בדיקה בתפוקה גבוהה בזמן אמת פותחה כדי לזהות בו זמנית (1) אנטי-מיקרוביאלים חודרי תאים אוקריוטיים המכוונים לפתוגן חיידקי תוך תאי, ו-(2) להעריך ציטוטוקסיות של תאים אוקריוטיים. וריאציה על אותה טכנולוגיה שולבה לאחר מכן עם טכנולוגיית חלוקה דיגיטלית כדי לאפשר מחקרי סינרגיה קלים, ברזולוציה גבוהה, מינון-תגובה וסינרגיה דו-ממדית ותלת-ממדית.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
תפוקה גבוהה, בזמן אמת, בדיקת Dual-readout של פעילות מיקרוביאלית תאיים Cytotoxicity Cell איקריוטיים
במאמר זה
סיכום
תקציר
מדדים מסורתיים של פעילות מיקרוביאלית תאיים cytotoxicity תא אוקריוטים להסתמך על מבחני הסיום. מבחני הסיום כאלה דורשים כמה צעדים ניסיוניים נוספים לפני readout, כגון תמוגה התא, נחישות יחידת המושבה להרכיב, או בנוסף מגיב. בעת ביצוע אלף מבחנים, למשל, במהלך הקרנת תפוקה גבוהה, המאמץ במורד הזרם הנדרש עבור סוגים אלה של מבחנים הוא ניכר. לכן, כדי להקל על גילוי מיקרוביאלית תפוקה גבוה, פתחנו assay בזמן אמת לזהות מעכבים הזמניים של התפתחות חיידקים תאית ולהעריך cytotoxicity תא האיקריוטים. באופן ספציפי, זיהוי התפתחות חיידקים תאית בזמן האמת היה מופעל על ידי סימון זני הקרנה חיידקי גם עם אופרון לוקס בקטריאלי (1 assay דור st) או כתבי חלבון פלואורסצנטי (2 דור nd, assay המאונך). לצבוע רעיל, קרום התא-impermeant, חומצות גרעין מחייבגם נוסף במהלך הדבקה ראשונית של מקרופאגים. צבעים אלה אינם נכללים תאי קיימא. עם זאת, תאי מארחים לא-ישימים לאבד שלמות קרום המתיר כניסה וסימון ניאון של DNA הגרעיני (חומצת deoxyribonucleic). יש לציין, DNA כריכה קשור לעלייה גדולה תשואת קוונטים פלורסנט המספקת הודעת פתרון המבוסס על מות תא מארח. השתמשנו assay המשולב הזה לבצע מסך תפוקה גבוהה בפורמט microplate, ועל מנת להעריך את הצמיחה ואת cytotoxicity תאיים על ידי מיקרוסקופ. יש לציין, antimicrobials עשוי להפגין סינרגיה שבו ההשפעה המשולבת של שתיים או יותר antimicrobials כאשר מיושמים יחד עולה כאשר מיושמים בנפרד. בדיקת לסינרגיה במבחנה נגד פתוגנים תאיים היא בדרך כלל משימה אדירה כמו פרמוטציות קומבינטורית של אנטיביוטיקה בריכוזים שונים צריך להיבדק. עם זאת, מצאנו כי assay בזמן האמת שלנו בשילוב עם אוטומטיות, דיגיטלי מחלק הטכנולוגיה permitted בדיקות סינרגיה קליל. באמצעות גישות אלו, הצלחנו לסקור פעולה שיטתית של מספר רב של antimicrobials לבד או ביחד נגד הפתוגן התאי, pneumophila הלגיונלה.
