מאמר שיטה

לדמיין את ההשפעות של כיח על פיתוח biofilm באמצעות מודל תאיים coverglass

DOI:

10.3791/54819

⸱

14 בדצמבר 2016

 ,  ,  , 
1Physiology and Experimental Medicine, Hospital for Sick Children, 2Department of Clinical Microbiology, Royal College of Surgeons in Ireland, 3Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto, 4Department of Pediatrics, University of Toronto

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר את ההדמיה של התפתחות הביופילם לאחר חשיפה לגורמי מארח באמצעות מודל תא שקופיות. מודל זה מאפשר הדמיה ישירה של התפתחות ביופילם וכן ניתוח פרמטרים של ביופילם באמצעות תוכנות מחשב.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biofilms מורכב קבוצות של חיידקים עטופים מטריצה-מופרש עצמי. הם משחקים תפקיד חשוב זיהום תעשייתי כמו גם בפיתוח וההתמדה של זיהומים רבים הקשורים לבריאות. אחד biofilms תיאר הכי טוב ולמד מחלות אנושיות מתרחשת דלקת ריאות כרונית של חולי סיסטיק פיברוזיס. כאשר לומדים biofilms בהקשר של המארח, גורמים רבים יכולים להשפיע היווצרות והתפתחות ביופילם. על מנת לזהות כיצד גורמי מארח עשויים להשפיע היווצרות ביופילם ופיתוח, השתמשנו בשיטת coverglass חדרים סטטי לגדול biofilms בנוכחות גורמים נגזרים מארחים בצורת supernatants ליחה. חיידקים הם זורעים לתוך תאי וחשוף filtrates ליחה. בעקבות 48 שעות של צמיחה, biofilms מגואלות ערכת כדאיות ביופילם מסחרית לפני מיקרוסקופיה וניתוח confocal. בעקבות רכישת תמונה, תכונות biofilm ניתן להעריך באמצעות פלטפורמות תוכנה שונות.שיטה זו מאפשרת לנו לדמיין תכונות מפתח של צמיחת biofilm בנוכחות של חומרים שונים כולל אנטיביוטיקה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

biofilms חיידקים הם קבוצות של מיקרואורגניזמים מחוברים זה לזה עטוף מטריצה-מופרש עצמי. 1,2 קלסי, הם מייצגים חיידקים מחוברים פיזי משטח אביוטי או ביוטיים שנוצר בתנאים של זרימה. Biofilms גם הוכח לגדול בתנאים סטטיים (העדר זרימה) ו דיסטלי ממשטחים, כגון בממשק הנוזל אוויר של ברכות תרמיות או pellicles נוצרו במבחנות. biofilms אלה כבר מזמן מוכר בסביבה והם לרעת משמעותיים בתהליכים תעשייתיים, כפי שהם יכולים להיווצר מאגרי מים או בצינורות, וכתוצאה מכך biofouling, קורוזיה חסימות. 3,4

Biofilms הוא גם קריטי גדרות בריאות, כפי שהם הוכחו להיות מעורבי זיהומים הקשורים קטטר, דלקות ריאות בחולי סיסטיק פיברוזיס, כמו גם זיהומים רבים אחרים. 5,6 אחד מסימני ההיכר של זיהומים ביופילם הוא דהמקומט רגישות של חיידקים לאנטיביוטיקה ולקוי אישור על ידי מערכת החיסון המולדת. 7-9 למדו הכי טוב, תרחישים רלוונטיים קליני מעורבי זיהום מבוסס ביופילם מתרחשים בחולים עם סיסטיק פיברוזיס (CF), אשר נגועים באופן כרוני עם Pseudomonas aeruginosa biofilms. פ aeruginosa יכול לעבור מספר שינויים במהלך הקמת זיהום כרוני זה עושה את זה קשה מאוד לטיפול. 10,11 Biofilms יכול להפעיל מולדת חסינה ולנסוע דלקת דיפרנציאלי. 12-14 כמו זיהומים אלו מובילים לתחלואה ולתמותה מוגברות בחולי CF, חשוב להבין גורמים שיכולים להשפיע על התפתחות biofilm בהקשר זה.

