מאמר שיטה

תפוקה גבוהה, בזמן אמת, בדיקת Dual-readout של פעילות מיקרוביאלית תאיים Cytotoxicity Cell איקריוטיים

DOI:

10.3791/54841

⸱

16 בנובמבר 2016

 ,  , 
1Department of Pathology, Beth Israel Deaconess Medical Center

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בדיקה בתפוקה גבוהה בזמן אמת פותחה כדי לזהות בו זמנית (1) אנטי-מיקרוביאלים חודרי תאים אוקריוטיים המכוונים לפתוגן חיידקי תוך תאי, ו-(2) להעריך ציטוטוקסיות של תאים אוקריוטיים. וריאציה על אותה טכנולוגיה שולבה לאחר מכן עם טכנולוגיית חלוקה דיגיטלית כדי לאפשר מחקרי סינרגיה קלים, ברזולוציה גבוהה, מינון-תגובה וסינרגיה דו-ממדית ותלת-ממדית.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מדדים מסורתיים של פעילות מיקרוביאלית תאיים cytotoxicity תא אוקריוטים להסתמך על מבחני הסיום. מבחני הסיום כאלה דורשים כמה צעדים ניסיוניים נוספים לפני readout, כגון תמוגה התא, נחישות יחידת המושבה להרכיב, או בנוסף מגיב. בעת ביצוע אלף מבחנים, למשל, במהלך הקרנת תפוקה גבוהה, המאמץ במורד הזרם הנדרש עבור סוגים אלה של מבחנים הוא ניכר. לכן, כדי להקל על גילוי מיקרוביאלית תפוקה גבוה, פתחנו assay בזמן אמת לזהות מעכבים הזמניים של התפתחות חיידקים תאית ולהעריך cytotoxicity תא האיקריוטים. באופן ספציפי, זיהוי התפתחות חיידקים תאית בזמן האמת היה מופעל על ידי סימון זני הקרנה חיידקי גם עם אופרון לוקס בקטריאלי (1 assay דור st) או כתבי חלבון פלואורסצנטי (2 דור nd, assay המאונך). לצבוע רעיל, קרום התא-impermeant, חומצות גרעין מחייבגם נוסף במהלך הדבקה ראשונית של מקרופאגים. צבעים אלה אינם נכללים תאי קיימא. עם זאת, תאי מארחים לא-ישימים לאבד שלמות קרום המתיר כניסה וסימון ניאון של DNA הגרעיני (חומצת deoxyribonucleic). יש לציין, DNA כריכה קשור לעלייה גדולה תשואת קוונטים פלורסנט המספקת הודעת פתרון המבוסס על מות תא מארח. השתמשנו assay המשולב הזה לבצע מסך תפוקה גבוהה בפורמט microplate, ועל מנת להעריך את הצמיחה ואת cytotoxicity תאיים על ידי מיקרוסקופ. יש לציין, antimicrobials עשוי להפגין סינרגיה שבו ההשפעה המשולבת של שתיים או יותר antimicrobials כאשר מיושמים יחד עולה כאשר מיושמים בנפרד. בדיקת לסינרגיה במבחנה נגד פתוגנים תאיים היא בדרך כלל משימה אדירה כמו פרמוטציות קומבינטורית של אנטיביוטיקה בריכוזים שונים צריך להיבדק. עם זאת, מצאנו כי assay בזמן האמת שלנו בשילוב עם אוטומטיות, דיגיטלי מחלק הטכנולוגיה permitted בדיקות סינרגיה קליל. באמצעות גישות אלו, הצלחנו לסקור פעולה שיטתית של מספר רב של antimicrobials לבד או ביחד נגד הפתוגן התאי, pneumophila הלגיונלה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פתוגנים גדלים או מתגוררים באופן זמני בתאים תאיים קשים למגר טיפולי. לחייב או יחסית לחייב פתוגנים תאיים כגון pneumophila הלגיונלה, burnetii Coxiella, spp Brucella. Francisella, tularensis, ו spp Mycobacterium. לעתים קרובות דורשים ממושך קורסים של טיפול אנטי-מיקרוביאלי לריפוי כי עשוי לנוע בין חודשים ואף שנים. יתר על כן, פתוגנים תאיים עשויים זמני לכבוש נישות תאיות בדרך זו לברוח אישור על ידי קורסים רגילים של טיפול אנטי-מיקרוביאלי, ואחר כך יוצא להתחיל סיבובים חדשים של זיהום ארסי. Staphylococcus aureus 1 וזיהומי uropathogenic 2,3 Enterobacteriaceae הם שתי דוגמאות להכרה גוברת. לכן, מטרת גילוי תרופות בסיסית היא לזהות antimicrobials רומן חודרים לתאים תאיים. טיפול אופטימלי במהירות לבעראורגניזמים תאיים ולמנוע התפתחות של עמידות באמצעות חשיפה מיקרוביאלית תת-מעכבות במיוחד רצוי.

