הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מדידת דיפרנציאלי Methylated

5.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54838

⸱

21 בדצמבר 2016

 ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, IU Center for Diabetes and Metabolic Disease, Indiana University School of Medicine, 2Department of Pediartics, Omaha Children's Hospital and Medical Center, University of Nebraska Medical Center, 3Departments of Biochemistry and Molecular Biology, Medicine, and Cellular and Integrative Physiology, IU Center for Diabetes and Metabolic Disease, Indiana University School of Medicine, 4Indiana Biosciences Research Institute

במאמר זה

סיכום

Islet β מוות תאי מקדים התפתחות של סוכרת מסוג 1, וגילוי תהליך זה עשוי לאפשר התערבות טיפולית מוקדמת. כאן, אנו מספקים תיאור מפורט כיצד למדוד מיני DNA INS שעברו מתילציה דיפרנציאלית בסרום אנושי כסמן ביולוגי למוות של תאי β.

תקציר

המוות של תאי β האיים נחשב כבסיס לפתוגנזה של כמעט כל צורות הסוכרת ומקדים את התפתחות היפרגליקמיה גלויה, במיוחד בסוכרת מסוג 1. פיתוח סמנים ביולוגיים רגישים ואמינים של מוות תאי β עשוי לאפשר התערבות טיפולית מוקדמת למניעה או עיכוב של התפתחות סוכרת. לאחרונה, מספר קבוצות, כולל שלנו, דיווחו כי DNA נטול תאים, מתילציה דיפרנציאלית המקודד פרה-פרואינסולין (INS) במחזור הדם נמצא בקורלציה למוות β של תאים בסוכרת טרום סוג 1 וסוכרת מסוג 1 חדשה. כאן, אנו מציגים פרוטוקול שלב אחר שלב באמצעות PCR דיגיטלי למדידת DNA INS נטול תאים שעובר מתילציה דיפרנציאלית בציטוזין במיקום -69 bp (ביחס לאתר התחלת השעתוק). אנו מדגימים כי הבדיקה יכולה להבחין בין ציטוזין שעבר מתילציה לבין ציטוזין ללא מתילציה במיקום -69 bp, הוא ליניארי בכמה סדרי גודל, מספק כימות מוחלט של מספרי עותקי DNA, וניתן ליישם אותו על דגימות של סרום אנושי מאנשים עם סוכרת מסוג 1 חדשה ובקרות ללא מחלות. ניתן להתאים את הפרוטוקול המתואר כאן לכל מין DNA שעבורו רצוי לזהות ציטוזינים שעברו מתילציה דיפרנציאלית, בין אם ממחזור הדם או מתאים ורקמות מבודדים, ויכול לספק כימות מוחלט של מקטעי DNA.

מבוא

סוכרת מסוג 1 (T1D) היא מחלה אוטואימונית אשר מאופיינת על ידי ההרס של איון מייצר אינסולין β תאים על ידי תאי אוטוריאקטיבים T 1. האבחנה של T1D היא בדרך כלל מתבצעת בזמן המדידה של היפרגליקמיה (הגלוקוז בדם> 200 mg / dl) אצל אדם רזה וצעיר, עלול להוות עם בחמצת כעדות לחוסר באינסולין. בעת האבחנה של T1D, יש ראיות על אובדן משמעותי של תפקוד התא β ומסה (מ -50 - 90%) 2. במחקרים קליניים, מספר תרופות modulatory החיסונית שהונהגו בעת האבחנה הביאה להתייצבות של תפקוד התא β (ומן הסתם מסה), אבל אף אחד מהם לא הביא רמיסיה קלינית של מחלת, ממצא גייסה השיחה לפיתוח של סמנים ביולוגיים לגילוי מוקדם של המחלה ועבור מעקב האורך של האפקטיביות של שילוב טיפול בעזרת 3,4. מאמצי קונסורציומים בינלאומיים, כזהזה הקונסורציום רשת המחקר איילט האדם במכונים הלאומיים של הית 5, הדגישו את הצורך לפתח סמנים ביולוגיים המתמקדים מתח מוות תאי β ב T1D.

