הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

פלטפורמה של מבחנים אנטי biofilm המתאים לחקירת ספריות תרכובת טבעיות

17.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54829

⸱

27 בדצמבר 2016

 ,  , 
1Pharmaceutical Design and Discovery (PharmDD), Faculty of Pharmacy, University of Helsinki

במאמר זה

סיכום

זיהומי ביופילם מראים סבילות גבוהה לכימותרפיה. אין בדיקה אחת שתופסת את המורכבות של ביופילמים. במקום זאת, יש צורך בבדיקות משלימות. אנו מציגים פלטפורמת סינון (שפותחה עבור S. aureus) המשלבת מבחני כדאיות, ביומסה ומטריצת ביופילם. זה מאפשר גילוי תרופות אנטי-ביופילם, כולל הערכה של השפעות כימותרפיות ארוכות טווח.

תקציר

Biofilms נחשב אחד הנושאים המאתגרים ביותר של רפואה המודרנית, והם בעלי פוטנציאל אחראים על 80% של זיהומים אנטיביוטיים סובלנית. Biofilms הפגין סובלנות גבוהה במיוחד עבור כימותרפיה, אשר נחשבה מולטיפקטוריאלית. למשל, המטריצה ​​מספקת מכשול פיזי מקטין את חדירת אנטיביוטיקה לתוך ביופילם. כמו כן, תאים בתוך biofilms הם phenotypically מגוונים. סביר, החוסן ביופילם נובע משילוב של אלה ואחרים, עדיין לא ידועים, מנגנונים. כל האנטיביוטיקה הקיימים כיום פותחו נגד חיידקים חד תאיים (planktonic). לכן, עד כה, רפרטואר מצומצם מאוד של מולקולות קיים שיכול לפעול באופן סלקטיבי על biofilms הבוגרת. מצב זה מונע שינוי פרדיגמה מתקדם לגילוי תרופות, שבה מחפש-biofilms אנטי כבר דחק לתפוס מקום בולט יותר. אתגר נוסף הוא כי ישמאוד מוגבל במספר השיטות הסטנדרטיות למחקר ביופילם, במיוחד אלה שיכולים לשמש הקרנה גדולה תפוקה של ספריות כימיות. הנה, פלטפורמה אנטי biofilm ניסיון להקרנה כימית מוצגת. היא משתמשת שלושה מבחנים למדוד כדאיות ביופילם (עם מכתים resazurin), ביומסה הכולל (עם מכתים סגול קריסטל), מטריצת ביופילם (באמצעות agglutinin ניבט חיטה, מכתים WGA-קרינה מבוססת של N -acetyl-גלוקוזאמין פולי, PNAG , שבריר). כל המבחנים פותחו באמצעות Staphylococcus aureus כמו חיידקי המודל. דוגמאות לאופן שבו הפלטפורמה יכולה לשמש לסינון ראשוני וכן אפיון פונקציונלי של להיטים אנטי biofilm המזוהים מוצגות. רצף ניסיוני זה מאפשר נוסף לסיווג הלהיטים המבוססים על נקודות קצה הנמדדות. הוא גם מספק מידע על אופן הפעולה שלהם, במיוחד על לטווח ארוך בניגוד לתופעות כימותרפיות לטווח קצר. לכן, זה מאוד אדוהntageous לזיהוי המהיר של תרכובות להיט באיכות גבוהה שיכול לשמש נקודות התחלה עבור יישומים ביו שונים.

מבוא

חיידקים יכולים לעבור בין שני סגנונות חיים שונים מאוד, planktonic ו נייחים, מתוכם ביופילם היא הדוגמה הנפוצה ביותר. ב biofilms, חיידקים ליצור קהילות מובנהיות משוקעות בתוך הגוש בהפקה עצמית 1. מטריקס בהפקה עצמית זו הוא חסם בין חיידקי הסביבה החיצונית שלהם, והוא מגן על תאי חיידקים, שמירה על אותם בקרבת המקום. הרכב של מטריקס ביופילם משתנה בין ואף בתוך מינים, אבל זה מורכב בעיקר רשת הדוקה של lipopolysaccharides, DNA התאי, וחלבונים. המטריצה משמשת כמחסום פיזי עיכוב הכניסה של סוכנים מזיקים, אבל זה גם מגן על ביופילם מהתייבשות ומונע הזנה לברוח התא 2.