מחקר שנערך לאחרונה עולה כי גורמי מארח הם קריטיים ההיווצרות של אגרגטים ביופילם פ aeruginosa. 15 biofilms אלה תורמים רגישים מופחתים אנטיביוטיקה ומנגנוני הגנה מארחת. preseNCE גורמים מארחים נגזר, כגון אלסטט נויטרופילים, כמו גם מוצרים מופרשים מיקרואורגניזמים נוכחות ריאות CF, יש פוטנציאל לווסת היווצרות והתפתחות ביופילם מאוד. 16 בנוסף, biofilms אינטראקציה עם המארח לווסת ביטוי של מסלולים רבים וליזום דלקת. בעוד שיטות תפוקה גבוהה, כגון assay סגול קריסטל רגיל, יכול לספק קצת מידע לגבי תהליך ביופילם, להדמיה של biofilm בתגובה הגורמים הללו לספק יותר מידע מעמיק.

בכתב היד הזה אנו מתארים שיטה לשימוש גורמים מן הליחה של חולי CF כדי ללמוד על ההתפתחות של biofilms במבחנה. שיטה זו מאפשרת ויזואליזציה מהירה של biofilms חשופה לגורמי מארח המכיל כיח באמצעות ערכת כדאיות ביופילם מסחרית. טכניקה זו יכולה לשמש כדי לזהות ויזואלית שינויים המתרחשים במהלך צמיחת biofilm בנוכחות exogenoלנו מוצרים, ומייצג שיטה משופרת לנתח את השינויים בפיתוח ביופילם בתנאים שונים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שים לב מועצת האתיקה מחקר (REB) נדרש לאסוף ולאחסן דגימות כיח מ בבני אדם. מחקרים אלה אושרו על ידי בית החולים לילדים REB # 1000019444.

1. הכנת דוגמאות כיח CF

  1. אסוף מדגם ליחה מחול במהלך ביקורים שיגרתי במרפאת סיסטיק פיברוזיס ולשמור על קרח.
  2. הובלת ליחה המדגם על הקרח במהלך השעה הראשונה של האוסף, למעבדת מחקר, לעבור עיבוד.

2. עיבוד כיח

  1. רשום את עוצמת הקול של מדגם הליחה שהושג. להוסיף בופר פוספט (PBS) כדי 2x היקף המדגם (כלומר, 2 חלקים PBS, מדגם חלק 1).
  2. מערבבים את המדגם היטב עם טפטפת ההעברה. וורטקס המדגם על ההגדרה הגבוהה ביותר עבור 1 דקות לערבב לחלוטין.
  3. Aliquot 1 מ"ל של תערובת הנ"ל לתוך הצינורות מספר 1.5 מ"ל microcentrifuge המתאים ומסובב ב 5000 XG עבור20 דקות ב 4 ° C.
  4. בעקבות צנטריפוגה, להסיר את supernatant וזורקים את הכדור.
  5. סנן לעקר את supernatant דרך פילטר 0.22 מיקרומטר ולאסוף בתוך שפופרת microcentrifuge נקי.
    הערה: עקרות של תסנין נבחנות על ידי ציפוי על אגרת LB וכך גם ייחס תקשורת נוזלית.
  6. אחסן supernatant כיח ב -80 ° C לשימוש עתידי.
    הערה: כיח מחולים רבים יכולים גם להיות ונקווה לאחר סינון.
  7. לפני השימוש, לדלל כיח תסנין 1/10 V / V (100 μl של ליחה, 900 μl של תקשורת) בתקשורת רצויה.
    הערה: כאן, lysogeny מרק סטנדרטי (LB) בתקשורת היה בשימוש.

