים באמצעות הפרוטוקול של היצרן. ההתקנה נותנת 2.0 mW / 2 מ"מ תחת תאורה רציפה.

2. טיפול תכלת

הערה: השתמש זן CZ20310 juSi164 [Pmex-5-HIS-72 :: miniSOG-3'UTR (TBB-2) + CB-UNC-119 (+)] UNC-119 (ed3) III 4 זן זמין. במרכז גנטיקה Caenorhabditis (CGC, http: //www.cgc.cbs.umn.edu/).

  1. שמירה על זן-mSOG שלו בחושך על מדיום הגידול נמטודות סטנדרטי (NGM) צלחות עם E. coli OP50 בא פרוטוקול סטנדרטי 10,11.
    הערה: תחת אור הסביבה, זנים המכילים juSi164 אינם מציגים שיעור מוטציות מעל שיעור ספונטני 4. מעבר למתח שיגרתי באמצעות היקף ניתוחים עם מנורת הלוגן בדרך כלל אינו גורם מוטציות גם כן. עם זאת, יש להיזהר כדי למנוע חשיפה מיותרת לאור, למשל, שמירה על זני חממה כהה בתוך סטנדרטית, או כיסוי הזנים עם רדיד. מומלץ להקפיא aliquots של המתח לאחר שקיבל אותה במקרה מיותר מוטציות לצבור לאורך זמן.
  2. פיק הרה להולדת מבוגרים צעירים (כ 12 שעות לאחר-L4) חיות עם תולעת לאסוף 11.
    הערה: בעלי חיים צעירים להראות פחות מוטגנים אפקט 4, בעוד בעלי חיים מבוגרים יכולים להיות גודל גוזלים נמוך.
  3. חותכים p מסנןaper כדי להתאים צלחת 60 מ"מ עם 25 מ"מ x 25 מ"מ חור מרובע ומניחים על צלחת unseeded (איור 1E).
    הערה: אגרוף מרובע ניתן להשתמש אך בגודל של אגרוף לא חייב להיות מדויק.
  4. זרוק 100 μL של 100 מ"מ CuCl 2 על נייר הסינון שווה להגביל תולעים בתוך החור המרובע על הצלחת.
  5. פיק מספר רצוי של הרמפרודיטים מבוגרים צעירים הרה להולדת (ראה שלב 3 עבור דוגמא) ולהעביר למרכז הצלחת 2 CuCl.
  6. יש להרכיב משקפיים בלייזר מגן.
  7. להדליק את הנורית ואת מחולל פונקציה.
  8. החלף את הידית של בקר LED ל 'שלוחה.' כדי לשלוט בו על ידי מחולל אותות (1D איור).
  9. הגדר את בקר ב 65% של הכוח המרבי ואת מחולל פונקציה כמו גל סינוס, 4 הרץ (תרשים 1C).
  10. מניחים את הצלחת 2 CuCl משלב 2.5 ללא מכסה על הבמה תחת LED (איור 1 א </ Strong>).
  11. להאיר את החיות עם אור כחול עבור 30 דקות.
  12. העבר מחפשים תולעים בריאים לצלחת זורעי ע 0.
    הערה: המספר הרצוי של P 0 תלוי בסוג של המסך. ראה שלב 3 עבור דוגמה. תולעי P 0 עשויים להיראות חסר קואורדינציה מייד לאחר טיפול אור יתאוששו לאורך זמן.
  13. שמור תולעים המכוסים באמצעות רדיד באינקובטור או בחושך; ופעל לפי הנוהל המקובל להתחיל הקרנה פנוטיפים רצוי בקרב הצאצאים שלהם 2,10.

דוגמא 3. של מסך גנטי קדימה

הערה:. זוהי דוגמא של המסך המשובט עם 120 גנומים הפלואידים לבדוק אם LED והמתח עובדים איור 2 מראה סכמטי של ההליך.

  1. [Day1] לאחר טיפול באור כחול, לאסוף חמישה תולעים ובריאים לצלחת NGM עם OP50 כמו P 0, לשמור אותם בתוך חממת 20 ° C, ולתת להם להטיל ביצים עבור 1ד (צלחת 'Day1').
  2. [יום 2] העברת P 0 לצלחת חדשה זורעת (הצלחת 'יום 2').
  3. [Day3] פיק ולהרוג P 0 על הצלחת 'יום 2' על ידי שריפת אותם.
  4. [Day4] פיק 30 בוגרים צעירים הרה להולדת F 1 מהצלחת 'Day1' ולהעבירם לצלחות בודדים (30 צלחות F 1 עבור 'Day1').
  5. [Day5] חזור על שלב 3.4 עבור הצלחת 'יום 2' (30 F 1 צלחות עבור 'יום 2').
  6. [Day7-9] בדוק את מורפולוגיות ו / או התנהגות חריגה של F 2 תולעים בהשוואה לזן WT (איור 3 א) תחת סטראו רגיל כאשר הם הופכים למבוגרים.
    הערה: מציג מוטציה תורשתית כרבע תולעים עם אותו הפנוטיפ בין F 2 כאשר הוא רצסיבי עם חדירות גבוהות. עם זאת, כמה מוטציות עשויות לגדול לאט ו / או להציג חדירות חלקיות. לכן, יתכן כי פחות מרבע של מוטציות ניתן למצוא עלצַלַחַת.
  7. פיק תולעים עם פנוטיפים גלויים בנפרד ולבדוק התורשתיות של הפנוטיפ בדור הבא.