מבוא
פתוגנים גדלים או מתגוררים באופן זמני בתאים תאיים קשים למגר טיפולי. לחייב או יחסית לחייב פתוגנים תאיים כגון pneumophila הלגיונלה, burnetii Coxiella, spp Brucella. Francisella, tularensis, ו spp Mycobacterium. לעתים קרובות דורשים ממושך קורסים של טיפול אנטי-מיקרוביאלי לריפוי כי עשוי לנוע בין חודשים ואף שנים. יתר על כן, פתוגנים תאיים עשויים זמני לכבוש נישות תאיות בדרך זו לברוח אישור על ידי קורסים רגילים של טיפול אנטי-מיקרוביאלי, ואחר כך יוצא להתחיל סיבובים חדשים של זיהום ארסי. Staphylococcus aureus 1 וזיהומי uropathogenic 2,3 Enterobacteriaceae הם ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. צמיחה התאית Real Time ו Assay Cytotoxicity Cell איקריוטיים
- תאי מארח הכנה (תאי J774A.1)
- תרבות J774A.1 תאי מקרופאג דמוי musculus Mus ההשעיה ב RPMI 1640 עם 9% נסיוב עגל-בתוספת ברזל. בתחילה מעבר צלוחיות בתרבית רקמה. לאחר התאים הפכו ומחוברות בבקבוק תרבות 75 ס"מ 2 רקמות 15 מ"ל של מדיום, לפצל על ידי גירוד ודילול ל -65 מ"ל עם אותו סוג של מדיום, מתוכם 15 מ"ל מוחזר אל הבקבוק בתרבית רקמה ו -50 מ"ל מועבר בבקבוק שייקר 250 מיליליטר חיידקים. <....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
assay צמיחה התאי microplate
איור 1 דיאגרמות הצעדים assay. השלבים האוטומטיים לראות יכולים להתבצע באופן ידני. עם זאת, התפוקה היא הקל מאוד באמצעות מערכות טיפול נוזליות.
איור 2 מציג תוצאות נציג מתוך microplate 384 גם,-.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
אנו מתארים מבחנים בזמן אמת עבור זיהוי סימולטני של התפתחות חיידקים תאית cytotoxicity תא מארח. ישנם מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול. ראשית, עבור ביצועים assay חזקים, חייבת להיעשות הפרדה ספקטרלי מספיק בין readouts חיידקים cytotoxicity. הפרדה כזו היא חלק מובנה עבור שילובים של כתבים אופרון בלוציפראז וצבעים-DNA מחייבת ניאון. עם זאת, על סמך הניסיון שלנו (לוח 1-3, איור 2), השימוש כפול, הודעת פלורסנט דורשת אותות ניאון שאינם חופפים (למשל, שימוש עיתונא.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
מחקר דיווח בכתב היד הזה נתמך על ידי המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות של המכונים הלאומיים לבריאות תחת מספר פרסי R01AI099122 כדי JEK התוכן הוא באחריות בלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של המכון הלאומי בְּרִיאוּת. ברצוננו להודות ג'ניפר סמית, הדוד וורובל, סו צ'יאנג, דאג מבול, שון ג'ונסטון, ג'ניפר רציונל, סטיוארט רודניצקי, פול יאן, ריצ'רד סיו, ורחל וורדן ממתקן הקרנת ICCB-Longwood ו / או מעבדת ההקרנה הארצית המרכזים האזוריים של ניו אינגלנד מצוינת להגנה מפני טרור ביולוגי ומתפתחים מחלות זיהומיות (נתמכות על ידי U54AI057159) על עזרת פיתוח וביצוע מבחני תפוקה גבוהה הקרנה. כמו כן, אנו רוצים להודות קנת....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| תאי J774A.1 | אוסף תרבית מסוג אמריקאי | TIB-67 | תא מארח |
| ACES | Sigma-Aldrich | A9758 | להכנת תמצית שמרי פחם חומציים אגר ותמצית שמרים חומצה בינונית |