Biofilms נחשב אחד הנושאים המאתגרים ביותר של רפואה המודרנית, והם כביכול אחראים על 80% של זיהומים אנטיביוטיים סובלני 3. הם חד פעמייםשכב סובלנות גבוהה מטבעם מפני איומים חיצוניים: לחות, לחץ האוסמוטי, לחץ מכאני 4, חום, קרינת UV 5, חומרי חיטוי, סוכני מיקרוביאלית, ומערכת החיסון של פונדקאי 1. לדוגמה, ריכוז סוכן מיקרוביאלית נדרש נדרש להרוג biofilm הוכח להיות עד 1,000 פעמים גבוה בהשוואה לזה הנדרש כדי להרוג חיידקים planktonic. הסבר סובלנות גבוהה יותר זה נראה מולטיפקטוריאלית. המטריצה ​​מספקת מכשול פיזי מקטין את חדירת אנטיביוטיקה לתוך ביופילם. כמו כן, תאים בתוך biofilms הם phenotypically מגוונים; שהם מעבר בין מדינות שונות מטבולית בשל שיפוע הקיים של חמצן, חומרי הזנה, מטבוליטים בין החלקים הפנימיים והחיצוניים של ביופילם 6. לפיכך, באזורים מסוימים ביופילם, כגון הליבה, חיידקים ללא חמצן וחומרים מזינים חיים פעילים מבחינה מטבולית פחות או במצב רדום לחלוטין 7. התאים הרדומים לחלוטין מכונים תאי persister כמו, והם אינם רגישים 8 טיפולים קונבנציונליים מיקרוביאלית. לפיכך, סביר להניח כי החוסן ביופילם נובע משילוב של הציעו כיום ואחרים, עדיין לא ידוע, מנגנונים. Spp Staphylococcus. הם עדיין בין חיידקים גראם-חיוביים הבעייתי ביותר, גרימת 4 חמורים, לעיתים קרובות הקשורים biofilm, זיהומים. הוא הציע כי עד 99% מכלל החיידקים קשורים בתוך biofilms, מה שהופך אותו אורח חי חיידקי שולט 3. עם זאת, כל האנטיביוטיקה הקיימים כיום פותחו נגד חיידקים חד תאיים (planktonic). עד כה, רפרטואר מצומצם מאוד של מולקולות קיים שיכול לפעול באופן סלקטיבי על biofilms הבוגרת. מצב זה מונע שינוי פרדיגמה מתקדם לגילוי תרופות, שבה מחפש-biofilms אנטי כבר דחק לתפוס מקום בולט יותר.

מנקודת methodologפרספקטיבת iCal, אתגרים נוספים קיימות, כמו שרק מספר מצומצם של שיטות ביופילם פותח על ידי ארגונים תקינים, במיוחד לאלו החלימו על הקרנת התפוקה הגבוהה של ספריות כימיות. כל המבחנים הסטנדרטיים (עם רק חריג אחד) מבוססים על כורי biofilm, ושיטות אלה דורשים כמויות עבודה גדולות וכמויות גדולות של תרכובות להיבדק, אשר בדרך כלל אינן זמינים בשלב המחקר מוקדם 9-12. ההקרנה ניתן ליישמן הסטנדרטי הקיימים רק assay הוא ההתקן שנקרא קלגרי Biofilm, שממנו ריכוז ביטול biofilm מינימום הזמין המסחרי (MBEC) המערכת פותחה 13-15. עם זאת, המגבלה של assay זה היא כי biofilms גדל על יתדות, ולא כל מיני החיידקים או אפילו זנים בתוך אותו המין מסוגלים ליצור biofilms במכשיר זה. יתר על כן, שיטות שניתן ליישם במיוחד למשימות של תרכובות טבעיות הןנָחוּץ. מוצרים טבעיים היו המקור העיקרי בזכות חדשנותה בתחום גילוי תרופות מיקרוביאלית במאה השנים האחרונות 16. הם יכולים לספק תרכובות אנטי biofilm רומן עם מנגנוני פעולה ייחודיים כי גם יכול להיות יעיל נגד תאי persister. לפיכך, החקר של ספריות טבעיות ובאופן טבעי השראה שקיים הסתברות גבוהה של ייצור ידיעה אנטי biofilm מבטיחה וייחודית.