דוגמה 4. של אינטגרציה extrachromosomal transgene

  1. להזריק את ה- DNA של עניין לתוך CZ20310 juSi164 [Pmex-5-HIS-72 :: miniSOG-3'UTR (TBB-2) + CB-UNC-119 (+)] UNC-119 (ed3) ולהכין תולעים מהונדס עם שיעור התמסורת נמוך (10-30%) בעקבות 12,13 פרוטוקול זריקה רגילה.
    הערה: לחלופין, מערכי extrachromosomal הוקמו ניתן חצו לתוך זני juSi164. כדי למנוע גנוטיפ עבור juSi164, heterozygotes juSi164 עשוי לשמש P 0 אם כי היעילות להצטמצם. שיטת גנוטיפ עבור juSi164 מתואר בסעיף 5.
  2. [Day1] פנקו ~ 20 חיות טרנסגניות ע 0 עם אור כחול כמתואר שלב 2.
    הערה: תולעי P 0 פרטים נוספים נחוצים תלוי tr שיעור ansmission. Transgenes ניתן לזהות על ידי פנוטיפים או coinjection סמן 12,13.
  3. פיק 10 מחפש P 0 בריא לצלחות פרט, לשמור אותם בתוך חממת C 20 °, ולתת להם להטיל ביצים במשך כמה ימים (P 0 צלחות)
  4. [Day4] יחיד מתוך 20 מהונדס F 1 תולעים מכל צלחת P 0 לצלחות הפרט ולתת להם להטיל ביצים. (20 F 1 x 10 P 0 צלחות = 200 F 1 צלחות בסך הכל.)
  5. [יום 7 ג] מצא F 1 צלחות עם> 75% F 2 transgenes שיש.
  6. פיק חמש חיות טרנסגניות משיעור העברת 75%> F 1 צלחות (F 2 צלחות).
  7. [Day10] שמור F 2 צלחות עם שיעור תמסורת 100% כקווים משולבים פוטנציאליים.
  8. Outcross הקווים פוטנציאל המשולבים באמצעות הליך סטנדרטי 10 לבדוק את פרדת מנדל וכדי להסיר מוטציות רקע פוטנציאליות.
le "> 5. Genotyping

  1. Lyse 20 outcrossed F 2 תולעים חיץ תמוגה באמצעות פרוטוקול סטנדרטי 14.
  2. בצע PCR באמצעות פריימרים עבור MosSCI הכנסת 9, juSi164, (טבלה 1) עם טמפרטורה חישול של C ° 58 בעקבות פרוטוקול סטנדרטי 14.
    הערה: אין צורך גנוטיפ UNC-119 (ed3) כי UNC-119 (ed3) יכולים להיות מזוהים על ידי התנהגות לא מתואמת לאחר הסרת transgene ההצלה (juSi164) בשלבים הבאים 5.4 ו -5.5.
  3. הפעל ג'ל אלקטרופורזה agarose 15 ולבחון את הגדלים הלהקה (טבלה 1) כדי למצוא את WT עבור juSi164.
  4. בדוק אם צאצאי F 2 שתקו תולעים בשל קיומו של UNC-119 (ed3).
  5. אם תולעים מתואמים נמצאים על צעד 5.4, אחת כמה תולעים nonuncoordinated להשיג את כל התולעים nonuncoordinated בדור הבא.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ביצענו מסך גנטי קדימה עם CZ20310 juSi164 UNC-119 (ed3) באמצעות חשיפה לאור 30 דקות בעקבות פרוטוקול סטנדרטי האמור בסעיפים 2 ו -3 בין 60 צלחות F 1 המתאים 120 גנומים הפלואידים mutagenized, מצאנו 8 F 1 צלחות עם F 2 תולעים מוצגות פנוטיפים גלויים כגון פגם לגודל גוף (איור 3 ב), תנועה לא מתואמת (איור 3 ג), ואת הקטלניות מבוגרות (איור 3D). אנחנו לא מבחינים בשום הבדל ב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מתארים הליך מפורט של mutagenesis optogenetic באמצעות שלו-mSOG לידי ביטוי germline ולספק דוגמה של מסך גנטי קדימה בקנה מידה קטן. לעומת mutagenesis כימי סטנדרטי, שיטת mutagenesis optogenetic זה יש מספר יתרונות. ראשית, זה לא רעיל, ובכך שמירה על אנשי המעבדה הרחק מוטאגנים כימיים רעילים כגון EMS, ENU ו trimethylpsoralen עם אור אולטרה סגול (TMP / UV). שנית, הליך ניסיוני של mutagenesis יכול לשמש עבור מספר קטן של בעלי חיים P 0 ויכול להסתיים בתוך שעה אחת. שלישית, mutagenes...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