3. תאיים coverglass שיטה ליצירת biofilm

  1. לגדול לבודד בקטריאלי של לילה עניין התקשורת הרצוי על 37 מעלות צלזיוס עם רועד (200 סל"ד).
    הערה: מספר חיידקים שונים שימשו, כולל קליני מבודד Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus,Burkholderia מורכבים cepacia ו Achromobacter xylosoxidans. בחירה של תקשורת תלוי זנים ותנאי ריבית, אולם תקשורת LB יכולה לשמש בניסויים ראשוניים.
  2. מתרבים הלילה, להציב 40 μl של התרבות לתוך 4 מיליליטר של תקשורת הטריה לגדול במשך 3-4 שעות ב 37 ° C עם רועד (200 סל"ד) להשיג תרבות עם צפיפות אופטית ב 600 ננומטר (OD 600) של כ 0.5 -0.6.
  3. לדלל את תרבות משלב 3.2 ל 1/5 במדיה הרצויים עם 10% כיח תסנין או ללא תסנין ליחה (כמו שליטה). ריכוז אחר של תסנין כיח ניתן לבדוק (כלומר, 50% או 100%).
  4. השתמש 200 μl של דילול זרע בארות של תאי שקופיות.
  5. אפשר לחיידקים לצרף במשך 4 שעות ב 37 ° C בלי לרעוד.
  6. לאחר 4 שעות, להסיר את התקשורת לשטוף בעדינות את biofilm עם תקשורת הטריה 1x. חלף עם 200 μl תקשורת טריה.
    הערה: כדי לחקור את ההשפעות של ליחה על ביופילם, את fresh התקשורת צריכה לכלול supernatant ליחה.
  7. אפשר biofilms לגדול במשך פרק הזמן הרצוי על 37 מעלות צלזיוס ללא רעד, החלפת התקשורת בכל 12 שעות, בלי לשטוף עד הפעם עבור במיקרוסקופ.
    הערה: כדי לחקור את ההשפעה של supernatants כיח על רגישות לאנטיביוטיקה ביופילם, אנטיביוטיקה מתווספת המדיה הבאות 24 שעות של צמיחת biofilm ומתוחזקים בתקשורת עד מכתים והדמיה של biofilms.

Biofilms מכתים 4. מיקרוסקופית Confocal

  1. בעקבות זמן צמיחה רצוי (HR 24-48 עובד הכי טוב), להסיר תקשורת מבארת קאמרי לשטוף בעדינות כל תא פעמים עם 300 μl של PBS סטרילית.
  2. הכין תערובת מכתימה עבור ביופילם על ידי ערבוב 1 μl של כל צבע (המסופק בערכה הכדאית) עבור כל מיליליטר של פתרון הנדרש. הפוך צבע בתמיסת מים או תקשורת.
    הערה: מים מומלצים על ידי היצרן.
  3. הוסף 200 μl של תערובת לצבוע היטב כל תאיים coverglass דגירה בטמפרטורת החדר, בחושך במשך 45 דקות.
  4. סור תערובת מכתימה מהלשכה ולשטוף היטב עם כל 300 μl של PBS סטרילית. הסר PBS ולהחליף עם מים או תקשורת טריים.
  5. המשך עם ויזואליזציה של biofilms באמצעות מיקרוסקופיה confocal.

5. חזותי Biofilms עם מיקרוסקופית Confocal

  1. קרא biofilms מוכתם בתאי מיד לאחר מכתים (בתוך שעה 1). מזער את העיכוב להדמיה של השקופיות על ידי צביעת 1 עד 2 תאים 8-גם בכל פעם.
  2. בצע הדמיה באמצעות מיקרוסקופ confocal עם לייזרים לערכות עירור מסנן עבור הרכישה.
    הערה: כאן, confocal הדיסק מסתובב המערכת עם לייזרים זוהרים ספקטרלי (גרין: 491nm, אדום: 561 ננומטר) שמשה עירור. סינוני פליטת 515/40 ו 624/40 שמשו כדי להמחיש את הכתמים מתוך ההערכה הכדאית ביופילם.
  3. צלם תמונות באמצעות מטרת מי 25x על מיקרוסקופ confocal עם מצלמה.
  4. השתמש Z- ערימות מנת ליצור מודל של ביופילם. צלמו תמונות בכל 0.5-1 מיקרומטר החל מהמטוס ב-המוקד הראשון למסגרת פוקוס האחרון של ביופילם (בדרך כלל פורש 30-80 מיקרומטר עבור 48 biofilms hr)
  5. קח 3-5 תמונות מכל טוב.
    הערה: כך עבור 8 גם מחולק לתאי coverglass, 24-40 תמונות תופקנה.
  6. שמור תמונות לניתוח.
    הערה: התמונה צריכה להיות נשמר כמו שת-TIFF קבצים לנתח באמצעות לסטטמ"מ 18,19. הוראות לניתוח תמונה biofilm ניתן למצוא בכתובת http://www.comstat.dk/. ברגע תמונות מיובאות, פרמטרים כגון עובי ממוצע, ביומסה כיסוי שטח לכל ערוץ (אדום וירוק) ניתן לנתח.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