| תמצית שמרים, 210929 בקטון-דיקינסון/דיפקו אולטרה-מסוננים | להכנת תמצית שמרי פחם חומציים אגר ותמצית שמרים חומצית; דרגות נמוכות יותר עלולות לגרום לפגיעה בגדילה ו/או לשנות את הרגישות של לגיונלה למעכבי גדילה | ||
| חומצה אלפא-קטוגלוטרית, מלח מונופוטסיום | סיגמא-אולדריץ' | K2000 | להכנת תמצית שמרי פחם חומציים אגר ותמצית שמרים חומציים בינונית |
| סודיום פירובט | Sigma-Aldrich | P5280 | להכנת תמצית שמרי פחם חומצית אגר ותמצית שמרים חומצה בינונית |
| אשלגן פוספט, dibasic | Thermo Fisher Scientific | P288-500 | להכנת תמצית שמרי פחם חומצית אגר ותמצית שמרים חומצה |
| בינונית L-ציסטאין | Sigma-Aldrich | C-7755 | להכנת תמצית שמרי פחם חומצית אגר ותמצית שמרים חומצה בינונית |
| אמוניום ברזל (III) ציטראט | Sigma-Aldrich | F5879 | להכנת תמצית שמרי פחם חומציים אגר ומדיום תמצית שמרים חומציים; ניתן להשתמש בפירופוספט ברזל במקום זאת אך קשה יותר לשקול במדויק |
| תמיסת אשלגן הידרוקסיד, מרוכזת | Thermo Fisher Scientific | SP236-500 | להכנת תמצית שמרי פחם חומציים אגר ותמצית שמרים חומצה בינונית |
| מים נטולי שוניים | N/A | N/A | להכנת תמצית שמרי פחם חומציים אגר ותמצית שמרים חומצה בינונית |
| תימידין (דרגת תרבית רקמות) | Sigma-Aldrich | T1895 | להשלמת RPMI 1640 ותמצית שמרים חוצצת אגר/בינוני — ניתן להשתמש בתימידין בדרגה נמוכה יותר עבור האחרון, אך עלול לגרום לפגיעה בצמיחת תאים ו/או למוות תאים ב-RPMI 1640 |
| RPMI 1640, ניסוח סטנדרטי | Corning via Thermo Fisher Scientific | 10-040-CV | לגידול תאי J774A.1 לפני הציפוי; כולל 2 מ"מ L-גלוטמין |
| RPMI 1640 חסר פנול אדום | קורנינג באמצעות Thermo Fisher Scientific | 17-105-CV | לציפוי תאי J774A.1 ב-384 צלחות באר (לא מתאים לגידול לפני הציפוי); חסר גם L-גלוטמין ו-mdash; תוספת ל-2 מ"מ לפני השימוש |
| L-גלוטמין, 200 מ"מ ב-0.85% NaCl (דרגת תרבית רקמות) | HyClone באמצעות Thermo Fisher Scientific | SH30034.02 | להשלמת RPMI 1640 חסר L-גלוטמין, לריכוז סופי של 2 מ"מ |
| סרום עגל בתוספת ברזל | Gemini Bioproducts | 100-510 | להשלמת RPMI 1640, לריכוז סופי של 9.1% |
| תמיסת טריפן כחול | Sigma-Aldrich | T8154 | לצביעה לקביעת מוות תאים J774A.1 תוך ספירת צפיפות התאים |
| SYTOX Green, תמיסה של 5 מ"מ ב-DMSO | Thermo Fisher Scientific | S7020 | לצביעה לקביעת מוות תאים J774A.1 על ידי קריאת פלואורסצנציה או מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי (בשילוב עם חיידקים פלואורסצנטיים כתומים-אדומים או אדומים רחוקים). יש להשתמש בריכוז סופי של 125 ננומטר. |
| חממת תרבית תאים | Thermo Fisher Scientific | 13-255-26 | לדגירה של תאי J774A.1 (לפני ואחרי הדבקה); יכול לשמש גם לדגירה של חיידקים, או שניתן להשתמש בחממת אטמוספירה סטנדרטית במקום) |
| שייקר אורביטלי | BellCo Glass | 7744-01010 | לנער דגירה של תאי J774A.1 לפני הדבקה; מתאים לאינקובטור תרבית תאים; כולל בסיס שייקר 7744-01000 ומגש 7740-01010 (אלה זמינים גם בנפרד) |
| צלוחיות שייקר (250 מ"ל) | ChemGlass Life Sciences | CLS-2038-04 | לנערוע דגירה של תאי J774A.1 לפני הדבקה |
| מהדקי שייקר לצלוחיות (250 מ"ל) | BellCo Glass | 7744-16250 | לטלטול דגירה של תאי J774A.1 לפני הדבקה |