לשם כך, פתחנו טכנולוגית הקרנת תפוקה גבוהה לזהות antimicrobials תאי-penetrant מיקוד הצמיחה התאית של הפתוגן המודל, pneumophila הלגיונלה. 4 תצפיות קליניות קודמות עולות כי בדיקות רגישות מיקרוביאלית תקן לא לחזות במדויק יעילות טיפולית vivo נגד אורגניזם זה. באופן ספציפי 5, זה היה בגלל סוגים עיקריים של antimicrobials כמו β-lactams ו אמינוגליקוזידים, למרות יעיל מאוד נגד axenically גדלה הלגיונלה, אינם חודרים מספיק לתוך התאים התאיים שבו הלגיונלה מתגורר. 5,6 ראיות בהמשך הציעו טכני מורכבים יותר מבחני צמיחה תאית חזה יעילות קלינית ביעילות. 7 למרבה הצער, אלה מבחנים היו מבחני נקודות קצה מייגעים, מחייב מקרופאגים נגועים, שטופלו antimicrobials, להיות lysed בנקודות בזמנים שונים עבור ספירת יחידת מושבה להרכיב. מבחנים כאלה הם מעשי לעשות בקנה מידה גדולה והם מתאימים לגילוי סמי תפוקה גבוהה.

לכן, פתחנו טכנולוגיה לקביעה בזמן האמת של התפתחות חיידקים תאית. 6 הדבר זה הושג באמצעות שימוש זן חיידקים השונה באמצעות שילוב של אחת המעמד של חיידקים בלוציפראז אופרון 8 (assay הדור הראשון, שתואר לעיל) 4 או פלורסנט חלבון 9 עיתונאים (דור שני, assay המאונך, המתוארת כאן) לתוך כרומוזום החיידקים. בדרך זו, זורח או אות ניאון מספק פונדקאית, readout בזמן אמת של מספר חיידקים.

עם זאת, תכונות אלה לא להתייחס מתערבים מרכזיים infectio התאימבחני n, השפעות חוץ-היעד בתא הפונדקאי. בפרט, מותו של תא המארח מגביל מטבעו צמיחה תאית וגורם זיהוי חיובי כוזב של אפקט מיקרוביאלית. כמו תרכובות רבות בספריות הקרנה הן תאים איקריוטיים, רעילות תוצאות חיוביות שגויות כאלה היו להציף antimicrobials נכון, דבר מחייב מספר גדול של מעקב, מבחני cytotoxicity קץ לשם קבלת החלטה.