העיצוב הכללי של הניסוי מיוצג באיור 1. השימוש בפרוטוקול זה מספק שיטה נוחה כדי להמחיש את השינויים biofilms גדל במשך תקופות זמן שונות (למשל, 24, 48 או 72 שעות). חשוב לציין, אותות אקסוגניים, כגון ליחה filtrates, ניתן להוסיף כדי להמחיש את השינויים בפיתוח ביופילם. כפי שניתן לראות באיור 2, בנוכחות filtrates כיח 10% יכול לשנות את הארכיטקטורה של ביופילם (איור 2A, לוחות נמוך). 16 תמונות א...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השיטות שתוארו במסמך זה לאפשר להדמיה של biofilms החיידקים גדל בנוכחות מוצרים אקסוגניים. באופן לא מפתיע, את הייצור של exoproducts הוא בעל חשיבות בעת שימוש בסוג זה של המערכת. למשל, Dithiothreitol (DTT), משמש לעתים קרובות על דגימות כיח אדם לעזור למוסס את הדגימות. עם זאת, ההשפעה של DTT לבדו יכול להקטין פיתוח biofilm ואת הכדאיות (מידע לא מוצג). לפיכך, בקרות נאותות עבור כל התנאים הדרושים. יתר על כן, התוספת של מוצרי ליחה אנושיים יוצרת את שוני פנימי על הניסוי בשל העובדה כי הליחה של כל מטופ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אף לא אחד.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TB מודה מלגת מחקר מקנדה סיסטיק פיברוזיס.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Lab-Tek II Chambered Coverglass, #1.5 בורוסיליקט, 8 בארותThermo Sicher Scientific155409
Filmtracer ערכת Viabilty ביופילם חי/מת ThermoFisher ScientificL10316
צלחות אגר דםThermo Fisher ScientificR10215אישור כדאיות באמצעות ספירת CFU או בחירת מושבות לחיסון
COMSTATזמינה באינטרנטCOMSTAT היא תוכנה לניתוח תמונות ביופילם. זמין www.comstat.dk 
Millers LB BrothThermo Fisher Scientific12780-052מדיה סטנדרטית לגידול לילה / ביופילם
מסנני מזרק Millex-GV MilliporeSLGV013SLסינון של סופרננטים של
ליחה פוספט חוצץ מלח (Dulbecco A)BR0014G אוקסואידשטיפת תאי ביופילם לאחר הסרת מדיה
Zeiss AxioVert 200MCarl Zeiss
Hamamatsu C9100-13 EM-CCDQS Technologies Inc.
ספקטרל בוראליסQs טכנולוגיות בע"מ
פרקין אלמר VolocityQS טכנולוגיות בע"מהוראות לתוכנה זו ניתן למצוא בכתובת: http://cellularimaging.perkinelmer.com/pdfs/manuals/VolocityuserGuide.pdf
תוכנת