העבודה נתמכת על ידי HHMI. אנו מודים לחברי המעבדה שלנו על עזרתם בבדיקת הפרוטוקול ובתיקון כתב היד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מקור אור LED בעוצמה גבוהה במיוחדPrizmatixUHP-mic-LED-460460 ± בקר LED 5 ננומטר
PrizmatixUHPLCC-01
מחולל/מגבר פונקציות דיגיטליותPASCOPI-9587CPI-9587C אינו זמין עוד. המחליף הוא PI-8127.
כבל BNC זכר / זכרTHORLABSCA3136
ממשק USB-TTLPrizmatixפוטומטר אופציונלי
THORLABSPM50 ודגם D10MM
נייר סינוןWhatman1001-110
סטריאומיקרוסקופLeicaMZ95
NGM צלחתממיסים 5 גרם NaCl, 2.5 גרם פפטון, 20 גרם אגר, 10 ומיקרו; גרם/מ"ל כולסטרול ב-1 ליטר H2O. לאחר החיטוי, יש להוסיף 1 מ"מ CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mM KH2PO4(pH 6.0). 
תמיסת10 מ"מ טריס (pH 8.8), 50 מ"מ KCl, 0.1% טריטון X-100, 2.5 מ"מ MgCl<תת>2, 100 ומיקרו; גרם/מ"ל פרוטאינאז K
ליזה

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nat Rev Genet. 3 (5), 356-369 (2002).
  2. Kutscher, L. M., Shaham, S. Forward and reverse mutagenesis in C. elegans. WormBook. , 1-26 (2014).
  3. Collins, J., Saari, B., Anderson, P. Activation of a transposable element in the germ line but not the soma of Caenorhabditis elegans. Nature. 328 (6132), 726-728 (1987).
  4. Noma, K., Jin, Y. Optogenetic mutagenesis in Caenorhabditis elegans. Nat Commun. 6, 8868(2015).
  5. Cooke, M. S., Evans, M. D., Dizdaroglu, M., Lunec, J. Oxidative DNA damage: mechanisms, mutation, and disease. FASEB J. 17 (10), 1195-1214 (2003).
  6. Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms. PLoS Biol. 9 (4), 1001041(2011).
  7. Ruiz-Gonzalez, R., et al. Singlet oxygen generation by the genetically encoded tag miniSOG. J Am Chem Soc. 135 (26), 9564-9567 (2013).
  8. Pimenta, F. M., Jensen, R. L., Breitenbach, T., Etzerodt, M., Ogilby, P. R. Oxygen-dependent photochemistry and photophysics of "miniSOG," a protein-encased flavin. Photochem Photobiol. 89 (5), 1116-1126 (2013).
  9. Frokjaer-Jensen, C., et al. Random and targeted transgene insertion in Caenorhabditis elegans using a modified Mos1 transposon. Nat Methods. 11 (5), 529-534 (2014).
  10. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  11. Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. J Vis Exp. (47), (2011).
  12. Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. (18), (2008).
  13. Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).
  14. Fay, D., Bender, A. Genetic mapping and manipulation: chapter 4--SNPs: introduction and two-point mapping. WormBook. , 1-7 (2006).
  15. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
  16. Westberg, M., Holmegaard, L., Pimenta, F. M., Etzerodt, M., Ogilby, P. R. Rational design of an efficient, genetically encodable, protein-encased singlet oxygen photosensitizer. J Am Chem Soc. 137 (4), 1632-1642 (2015).
  17. Xu, S., Chisholm, A. D. Highly efficient optogenetic cell ablation in C. elegans using membrane-targeted miniSOG. Sci Rep. 6, 21271(2016).
  18. Mariol, M. C., Walter, L., Bellemin, S., Gieseler, K. A rapid protocol for integrating extrachromosomal arrays with high transmission rate into the C. elegans genome. J Vis Exp. (82), (2013).
  19. Lin, J. Y., et al. Optogenetic inhibition of synaptic release with chromophore-assisted light inactivation (CALI). Neuron. 79 (2), 241-253 (2013).
  20. Minevich, G., Park, D. S., Blankenberg, D., Poole, R. J., Hobert, O. CloudMap: A Cloud-Based Pipeline for Analysis of Mutant Genome Sequences. Genetics. 192 (>4), 1249-1269 (2012).
  21. Qi, Y., Xu, S. MiniSOG-mediated Photoablation in Caenorhabdtis elegans. Bio-protocol. 3 (1), http://www.bio-protocol.org/e316 316(2013).
  22. Qi, Y. B., Garren, E. J., Shu, X., Tsien, R. Y., Jin, Y. Photo-inducible cell ablation in Caenorhabditis elegans using the genetically encoded singlet oxygen generating protein miniSOG. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (19), 7499-7504 (2012).
  23. Nagel, G., et al. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

LEDROS

מאמרים קשורים