לכן, זה היה עניין רב כדי להיות מסוגל להעריך כדאיויות תא האיקריוטים וצמיחה תאית זמנית. יש לציין, מאפיין של תאים איקריוטיים הלא קיימא הוא הפגיעה בשלמות קרום התא. בדיקות הבודקים את החדירות של קרום התא עשוי אפוא לשמש כדי להעריך כדאיות התא. אנחנו שאפיינו את היכולת של סדרת-impermeant קרום התא putatively, ניאון, צבעים-DNA מחייבת לגשת להכתים DNA הגרעיני של תאים מתים. 4 ביום ה- DNA מחייב גרעינית, צבעים אלה מהווים גידול גדול quantuמ פלורסנט תשואה וכתוצאה מכך האות מוגברת על קרינת פתרון רקע. ככזה, צבעים אלה ספקו הודעה כמותי של מוות של תאים איקריוטיים. 4 יש לציין, מצאנו כי כמה היו רעילים עצמם במהלך שיתוף דגירה ממושכת עם מקרופאגים J774. כאשר נוספו במהלך הזיהום הראשוני, הם סיפקו בזמן אמת, ההודעה ניאון של מוות של תאים איקריוטיים שניתן למדוד על ידי fluorimeter microplate או שנצפה מיקרוסקופית.

לכן, על ידי שילוב של השימוש עיתונאי חיידקים ולא רעיל, קרום impermeant, צבעי ה- DNA מחייב, הצלחנו לפתח assay פשוט, שאינו הרסני, בזמן אמת כדי למדוד הן עומס חיידקים ו cytotoxicity תא אוקריוטים זמנית. assay זו אפשרה לנו להקרין בפורמט צלחת 384 גם ~ 10,000 bioactives ידוע כולל ~ 250 antimicrobials ו> 240,000 מולקולות קטנות עם פעילות uncharacterized מבחינה תפקודית עבור היכולת לעכב צמיחה תאית שלPneumophila הלגיונלה, בעוד באותו הזמן להפקת נתוני cytotoxicity התא אוקריוטים לכל מתחם. 6 הניתוח שלנו של antimicrobials הידוע מפני צמיחה תאית של הלגיונלה היה החקר המקיף ביותר מסוג זה עד כה. 6

בהתבסס על היעילות של פורמט assay שלנו, אנו ובהמשך גם בחנו את ההשפעות סינרגיסטי הפוטנציאלי של antimicrobials ידוע מתי להשתמש בשילוב. אחד המבחנים סינרגיה הנפוצים ביותר, assay שחמט שנקרא, מבוצע standardly ידי הערכת ההשפעות קומבינטורית של דילולים סדרתי כפולה של שניים או יותר antimicrobials. 10 מבחנים אלה, סינרגיה מוגדרת על ידי התצפית של השפעה גדולה יותר כאשר שתיים או יותר antimicrobials מוחלים יחד מסכום ההשפעות של כל מיושמות בנפרד. מן ראוי לציין כי, עד כה, התמקד רק ובדיקת סינרגיה סלקטיבית בוצעה נגד pneumophila הלגיונלה התאי בגלל מאמץ הרב טמון מבחני סיום מסורתיים מוכפלים פרמוטציות קומבינטורית הנדרשת.

כדי לאפשר בדיקת סינרגיה, עשינו שימוש הצמיחה תאית בזמן האמת שלנו / assay cytotoxicity איקריוטיים בשילוב עם טכנולוגיה מחלק דיגיטלית אוטומטית 6. אוטומציה זה מותר לנו לוותר דילולי סדרה של תרכובות המומסות DMSO או בתמיסה מימית לבד או בשילוב בפורמט 384 גם. 11 יתר על כן, טכנולוגית טיפול נוזל חזקה כאלה מותר לנו לבצע ברזולוציה גבוהה יותר בקלות, שורש ריבועי-של-שני (ולא סטנדרטי, רזולוציה נמוכה יותר, הכפלה) שילובי דילול להשיג רמות גבוהות יותר של סגוליות בסינרגיה דו הממדים, שחמט שלנו אָנָלִיזָה. החלטה זו הייתה יקרה במיוחד מענה לחששות בתחום סינרגיה על שחזור בעת שימוש סדרת דילול הכפול 12. לבסוף, assay שלנו הוא כמותי וגם יסefore נמדד דרגות של עיכוב. כתוצאה מכך, assay כבש את מכלול המידע מעכב, שבא לידי ביטוי isobolograms isocontour שבו isocontours להתחבר ריכוזים קומבינטורית עם רמות דומות של עיכוב צמיחה. 6 זה אסטרטגיה והתוויית מותרת להדמיה של עקומות קומבינטורית מנה-תגובה. כדי להמחיש המתודולוגיה שלנו, אנו מתארים הפרוטוקול שלנו לביצוע מבחנים אלה ולהציג תוצאות נציג.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. צמיחה התאית Real Time ו Assay Cytotoxicity Cell איקריוטיים