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Beaudoin, T., Waters, V. Infections with biofilm formation: selection of antimicrobials and role of prolonged antibiotic therapy. Pediatr.Infect.Dis.J. , (2016).
  2. Donlan, R. M. Biofilms: microbial life on surfaces. Emerg.Infect.Dis. 8 (9), 881-890 (2002).
  3. Hobley, L., Harkins, C., MacPhee, C. E., Stanley-Wall, N. R. Giving structure to the biofilm matrix: an overview of individual strategies and emerging common themes. FEMS Microbiol.Rev. 39 (5), 649-669 (2015).
  4. Katharios-Lanwermeyer, S., Xi, C., Jakubovics, N. S., Rickard, A. H. Mini-review: Microbial coaggregation: ubiquity and implications for biofilm development. Biofouling. 30 (10), 1235-1251 (2014).
  5. Donlan, R. M. Biofilm formation: a clinically relevant microbiological process. Clin.Infect.Dis. 33 (8), 1387-1392 (2001).
  6. Bjarnsholt, T., et al. The in vivo biofilm. Trends Microbiol. 21 (9), 466-474 (2013).
  7. Mah, T. F., Pitts, B., Pellock, B., Walker, G. C., Stewart, P. S., O'Toole, G. A. A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance. Nature. 426 (6964), 306-310 (2003).
  8. Mah, T. F. Biofilm-specific antibiotic resistance. Future Microbiol. 7 (9), 1061-1072 (2012).
  9. Beaudoin, T., Zhang, L., Hinz, A. J., Parr, C. J., Mah, T. F. The biofilm-specific antibiotic resistance gene ndvB is important for expression of ethanol oxidation genes in Pseudomonas aeruginosa biofilms. J. Bacteriol. 194 (12), 3128-3136 (2012).
  10. Beaudoin, T., Aaron, S. D., Giesbrecht-Lewis, T., Vandemheen, K., Mah, T. F. Characterization of clonal strains of Pseudomonas aeruginosa isolated from cystic fibrosis patients in Ontario, Canada. Can. J. Microbiol. 56 (7), 548-557 (2010).
  11. Vidya, P., et al. Chronic infection phenotypes of Pseudomonas aeruginosa are associated with failure of eradication in children with cystic fibrosis. Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis. , (2015).
  12. Beaudoin, T., Lafayette, S., Nguyen, D., Rousseau, S. Mucoid Pseudomonas aeruginosa caused by mucA mutations result in activation of TLR2 in addition to TLR5 in airway epithelial cells. Biochem.Biophys.Res.Commun. 428 (1), 150-154 (2012).
  13. Beaudoin, T., et al. The level of p38alpha mitogen-activated protein kinase activation in airway epithelial cells determines the onset of innate immune responses to planktonic and biofilm Pseudomonas aeruginosa. J.Infect.Dis. 207 (10), 1544-1555 (2013).
  14. LaFayette, S. L., et al. Cystic fibrosis-adapted quorum sensing mutants cause hyperinflammatory responses. Sci.Adv. 1 (6), e1500199(2015).
  15. Staudinger, B. J., et al. Conditions associated with the cystic fibrosis defect promote chronic Pseudomonas aeruginosa infection. Am.J.Respir.Crit.Care Med. 189 (7), 812-824 (2014).
  16. Kennedy, S., et al. Activity of Tobramycin against Cystic Fibrosis Isolates of Burkholderia cepacia Complex Grown as Biofilms. Antimicrob.Agents Chemother. 60 (1), 348-355 (2015).
  17. Tom, S. K., Yau, Y. C., Beaudoin, T., LiPuma, J. J., Waters, V. Effect of High-Dose Antimicrobials on Biofilm Growth of Achromobacter Species Isolated from Cystic Fibrosis Patients. Antimicrob.Agents Chemother. 60 (1), 650-652 (2015).
  18. Heydorn, A., et al. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146 (Pt 10), 2395-2407 (2000).
  19. Vorregaard, M. Comstat2 - a modern 3D image analysis environment for biofilms . Informatics and Mathematical Modelling. , Technical University of Denmark. Kongens Lyngby, Denmark. (2008).
  20. Jurcisek, J. A., Dickson, A. C., Bruggeman, M. E., Bakaletz, L. O. In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide. J. Vis. Exp. (47), e2481(2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Chambered Coverglass ModelBiofilm DevelopmentSputum EffectsConfocal MicroscopyBiofilm Viability KitAntibiotic EfficacyBacterial SeedingPBS WashingComstat AnalysisBurkholderia Cepacia

מאמרים קשורים