כאן, אנו מציגים את הפרטים הניסיונות של פלטפורמה של מבחנים אשר פותחה עבור ההקרנה הכימית של תרכובות אנטי biofilm באמצעות שלושה מבחנים למדוד את ההשפעות על הכדאיות, ביומסה מוחלטת, מטריצה של biofilms Staphylococcus aureus. את assay הראשון מודד כדאיות ביופילם, והיא מבוססת על מכתים resazurin. Resazurin היא כתם חיזור כי הוא כחול ללא ניאון במצב מחומצן שלה והופך ורוד, resorufin פלורסנט מאוד כאשר מופחת על ידי פעילות מטבולית של חיידקים. זהו מ 'מאוד פשוטים ומהיריםethod המתאים וניפוי ראשוני 17-20. את assay השני, המבוסס על מכתים סגול קריסטל, מודד את המסה ביופילם הכולל. סגול קריסטל הוא כתם בשימוש נרחב ללימוד חיידקים וחיידקים biofilms 19,21-23. Assay הוא מבוסס על חומרים כימיים זולים ויש לו קריאת סיום הספיג פשוטה. לבסוף, assay השלישי מתמקד חומר פולימרי תאיים (EPS) -matrix של ביופילם באמצעות נבט חיטה agglutinin (WGA), הנקשר באופן פולי N שאריות -acetyl-גלוקוזאמין (PNAG) הנוכחי במטריצה של biofilms staphylococcal 24. של WGA היא מצומדת עם fluorophore כי ניתן לאתר באמצעות קוראי עוצמת הקרינה 25. אנו מציגים כאן את הרציונל ופרטים של הפלטפורמה שפתחנו, כולל דוגמאות של יישומים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. גידול החיידקים

  1. טרום התרבות חיידקים לילה במרק סויה tryptic (TSB) על 37 מעלות צלזיוס עם 220 סל"ד רועד (16-18 שעות).
  2. לדלל את התרבות מראש 100-1,000 פעמים (תלוי בקצב הצמיחה של החיידקים; כאן, 1,000 פעמים משמשות aureus S.) ב TSB הטרי ולתת לו לגדול ב 37 מעלות צלזיוס, 200 סל"ד להגיע גידול מעריכי (אופטי צפיפות בבית 595 ננומטר (OD 595) בין 0.2 ו -0.6).
    הערה: שלב זה דורש אופטימיזציה ספציפית-זן.

2. כינונה Biofilm: לפני ואחרי חשיפה

  1. לדלל את פעמי תרבות 100 גדלו באופן מעריכי (זה שווה כ 10 6 יחידות מושבת יוצרים למיליליטר (CFU / ml)).
  2. פרוטוקול טרום חשיפה
    1. לקבלת דוגמיות קבוצת ביקורת, להוסיף 200 μl של תרבות חיידקים המדולל גם צלחת 96-microwell סטרילי.
    2. הוסף 4 μl של תרכובת בדיקה או פקד(פתרון 50x מלאה) אנטיביוטי ו -196 μl של תרבות חיידקים המדוללת היטב.
    3. דגירה זה ב 37 ° C על שייקר צלחת ב 200 סל"ד במשך 18 שעות.
      הערה: כאן אנו משתמשים שייקר עם מסלול 2 מ"מ.
  3. פרוטוקול לאחר חשיפה
    1. עבור כל הדגימות, להוסיף 200 μl של תרבות חיידקים המדולל גם צלחת 96-microwell סטרילי.
    2. דגירה זה ב 37 ° C על שייקר צלחת ב 200 סל"ד במשך 18 שעות.
      הערה: כאן אנו משתמשים שייקר עם מסלול 2 מ"מ.
    3. הסר את פתרון planktonic כולו בזהירות, בלי לגעת biofilm, בעזרת פיפטה רבה ערוצים.
    4. הוסף 4 μl של תרכובת בדיקה או אנטיביוטיקה מלאה (פתרון מניות 50x) ו -196 μl של TSB לכל טוב.
    5. דגירה זה ב 37 ° C על שייקר צלחת ב 200 סל"ד במשך שעות 24 נוספים.
      הערה: כאן אנו משתמשים שייקר עם מסלול 2 מ"מ.