  1. תאי מארח הכנה (תאי J774A.1)
    1. תרבות J774A.1 תאי מקרופאג דמוי musculus Mus ההשעיה ב RPMI 1640 עם 9% נסיוב עגל-בתוספת ברזל. בתחילה מעבר צלוחיות בתרבית רקמה. לאחר התאים הפכו ומחוברות בבקבוק תרבות 75 ס"מ 2 רקמות 15 מ"ל של מדיום, לפצל על ידי גירוד ודילול ל -65 מ"ל עם אותו סוג של מדיום, מתוכם 15 מ"ל מוחזר אל הבקבוק בתרבית רקמה ו -50 מ"ל מועבר בבקבוק שייקר 250 מיליליטר חיידקים.
    2. עבור מדרוג כלפי מעלה, תרבות ההשעיה ב 250 מ"ל ו / או 1,000 צלוחיות חיידקי מ"ל מלא עד נפח חמישית עם המדיום בתרבית רקמה. לאוורר ידי קביעת מהירות סיבוב של כ 120 סיבובים לדקה. עבור צמיחה עקבית, לדגור בדיוק 5% CO 2 ו -37 מעלות צלזיוס.
    3. קציר תאים כאשר הם מגיעים צפיפות בטווח 2.5 x 10 6 תאים/ מ"ל עד 5 x 10 6 תאים / מ"ל. ודא אחוז תאים המת (רוב assayed בקלות על ידי מכתים הכחול trypan) אינו עולה על 25%, כפי תאים מתים יגדלו רעשי רקע מבחני רעילות.
    4. פלייט בלבן, תרבות שטופלו רקמות, 384 גם microplates ב 5 x 10 4 תאים J774A.1 במדיום בתרבית רקמה 30 μl לכל טוב. דגירה microplates לילה להשיג מפגש 90% ביום של הניסוי.
  2. פלורסנט הכנה או pneumophila הלגיונלה פלורסנט
    1. מעבר pneumophila L. (Lp02 :: flaA :: לוקס 8) חיידקים על המדיום המתאים, כלומר, תמצית שמרים פחם שנאגרו (BCYE) בינוני. אם אתה משתמש זן thymidine auxotrophic, להשלים בינוני עם 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​thymidine. כן כתמי חיידקים לניסויים על ידי הפצת אורגניזמים עבה בצלחת BCYE חדשה דוגר יום אחד (אם מתוך קטע צלחת קודם) או שניים עד שלושה ימים (אם ממלאים קפוא) להשיג ומחוברותצְמִיחָה.
      1. הכן צלחות BCYE ידי המסת תמצית שמרים 10 גרם, 10 גרם N - (2-acetamido) חומצה -2-aminoethanesulfonic, 0.35 גרם K 2 4 HPO, ואשלגן monobasic 1 גרם α-ketoglutarate ב 950 מ"ל מים deionized. התאם ל -6.9 pH עם הידרוקסיד אשלגן (≥2.5 מיליליטר של 11.9 פתרון טוחן).
      2. הוסף 15 אגר גרם ו פחם פעיל 2 גרם; ומביאים 1 L נפח סופי. הוספת בר ומערבבים מגנטי החיטוי. בינוני מצננים 55 ° C ולהוסיף פתרונות מעוקרות מסנן המכיל ציטראט 0.4 גרם L-ציסטאין 0.42 גרם אמוניום ברזל (III) מומס במים deionized. השתמשו בצלחת ומערבבים מגנט לערבב לפני שוטף צלחות פטרי.
      3. לבדיקה של צמיחה pneumophila ל במדיום הגידול axenic, להכין מרק ACES-תמצית שמרים (AYE) על ידי שילוב כל ריאגנטים כימיים המשמשים BCYE למעט פחם אגר. סנן לעקר להשתמש מיד, או להקפיא לניסויים מאוחר יותר.