עולה בקנה אחד עם המאמצים האלה, הקבוצה שלנו ואחרים פיתחו לאחרונה מבחני סמן ביולוגי המודדים במחזור, קטעי דנ"א שונה epigenetically שעולים בעיקר ממוות תאי β 6 - 9. בכל המבחנים שפורסמו עד כה, הדגש היה על quantitation של preproinsulin קידוד הגן האנושי (INS), אשר מביא לידי ביטוי מעלות פחות או יותר של אתרי CPG unmethylated באזורי קידוד אמרגן בהשוואה לסוגי תאים אחרים. שחרור שברי DNA unmethylated אח"י שוער כמו הנובעת בעיקר ממוות (נמקי, אפופטוטיים) תאי β. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי שלנו בנוער, הגבהים בשני DNA אח"י unmethylated ו מפוגל ב- BP עמדה -69 (ביחס ל- tהוא תעתיק להתחיל באתר) נצפו T1D חדש-onset, ויחד שימש סמנים ספציפיים לאוכלוסייה זו 6. מבחני סמן ביולוגי אלה כרוכים הבידוד של DNA התא מתוך סרום או פלזמה באמצעות ערכות ספין מסחרי, ואחריו המרה bisulfite של ה- DNA מבודד (להמיר cytosines הלא מפוגל כדי uracils, עוזב cytosines מפוגל ללא פגע).

בדו"ח זה, אנו מתארים את ההיבטים הטכניים של אוסף מדגם בסרום, בידוד של DNA התא מתוך בסרום, המרה bisulfite, והביצועים של PCR דיגיטלי אגל (להלן, דיגיטלי PCR) עבור ה- DNA אח"י מפוגל דיפרנציאלי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הצהרת אתיקה: הפרוטוקולים אושרו על ידי מועצת הביקורת המוסדית של אוניברסיטת אינדיאנה. הורי הנבדקים סיפקו הסכמה מדעת בכתב, וילדים מעל גיל 7 סיפקו הסכמה להשתתפותם.

1. עיבוד סרום

הערה: הבדיקה כמתואר נבדקה בקפדנות באמצעות סרום אנושי מבודד כדלקמן.

  1. אסוף דם בצינור איסוף דם אדום עליון (ללא תוסף; לא מצופה).
  2. השאירו בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות כדי לאפשר לקריש להיווצר.
  3. צינור צנטריפוגה ב 2,000 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. העבירו את הסופרנטנט (סרום) לצינור חדש המיועד לאחסון בסרום (צינורות עליונים בורגיים מפוליפרופילן, הגודל תלוי בדגימות).
  4. אחסן דגימות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד שהן מוכנות לבידוד DNA.

2. מיצוי DNA בסרום

הערה: DNA מופק עם ערכת מיצוי DNA באמצעות 50 מיקרוליטר סרום (מומלץ), בהתאם לפרוטוקול היצרן עם כמה שינויים.

  1. הכן מאגר ליזה של 200 מיקרוליטר + 1 מיקרוליטר פולי (A) (5 מיקרוגרם) לדגימה בצינור מיקרוצנטריפוגה. מערבולת למשך 15 שניות. מניחים בצד עד שלב 2.3.
  2. קח דגימות סרום מהמקפיא -80 מעלות צלזיוס והפשיר בטמפרטורת החדר. יש להביא את נפח דגימת הסרום עד ל-200 מיקרוליטר בסך הכל באמצעות תמיסת מלח עם חוצץ פוספט (PBS, עם סידן כלורי ומגנזיום כלוריד).
  3. ליזה את הדגימה על ידי הוספת 20 מיקרוליטר פרוטאז (1.4 יחידות אנסון/מ"ל) לדגימה, ואחריה 200 מיקרוליטר מאגר ליזה/תערובת פוליA (משלב 2.2) ומערבולת למשך 8 שניות. דגירה של דגימה ב-56 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ולאחר מכן צנטריפוגה קצרה למשך 7 שניות במהירות מרבית במיקרו-צנטריפוגה (>10,000 x גרם).
  4. לזרז DNA על ידי הוספת 230 מיקרוליטר 100% אתנול לדגימה ומערבולת למשך 8 שניות>.
  5. החל את ה-DNA על עמודת הספין על ידי הוספת תערובת דגימה של 600 מיקרוליטר לעמודת הספין המיני. צנטריפוגה ב 6,000 x גרם למשך דקה. השליכו את הזרימה והניחו את העמודה בצינור נקי.
  6. שטפו את ה-DNA על ידי הוספת מאגר כביסה של 500 מיקרוליטר 1 לעמודה. צנטריפוגה ב 6,000 x גרם למשך דקה. השליכו את הזרימה והניחו את העמודה בצינור נקי. הוסף מאגר כביסה 2 של 500 מיקרוליטר לעמודה ולצנטריפוגה במהירות מרבית (>10,000 x גרם) למשך 3 דקות. הנח את העמודה בצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש של 1.5 מ"ל וצנטריפוגה במהירות המרבית שוב למשך דקה אחת.
  7. הוצא את ה-DNA על ידי הנחת עמודה בצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש של 1.5 מ"ל והוספת מאגר פליטה של 60 מיקרוליטר ישירות על המסנן. חשוב להחליף טיפים בין דגימות כדי למנוע זיהום צולב. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות, ואז צנטריפוגה בטמפרטורה של 6,000 x גרם למשך דקה. הוסף עוד 60 מיקרוליטר של מאגר פליטה וצנטריפוגה ב-6,000 x גרם למשך דקה אחת.
  8. אחסן DNA בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר, או המשך מיד להמרת ביסולפיט.