3. Resazurin מכתים Protocol עבור הערכת הכדאיות של Biofilms

  1. הכן פתרון המניות של 0.1 מ"ג / מ"ל ​​resazurin (0.4 מ"מ) ב- PBS סטרילית. שמור את זה המניה סטרילי, מוגן מפני חשיפה לאור, ו ב 4 מעלות צלזיוס.
  2. לדלל את מניות resazurin 01:50 ב פוספט שנאגר מלוח סטרילית (PBS) כדי להשיג ריכוז סופי של 20 מיקרומטר.
  3. מעבירים את הפתרון planktonic כולו (עזיבת biofilms בבארות) בזהירות, בלי לגעת biofilms או יצירת בועות אוויר, לצלחת נפרדת, נקי 96-היטב בעזרת פיפטה רב ערוצי.
  4. שטוף את biofilms פעם עם PBS סטרילי על ידי הוספת 200 μl לכל היטב, ולהסיר אותו באמצעות פיפטה רבה בזהירות.
  5. הוסף 200 μl של resazurin המדולל היטב של צלחת biofilm בעזרת פיפטה רבה ערוצים.
  6. דגירה זה בחושך, בטמפרטורת החדר (RT), ו -200 סל"ד, רעד במשך כ 20 דקות עד הבקרות ביופילם מטופל ורודים שווה.
  7. מדוד את הקרינהλ EXC = 560 ננומטר λ em = 590 ננומטר עם קורא צלחת (קריאה למעלה).

4. קריסטל ויולט מכתים פרוטוקול כימות ביומסה של Biofilms שימוש פלייט זהה שלב 3

  1. הסר את כתם resazurin בזהירות המבארת בעזרת פיפטה רבה ערוצים.
  2. תקן את biofilms עם 200 μl של מתנול במשך 15 דקות.
  3. תן אוויר יבש הצלחת למשך 10 דקות.
  4. להוסיף 190 μl של 0.02% (כרך / כרך, מדולל deionized מים) פתרון סגול קריסטל, באמצעות פיפטה רבה בזהירות. הימנע ממגע עם הצדדים של בארות עם הכתם בעוד pipetting ולמנוע היווצרות של בועות אוויר על ידי לא לוחץ על פיפטה כדי להשלים איזה פיצוץ.
  5. דגירה זה במשך 5 דקות ב RT.
  6. הסר את הכתם בזהירות, בעזרת פיפטה רבה ערוצים.
  7. לשטוף את זה פעמיים עם מים ללא יונים (200 μl בכל פעם).
  8. תנו בארות להתייבש במשך 5 דקות ב RT ו לפזר את הכתם שנותרב 96% אתנול או 33% חומצה אצטית.
  9. דגירה זה במשך שעה 1 ב RT ולקרוא את הספיגה ב 595 ננומטר.

5. בוחנת את השפעת חיידקים על חיידקים planktonic שימוש פלייט מדגם זהה עבור Biofilms

  1. מדוד את העכירות ב 595 ננומטר של הצלחת עם פתרון planktonic מ -3.3.
  2. כתם חיידקי planktonic עם resazurin על ידי הוספת 10 μl של מניית resazurin לכל טוב. מערבבים היטב על ידי pipetting.
  3. דגירה זה בחושך ב RT במשך כ 5 דקות, עד שולטת מטופל ורודים שווה.
  4. למדוד את הקרינה ב λ EXC = 560 ננומטר λ em = 590 ננומטר.

6. נבט חיטה agglutinin מכתים עבור כימות מטריקס והדמיה מיקרוסקופ פלואורסצנטי של Biofilms

  1. כימות מטריקס
    1. כן פתרון 5 מיקרוגרם / מיליליטר של חללית WGA ב PBS סטרילית.
    2. השתמש PLA מדגם מקבילte מכתים זה. הסר את פתרון planktonic מבאר ולשטוף פעם עם PBS סטרילי (200 μl לכל היטב), באמצעות פיפטה רבה בזהירות בלי לגעת biofilms.
    3. הוסף 200 μl של פתרון WGA לכל טוב להיות מוכתם.
    4. דגירה זה בחושך על 4 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.
    5. הסר את הכתם מאוגד על ידי שטיפת בארות עם 200 μl של שלוש פעמים PBS.
    6. תן יבש הצליח במשך 15 דקות ב RT.
    7. ממיסים את הכתם כבול בחומצה 33% אצטית, באמצעות 200 μl לכל טוב.
    8. חותם את הבארות עם כובעים חשפנות sonicate אותם באמצעות sonicator באמבט מים במשך 30 שניות ב RT ו -40 kHz.
    9. הדגירה הצליחה במשך שעה 1 ב RT.
    10. חזור על שלב sonication. הבארות יכולות להישאר חתום בין צעדי sonication.
    11. למדוד את הקרינה ב לשעבר λ = 495 ננומטר λ em = 520 ננומטר עם קורא צלחת (קריאה למעלה).
  2. לדמיין את המטריצה עםמיקרוסקופ פלואורסצנטי
    1. השתמש באותו פרוטוקול כנ"ל עד שלב 6.1.6.
    2. לאחר שלב הייבוש, לדמיין את הדגימות עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי, באמצעות מסנן FITC (או אחר מסנן עירור ירוק מתאים).