| צלוחיות שייקר (1,000 מ"ל) | ChemGlass Life Sciences | CLS-2038-07 | לניעור דגירה של תאי J774A.1 לפני הדבקה |
| מהדקי שייקר לצלוחיות (1,000 מ"ל) | BellCo Glass | 7744-16100 | לדגירה של תאי J774A.1 לפני הדבקה |
| מכסי קצף ספוג לצלוחיות (250 מ"ל-1,000 מ"ל) | ChemGlass Life Sciences | CLS-1490-038 | לדגירה מטלטלת של תאי J774A.1 לפני ההדבקה; מפחית את הסיכון לזיהום ביחס למכסי מתכת סטנדרטיים |
| MultiDrop Combi משאבה פריסטלטית רב-ערוצית הניתנת לתכנות | Thermo Fisher Scientific | 5840300 | להפצת תאי J774A.1, תרחיף בינוני וחיידקי המכיל פלואורופורים למספר רב של 384 כלי באר |
| סעפת קידוח סטנדרטית Combi | Thermo Fisher Scientific | 24072670 | נפח ברירת מחדל של 20 μ l אינו מספיק כדי לפצות על התיישבות — עלייה ל-80 μ l |
| לבן 384 כלים שטופלו היטב לתרבית רקמות | קורנינג | 3570 | לקריאת זוהר ופלואורסצנטיות; קטלוג גריינר # 781080 נבדק גם בהצלחה |
| DMSO (דרגת תרבית רקמות, באמפולות אטומות) | Sigma-Aldrich | D2650 | להמסת תרכובות בקרה ובדיקה חיוביות |
| Azithromycin | Sigma-Aldrich | PHR1088 | אנטיביוטיקה בקרה חיובית |
| Saponin (מקליפת Quillaja) | Sigma-Aldrich | S-4521 | פיפטור |
| חיובי לבקרת ציטוקסיות רב-ערוציThermo Fisher Scientific | Finnpipette | להעברת כמויות קבועות של תרכובות בקרה חיוביות; הפיפטור חייב להיות בעל חלוקה דיגיטלית עם עצירות כדי לאפשר חלוקה חוזרת של נפח קבוע | |
| רובוט העברת פינים | של Epson Epson/ICCB-L | (ציוד מותאם אישית) | להעברת כמויות קבועות של תרכובות בדיקה ממערכי ספרייה |
| מערכת ניפוק דיגיטלית D300 | Hewlett-Packard באמצעות Tecan | D300 | להעברת כמויות משתנות של תרכובות בדיקה הנעות בין 11 פיקוליטר ל-10 ומיקרו; l |
| מחסניות T8+ למערכת חלוקה דיגיטלית D300 | Hewlett-Packard באמצעות Tecan | T8 + | לחלוקת תרכובות בדיקה |
| מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי עם מצלמה דיגיטלית המחוברת למחשב | Nikon | Ti | להדמיית תאים חיים; כל מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטנדרטי יכול להחליף, בניגודיות פאזה או אופטיקה DIC, המסוגל לדמות ירוק (פלואורסצאין), כתום-אדום לאדום (טקסס אדום) ואדום רחוק (Cy5), עם שמן פי 100 מטרה לרזולוציה הגבוהה ביותר |
| כלי תרבית רקמה עם תחתית זכוכית | MatTek Corporation | P35G-1.5-20-C | להדמיית תאים חיים. צלחות כמו ה-MatTek מאפשרות הדמיה מיקרוסקופית בהגדלה של 600X או 1,000X באמצעות שימוש במיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי או קונפוקלי הפוך. כלים ספציפיים אלה הם בקוטר נומינלי של 3.5 ס"מ, קוטר פנימי של 3.3 ס"מ, עם החלקות כיסוי בעובי 20 מ"מ #1.5 המוכנסות לתחתית. |
| ניתן להשתמש בפוטושופ CS6 | ב-Adobe | , בפוטושופ או בתוכנות דומות כדי למזג תמונות בהיר, מיקרוסקופיות ופלואורסצנטיות. | |
| Mathematica 10 | Wolfam | ליצירת איזובלוגרמות איזוקונטור דו-ממדיות ואיזובולוגרמות פני שטח תלת מימדיות. |
מקורות
- Garzoni, C., Kelley, W. L. Staphylococcus aureus: new evidence for intracellular persistence. Trends Microbiol. 17 (2), 59-65 (2009).
- Rosen, D. A., et al. Utilization of an intra....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