3. המרת ביסולפיט

הערה: המרת ביסולפיט מתבצעת באמצעות ערכת המרה של ביסולפיט, בהתאם לפרוטוקול היצרן עם כמה שינויים.

  1. כדי להמיר ציטוזינים ללא מתילציה לאורצילים, הוסף 130 מיקרוליטר של מגיב המרה ביסולפיט ל-20 מיקרוליטר של DNA משלב 2.7 בשפופרת PCR (צינור PCR יחיד של 0.2 מ"ל או צינורות PCR עם 8 רצועות). שמור את 40 המיקרוליטר הנותרים של DNA לשימוש עתידי, או השתמש בתגובות שכפול. מערבבים 20 פעמים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה וצנטריפוגה קצרה כדי לוודא שאין טיפות בצדדים או במכסה. דגירה באמבט מים או במחזור תרמי כדלקמן: 98 מעלות צלזיוס למשך 8 דקות, 54 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות, 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    1. המשך לשלב 3.2 או אחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד 20 שעות.
  2. הוסף 600 מיקרוליטר של מאגר כריכה לעמודת הסיבוב והנח את העמודה בצינור האיסוף המצורף. מרחו את ה-DNA הביסולפיטי על העמודה וערבבו על ידי פיפטינג למעלה ולמטה 10 פעמים. צנטריפוגה במהירות מרבית (>10,000 x גרם) למשך 30 שניות.
  3. שטפו DNA על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של מאגר כביסה לעמוד ולצנטריפוגה במהירות מרבית (>10,000 x גרם) למשך 30 שניות.
  4. בצע דה-סולפונציה להסרת קבוצת סולפונאט כדי לסיים את ההמרה של ציטוזינים ללא מתילציה לאורציל על ידי הוספת 200 מיקרוליטר של מאגר דה-סולפונציה לעמודה. הניחו לעמוד בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות, ולאחר מכן צנטריפוגה במהירות מרבית (>10,000 x גרם) למשך 30 שניות.
  5. שטפו DNA על ידי הוספת 200 מיקרוליטר של מאגר כביסה לעמוד ולצנטריפוגה במלוא המהירות למשך 30 שניות. השליכו את הזרימה וחזרו על שלב הכביסה הזה.
  6. הנח את העמוד בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל. לחסל DNA על ידי הוספת מאגר פליטה של 10 מיקרוליטר ישירות למסנן העמודות. דגירה למשך דקה. צנטריפוגה למשך 30 שניות במלוא המהירות כדי לחסל DNA. כימות DNA משוחזר על ידי ספקטרופוטומטריה ב-A260.
    הערה: ה-DNA שזוהה על ידי ספקטרופוטומטריה מייצג בעיקר את ה-DNA ה-polyA הנשא שנוסף בשלב 2.3 לעיל. בדרך כלל, התאוששות של polyA היא ≥85% מהקלט (>4.25 מיקרוגרם).
  7. אחסן DNA ב-20 מעלות צלזיוס עד שמוכן להמשיך עם PCR דיגיטלי.