7. מכתים תאים קיימא ואת המלח בתוך Biofilms הדמיה עם הקרינה מיקרוסקופית וכימות של אותות הירוק אל אדום-יחס (G / R)

  1. הדמיה עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי
    1. כן פתרון של כל בדיקה (מכתים אחד תאי קיימא ואת התאים המתים המכתימים אחד האחרים), על פי הנחיות היצרן.
    2. הסר את פתרון planktonic מבאר ולשטוף פעם עם PBS סטרילי (200 μl לכל היטב) באמצעות פיפטה רבה.
    3. הוסף 6 μl של הפתרון מכתים לכל טוב.
    4. דגירת הצלחת בחושך במשך 15 דקות.
    5. לפני מיקרוסקופיה, להסיר את הנוזל העודף מanually באמצעות פיפטה רבה.
    6. ללכוד את התמונות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, באמצעות למשל מסנן FITC (פלואורסצנטי ירוק, תאים קיימא) או מסנן TRITC (אדום פלואורסצנטי, תאים מתים).
  2. כימות האות כיחס ירוק-עד-אדום-קרינה (G / R)
    1. עקוב באותו פרוטוקול בצעדים 7.1.1 ו 7.1.2.
    2. הוסף 200 μl של הפתרון מכתים בכל טוב דגירה אותם במשך 15 דקות בחושך.
    3. למדוד את הקרינה עם קורא צלחת באורכי גל עירור / פליטה 485/535 ננומטר 485/635 עבור פלואורסצנטי ירוק ואדום, בהתאמה (קריאה למעלה).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בשנת הפלטפורמה המוצעת, את ההשפעות על הכדאיות, ביומסה, ומטריקס ביופילם הן לכמת. בסיקוונס העבודה (איור 1), צלחת דגימה אחת מוכתמת resazurin ובהמשך עם סגול קריסטל כדי להעריך את ההשפעות זמנית על הכדאיות biofilm חיידקים על ביומסה biofilm הכולל. מבחני שניהם יכולים להתבצע ברצף באותו צלחת כי זה היה הפגינו מוקדם יותר כי מכתים הראשון עם resazurin לא היתה השפעה משמעותית סטטיסטית על התוצאה מכתים קריסטל סגול (p = 0.4149 להשוואה יחידות ס...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

אין שיטה אחת שניתן למדוד את ההשפעה זמנית של תרכובת על הכדאיות, ביומסה, ומטריקס ביופילם. לכן, יש צורך לשלב מבחנים כדי לזהות השפעה על שלוש נקודות הקצה, רצוי בשלב סינון ראשוני.

Resazurin הוא פרוטוקול מכתים מאוד פשוט המורכבת רק התוספת של חללית החיזור. עם זאת, הקמת זמן הדגירה האופטימלית של biofilms עם resazurin היא קריטית להצלחת assay זה. בחלק זני חיידקים, הפחתה של החללית resazurin אל resorufin ורוד, פלורסנט מתרחשת מה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

תודות

המחברים מודים פרופסור פול קוס ו LMPH, אוניברסיטת אנטוורפן, בלגיה על תמיכתו בתהליך הצילומים במעבדתו. עבודה זו מומנה על ידי האקדמיה פרויקטים פינלנד (פרויקטי 272,266 ו 282,981) ו Svenska Tekniska Vetenskapsakademien אני פינלנד. התרומות הטכניות של MSc יאני Kujala מוכרים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ResazurinSigma AldrichR7017
קריסטל סגולסיגמא אולדריץ'HT90132 
נבט חיטה אגלוטינין, Alexa Fluor 488 מצומדתרמו פישר מדעיW11261
חי/מת BacLight בדיקות מולקולריותL7012SYTO 9 לצביעה של תאים ברי קיימא ירוק ופרופידיום יודיד לצביעה של תאים מתים
אדום פוספט חוצץ
טריפטון אגר סויהמעבדה M, NeogenLAB011
טריפטין מרק סויהמעבדה M, NeogenLAB004
F96 באר צלחת פוליסטירן סטרילי שקוף שטוח תחתוןתרמו פישר מדעי161093
כובעי מותג, רצועות של 8סיגמא אולדריץ'BR781413-300EA
ברנסון CPX סדרת אמבט קוליסיגמא אולדריץ'Z769428-1EA
Multipipetteתרמו פישר מתקן
תרמו פישר סיינטיפיק
ביומק 3000בקמן קולטר
Varioskan פלאש Multiplate קורא ThermoFisher Scientific
Staphylococcus aureusATCC ברקוד 25923
מלח מולטיפה מדעי