4. PCR דיגיטלי מולטיפלקס

  1. הכינו מיקס מאסטר עם מספיק פתרון לכל דגימה ובקרה. כלול לפחות דגימה אחת המכילה מים (בקרה שלילית), דגימה אחת של פלסמיד המכיל INS לא מתילציה (1 pg, בקרה חיובית), דגימה אחת של פלסמיד המכילה INS שעבר מתילציה (1 pg, בקרה חיובית), ודגימה אחת המכילה תערובת 1:1 של פלסמידים.
    1. כדי להכין את תערובת המאסטר של PCR, הוסף 12.5 מיקרוליטר לכל תגובה של מאגר PCR (למשל, 125 מיקרוליטר לכל 10 דגימות), 1.25 מיקרוליטר לכל תערובת פריימר/בדיקה לתגובה (למשל, 12.5 מיקרוליטר לכל 10 דגימות), 8.25 מיקרוליטר לכל מי תגובה (למשל, 82.5 מיקרוליטר לכל 10 דגימות), 0.5 מיקרוליטר לכל תגובה אנזים EcoR1 (למשל, 5 מיקרוליטר לכל 10 דגימות).
      הערה: פריימרים ובדיקות המשמשים כאן הם כדלקמן: פריימר קדימה: 5'-GGAAATTGTAGTTTTTAGTTTTTAGTTTTTTTTGTGT-3'; פריימר הפוך: 5'-AAAACCCTCCCCTACCTATCA-3'; בדיקת FAM: FAM-5'-ACCCCTACCTAAC-3'-MGB; בדיקת VIC: VIC-5'-ACCCCTACCGCCTAAC-3'-MGB.
  2. הגדר תגובת PCR מרובה בצלחת של 96 בארות. הוסף 19.5 מיקרוליטר של תערובת מאסטר לכל באר. הוסף 2.5 מיקרוליטר של דגימת DNA מומרת ביסולפיט לכל באר מתאימה (שמור את 7.5 המיקרוליטר הנותרים של DNA שהומר בביסולפיט או השתמש בתגובות שכפול). מערבבים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה מספר פעמים.
    הערה: כל 8 הבארות ברצף חייבות להכיל בקרת דגימה או מאגר.
  3. אוטמים עם אטם נייר כסף בעזרת אוטם צלחות וצנטריפוגה בספינר צלחת עד שאין נוזלים בצידי הבארות.
  4. הגדר את מחולל הטיפות האוטומטי במסך המגע.
    הערה: כל 8 הבארות במחסנית חייבות להכיל בקרת דגימה או מאגר.
    1. הגדר את מספר השורות בשימוש על ידי נגיעה בשורות שבהן נטענות דגימות על צלחת 96 הבארות משלב 4.2 וסמן את השורה בכחול כדי לציין שורה פעילה.
    2. טען חומרים מתכלים מאחור לפנים כדי למנוע זיהום. כדי להתחיל, הוסף מחסניות לאורך השורה האחורית של המכשיר. טען טיפים לשורה המרכזית של המכשיר.
      הערה: מחסניות הדיו יכולות להיכנס למחזיקים רק בכיוון הנכון.
    3. הנח צלחת 96 באר לתוך הכלי. מוציאים גוש קר מהמקפיא של -20 מעלות צלזיוס ומניחים לתוכו צלחת חדשה עם חצאית של 96 בארות. הנח אותו בתוך המכשיר ליד הצלחת הטעונה ב-96 בארות.
    4. הוסף שמן למתקן בקדמת המכשיר. בחר את סוג השמן במסך המגע.
    5. גע בלחצן ההתחלה הכחול כדי להתחיל את הריצה. אשר את הגדרת הצלחת וגע בלחצן התחל הפעלה כדי להתחיל.
  5. לאחר שתסיים, הסר את צלחת 96 הבארות המכילה את הטיפות החדשות שנוצרו ואטום עם אטם נייר כסף באמצעות אוטם צלחות.
  6. בצע PCR10 על מחזורי תרמי באמצעות התוכנית הבאה: 95 מעלות צלזיוס למשך 10:00 דקות; 40 מחזורים ב: 94 מעלות צלזיוס למשך 00:30 דקות, 57.5 מעלות צלזיוס למשך 01:00 דקה; 98 מעלות צלזיוס למשך 10:00 דקות; 12 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות או עד 24 שעות.
  7. הנח את הצלחת על קורא הטיפות והגדר את הקורא.
    1. לחץ על הכרטיסייה הגדרה. פתח תבנית חדשה על ידי לחיצה על תבנית > חדשה. הזן שם קובץ.
    2. השתמש בעורך הבאר כדי להגדיר את הפרמטרים עבור כל דגימה. תן לכל דגימה שם ייחודי, הגדר את הניסוי לזיהוי אירועים נדירים (R-RED), והגדר את מיקס המאסטר לתמהיל ששימש בשלב 4.1.
    3. תנו ליעד 1 שם (כלומר, ללא מתילציה) והגדירו את יעד 1 כלא ידוע (U). תן ליעד 2 שם (כלומר, מתילציה) והגדר את יעד 2 כהתייחסות (R).
    4. לחץ על הכרטיסיה הפעלה כדי להתחיל את ההפעלה. בחלון אפשרויות ההפעלה, בחר את כימיית הזיהוי (FAM/VIC).

5. ניתוח נתונים

  1. פתח תוצאות בכרטיסיית ניתוח ונתח באמצעות תרשים דו-ממדי המבוסס על בקרות חיוביות (ראה איור 1).
  2. ייצא קובץ CSV שנוצר על ידי קורא droplet לתוכנית גיליון אלקטרוני לניתוח נתונים.
  3. כדי ליצור "עותקים למיקרוליטר" של סרום, השתמש בנוסחה: (ריכוז*250)/(נפח הסרום המשמש לבידוד DNA במיקרוליטר). 6
    הערה: הנתונים מומרים בדרך כללל-log 10 כאשר הם נרכשים מסרום אנושי כדי להבטיח פיזור נורמלי. לחלופין, ניתן לשרטט נתונים בסולם לוג10 ולנתח אותם על ידי סטטיסטיקה לא פרמטרית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כדי לפרש את הנתונים כראוי, אנו משתמשים שולטים פלסמיד היא DNA אח"י יעד unmethylated ו המפוגלת בכל ריצת PCR דיגיטלית. בקרות אלה להבטיח כי האותות המתאימים DNA המפוגל unmethylated וניתן להבחין בבירור. איור 1 מציג את מגרשים פיזור 2-D המתאים טיפות עבור פקדי פלסמיד המכיל אח"י unmethylated המרה bisulfite DNA (איור 1 א), DNA אח"י מפוגל (איור 1B), ו- 1: תערובת 1 של ש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מתילציה של cytosines ידי methyltransferases DNA מאפשרת השליטה אפיגנטיים של שעתוק גנים רבים. גן אח"י בבני האדם הוא כמעט לידי ביטוי אך ורק איון β תאים, נראה שיש קורלציה בין תדירות מתילציה של cytosines בגן INS כדי להשתיק של השעתוק שלה 11. ככזה, סוגי התאים ביותר מציגים תדירות גבוהה יותר באופן משמעותי של מתילציה של גני אח"י ב cytosines השונה לעומת בטא תאים 11 - 13. הוצע כי השכיחות של מוות תאי β יכול להיות ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענק UC4 DK104166 של המכונים הלאומיים לבריאות. ברצוננו להודות לסיוע של מרכז המחקר לסוכרת באינדיאנה הנתמך על ידי מענק P30 DK097512 של המכונים הלאומיים לבריאות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
שואב אדום עליון Beckon Dickinson366441 ללא תוסף, פנים לא מצופה, 10 מ"ל
צינור קריוביאליSimportT310-3Aפוליפרופילן, צינור מכסה בורג, בכל גודל
QIAamp DNA ערכת מיני דםQiagen51106
Poly(A)SigmaP9403לא אהוב במאגר TE (10 מ"מ Tris-Cl pH 8.0 + 1 מ"מ EDTA) עד 5 ומיקרו; g/µ l 
אתנול מוחלט (200 הוכחה)פישר סיינטיפיקBP2818-500
DPBS (עם CaCl2 ו-MgCl2)SigmaD8662
0.2 מ"ל PCR 8 רצועות צינורותMidSciAVST
8 רצועות, כיפהMidSciAVSTC-N
EZ DNA ערכת מתילציה-ברקZymoD5031
ddPCR Supermix לבדיקות (ללא dUTP)Biorad1863024
בקרת חיץ לבדיקותBiorad1863052
Human Unmethylated / Methylated פריימר/תערובת בדיקהLife TechnologiesAH21BH1
EcoR1New England BiolabsR0101L
twin.tec PCR Plate 96,Eppendorfלמחצה 951020346
חותם חום רדיד ניתן לניקובBiorad1814040
PX1 PCR אוטם צלחתBiorad1814000
QX200 AutoDG טיפה דיגיטלית PCR מערכת Biorad1864101
אוטומטי טיפות ייצור שמן לבדיקותBiorad186-4110
DG32 מחסנית לגנרטור טיפות אוטומטיBiorad186-4108
טיפות לפיפט לגנרטור טיפות אוטומטיBiorad186-4120
פחי טיפות למחולל טיפות אוטומטיBiorad186-4125
C1000 מגע Thermal CyclerBiorad1851197
QX200 קורא טיפותBiorad186-4003
ddPCR קורא טיפות שמןBiorad186-3004
חצאית