מקורות

  1. Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
  2. Dufour, D., Leung, V., Lévesque, C. M. Bacterial biofilm: structure, fuction, and antimicrobial resistance. Endodontic Topics. 22, 2-16 (2012).
  3. Donne, J., Dewilde, S. The Challenging World of Biofilm Physiology. Adv. Microb. Physiol. 67, 235-292 (2015).
  4. Otto, M. Staphylococcal infections: mechanisms of biofilm maturation and detachment as critical determinants of pathogenicity. Annu. Rev. Med. 64, 175-188 (2013).
  5. Cos, P., Tote, K., Horemans, T., Maes, L. Biofilms: an extra hurdle for effective antimicrobial. Curr. Pharm. Des. 16, 2279-2295 (2010).
  6. Bjarnsholt, T., et al. The in vivo biofilm. Trends Microbiol. 21, 466-474 (2013).
  7. Lewis, K. Persister cells. Annu. Rev. Microbiol. 64, 357-372 (2010).
  8. Mulcahy, L. R., Burns, J. L., Lory, S., Lewis, K. Emergence of Pseudomonas aeruginosa strains producing high levels of persister cells in patients with cystic fibrosis. J. Bacteriol. 192, 6191-6199 (2010).
  9. Buckingham-Meyer, K., Goeres, D. M., Hamilton, M. A. Comparative evaluation of biofilm disinfectant efficacy tests. J. Microbiol. Methods. 70, 236-244 (2007).
  10. Goeres, D. M., et al. A method for growing a biofilm under low shear at the air-liquid interface using the drip flow biofilm reactor. Nat. Protoc. 4, 783-788 (2009).
  11. Goeres, D. M., et al. Statistical assessment of a laboratory method for growing biofilms. Microbiology. 151, 757-762 (2005).
  12. Parker, A. E., et al. Ruggedness and reproducibility of the MBEC biofilm disinfectant efficacy test. J. Microbiol. Methods. 102, 55-64 (2014).
  13. Ceri, H., et al. The Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms. J. Clin. Microbiol. 37, 1771-1776 (1999).
  14. Harrison, J. J., et al. Microtiter susceptibility testing of microbes growing on peg lids: a miniaturized biofilm model for high-throughput screening. Nat. Protoc. 5, 1236-1254 (2010).
  15. Konrat, K., et al. The Bead Assay for Biofilms: A Quick, Easy and Robust Method for Testing Disinfectants. PLoS One. 11, e0157663(2016).
  16. Cragg, G. M., Newman, D. J. Natural products: A continuing source of novel drug leads. Biochim Biophys Acta. 1830, 3670-3695 (2013).
  17. Sandberg, M. E., et al. Pros and cons of using resazurin staining for quantification of viable Staphylococcus aureus biofilms in a screening assay. J. Microbiol. Methods. 78, 104-106 (2009).
  18. Mariscal, A., Lopez-Gigosos, R., Carnero-Varo, M., Fernandez-Crehuet, J. Fluorescent assay based on resazurin for detection of activity of disinfectants against bacterial biofilm. Appl. Microbiol. Biotechnol. 82, 773-783 (2009).
  19. Peeters, E., Nelis, H., Coenye, T. Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates. J. Microbiol. Methods. 72, 157-165 (2008).
  20. Pettit, R., Weber, C., Pettit, G. Application of a high throughput Alamar blue biofilm susceptibility assay to Staphylococcus aureus biofilms. Ann. Clin. Microbiol. Antimicrob. 8 (28), (2009).
  21. Stepanovic, S., Vukovic, D., Dakic, I., Savic, B., Svabic-Vlahovic, M. A modified microtiter-plate test for quantification of staphylococcal biofilm formation. J. Microbiol. Methods. 40, 175-179 (2000).
  22. Stiefel, P., et al. Is biofilm removal properly assessed? Comparison of different quantification methods in a 96-well plate system. Appl. Microbiol. Biotechnol. , (2016).
  23. Sandberg, M., Määttänen, A., Peltonen, J., Vuorela, P. M., Fallarero, A. Automating a 96-well microtitre plate model for Staphylococcus aureus biofilms: an approach to screening of natural antimicrobial compounds. Int. J. Antimicrob. Agents. 32, 233-240 (2008).
  24. Thomas, V. L., Sanford, B. A., Moreno, R., Ramsay, M. A. Enzyme-linked lectinsorbent assay measures N-acetyl-D-glucosamine in matrix of biofilm produced by Staphylococcus epidermidis. Curr. Microbiol. 35, 249-254 (1997).
  25. Burton, E., Yakandawala, N., LoVetri, K., Madhyastha, M. A microplate spectrofluorometric assay for bacterial biofilms. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 34, 1-4 (2007).
  26. Skogman, M. E., Vuorela, P. M., Fallarero, A. Combining biofilm matrix measurements with biomass and viability assays in susceptibility assessments of antimicrobials against Staphylococcus aureus biofilms. J. Antibiot. Tokyo. 65, 453-459 (2012).
  27. Skogman, M. E., et al. Evaluation of antibacterial and anti-biofilm activities of cinchona alkaloid derivatives against Staphylococcus aureus). Nat. Prod. Commun. 7, 1173-1176 (2012).
  28. Fallarero, A., et al. (+)- Dehydroabietic Acid, an Abietane-Type Diterpene, Inhibits Staphylococcus aureus Biofilms in Vitro. Int J Mol Sci. 14, 12054-12072 (2013).
  29. Manner, S., et al. New derivatives of dehydroabietic acid target planktonic and biofilm bacteria in Staphylococcusaureus and effectively disrupt bacterial membrane integrity. Eur. J. Med. Chem. 102, 68-79 (2015).
  30. Muller, G., Kramer, A. Biocompatibility index of antiseptic agents by parallel assessment of antimicrobial activity and cellular cytotoxicity. J. Antimicrob. Chemother. 61, 1281-1287 (2008).
  31. Toté, K., et al. Inhibitory efficacy of various antibiotics on matrix and viable mass of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa biofilms. Int. J. Antimicrob. Agents. 33, 525-531 (2009).
  32. Djordjevic, D., Wiedmann, M., McLandsborough, L. A. Microtiter plate assay for assessment of Listeria monocytogenes biofilm formation. Appl. Environ. Microbiol. 68, 2950-2958 (2002).
  33. Li, X., Yan, Z., Xu, J. Quantitative variation of biofilms among strains in natural populations of Candida albicans. Microbiolog. 149, 353-362 (2003).
  34. Barbosa, I., et al. Improved and simple micro assay for sulfated glycosaminoglycans quantification in biological extracts and its use in skin and muscle tissue studies. Glycobiology. 13, 647-653 (2003).
  35. Toté, K., Vanden Berghe, D., Maes, L., Cos, P. A new colorimetric microtitre model for the detection of Staphylococcus aureus biofilms. Lett. Appl. Microbiol. 46, 249-254 (2008).
  36. Arciola, C. R., Campoccia, D., Ravaioli, S., Montanaro, L. Polysaccharide intercellular adhesin in biofilm: structural and regulatory aspects. Front Cell Infect Microbiol. 5 (7), (2015).
  37. Ausbacher, D., et al. Staphylococcus aureus biofilm susceptibility to small and potent beta(2,2)-amino acid derivatives. Biofouling. 30, 81-93 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

חיוניות ביופילםצביעת קריסטל ויולטצביעת רזזוריןפלואורסצנציית WGAStaphylococcus aureusסריקת תרכובות טבעיותניתוח מטריקס של ביופילםסריקת ספריית כימיקליםמיקרוסקופיה פלואורסצנטית
פלטפורמה של מבחנים אנטי biofilm המתאים לחקירת ספריות תרכובת טבעיות
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.