מקורות

  1. Lehuen, A., Diana, J., Zaccone, P., Cooke, A. Immune cell crosstalk in type 1 diabetes. Nat. Rev. Immunol. 10 (7), 501-513 (2010).
  2. Sherry, N. A., Tsai, E. B., Herold, K. C. Natural history of beta-cell function in type 1 diabetes. Diabetes. 54, Suppl 2 32-39 (2005).
  3. Maganti, A., Evans-Molina, C., Mirmira, R. From immunobiology to β-cell biology: the changing perspective on type 1 diabetes. Islets. 6 (2), 28778(2014).
  4. Matthews, J. B., Staeva, T. P., Bernstein, P. L., Peakman, M., von Herrath, M. ITN-JDRF Type 1 Diabetes Combination Therapy Assessment Group Developing combination immunotherapies for type 1 diabetes: recommendations from the ITN-JDRF Type 1 Diabetes Combination Therapy Assessment Group. Clin. Exp. Immunol. 160 (2), 176-184 (2010).
  5. Human Islet Research Network | HIRN. , Available from: https://hirnetwork.org/ (2016).
  6. Fisher, M. M., Watkins, R. A., et al. Elevations in Circulating Methylated and Unmethylated Preproinsulin DNA in New-Onset Type 1 Diabetes. Diabetes. 64 (11), 3867-3872 (2015).
  7. Husseiny, M. I., Kaye, A., Zebadua, E., Kandeel, F., Ferreri, K. Tissue-Specific Methylation of Human Insulin Gene and PCR Assay for Monitoring Beta Cell Death. PLoS ONE. 9 (4), 94591(2014).
  8. Herold, K. C., Usmani-Brown, S., et al. β cell death and dysfunction during type 1 diabetes development in at-risk individuals. J. Clin. Invest. 125 (3), 1163-1173 (2015).
  9. Lehmann-Werman, R., Neiman, D., et al. Identification of tissue-specific cell death using methylation patterns of circulating DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 113 (13), 1826-1834 (2016).
  10. Saiki, R. K., Gelfand, D. H., et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science. 239 (4839), 487-491 (1988).
  11. Kuroda, A., Rauch, T. A., et al. Insulin gene expression is regulated by DNA methylation. PloS One. 4 (9), 6953(2009).
  12. Akirav, E. M., Lebastchi, J., et al. Detection of β cell death in diabetes using differentially methylated circulating DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (47), 19018-19023 (2011).
  13. Fisher, M. M., Perez Chumbiauca, C. N., Mather, K. J., Mirmira, R. G., Tersey, S. A. Detection of islet β-cell death in vivo by multiplex PCR analysis of differentially methylated DNA. Endocrinology. 154 (9), 3476-3481 (2013).
  14. Patterson, K., Molloy, L., Qu, W., Clark, S. DNA methylation: bisulphite modification and analysis. J. Vis. Exp. (56), (2011).
  15. Derks, S., Lentjes, M. H. F. M., Hellebrekers, D. M. E. I., de Bruïne, A. P., Herman, J. G., van Engeland, M. Methylation-specific PCR unraveled. Cell. Oncol. 26 (5-6), 291-299 (2004).
  16. Husseiny, M. I., Kuroda, A., Kaye, A. N., Nair, I., Kandeel, F., Ferreri, K. Development of a quantitative methylation-specific polymerase chain reaction method for monitoring beta cell death in type 1 diabetes. PloS One. 7 (10), 47942(2012).
  17. Hindson, B. J., Ness, K. D., et al. High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number. Anal. Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).
  18. Sozzi, G., Roz, L., et al. Effects of prolonged storage of whole plasma or isolated plasma DNA on the results of circulating DNA quantification assays. J. Natl. Cancer Inst. 97 (24), 1848-1850 (2005).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

DNA בעל מתילציה דיפרנציאליתPCR דיגיטלימוות של תאי בטאהמרה של ביסולפיטDNA של פרה-פרואינסוליןסוכרת מסוג 1כימות מוחלטDNA חופשי מתאיםמתילציה/חוסר מתילציה
מדידת דיפרנציאלי Methylated
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.