    2. אורגניזמים Resuspend ב saהמדיום שלי בתרבית רקמה המשמש תאים J774A.1 עם 100 מיקרוגרם / תוספי thymidine מ"ל לפי העניין.
  3. זיהום macrophage
    1. להוסיף תרכובות בדיקה של עניין (תרכובות הקרנה, בקרות חיוביות ושליליות עבור עיכוב התפתחות חיידקי תמוגה תא אוקריוטים). רצוי, לפזר פתרונות המניה ב ≥500x DMSO (sulfoxide דימתיל) או בתמיסה מימית לאפשר דילול מספיק של הרכב.
      1. למרות פתרונות מניות ניתן לאחסן קפוא, להימנע להקפיא להפשיר מחזורים עבור תרכובות antimicrobials יציבות.
    2. לדלל חיידקים זורח למקד של 2.5 x 10 6 CFU (יחידת המושבה להרכיב) / m וחיידקים הכתב שכותרתו ניאון כדי 1.0 x 10 7 CFU / ml במדיום בתרבית רקמה ולהוסיף רעיל, קרום impermeant המתאים דיאלקטרי גרעין מחייב לצבוע בריכוז assay 2.5x הסופי.
    3. הוסף 20 μl של תערובת לכל תרבות J774A.1 היטב, נפח assay הסופי50 μl, ריכוז חיידקי הסופי 1 x 10 6 CFU / ml (כתב אופרון לוקס) או 4 x 10 10 6 CFU / ml (כתב חלבון פלואורסצנטי).
    4. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 1-3 ימים ב 5% CO 2 ב 100% לחות יחסית כדי למנוע תופעות קצה אוויר.
  4. assay Readout
    1. קרא התפתחות חיידקים רעילות לתא איקריוטיים על microplate luminometer ו fluorimeter בהתאם לכתבים בשימוש.
      1. כדי למנוע תופעות קצה הקשורים בטמפרטורה, תרמית לאזן microplates לפני קריאת הארה בהנפקה בשכבה אחת על ספסל במעבדה עם מכסים פתוחים למשך כ 20 דקות (או בתוך ארון בטיחות ביולוגי עם מכסים לסירוגין במשך כ 10 דק ').
    2. חזור microplates חממה אם הודעה בזמן האמת בנקודות זמן מאוחר יותר היא רצויה.

ניתוח 2. נתונים

  1. לנרמל את הנתונים כדי con החיובית והשליליתקבוצת ביקורת לחשב אחוזים או לקפל-עיכוב התפתחות חיידקים תאי cytotoxicity אחוזים עבור תאים איקריוטיים.
  2. כדי להעריך החוסן assay, לחשב הפרדה סטטיסטית בין בקרות חיוביות ושליליות הן עיכוב התפתחות חיידקים cytotoxicity באמצעות Z-factor (Z ') ניתוח כאשר Z' = 1 - 3 (σ p + σ n) / | מיקרון p + מיקרון n |. ב p המשוואה, σ זה σ n הם סטיות התקן עבור בארות שליטה חיוביות ושליליות, בהתאמה; μ p ו מיקרון n הם הערכים הממוצעים עבור בארות שליטה חיוביות ושליליות, בהתאמה.
    1. עבור מבחני תפוקה גבוהה הקרנה, לחשב z-ציוני תקן (או חלופה אחרת, מדידות סטטיסטיות כמוני) להערכת תופעות של תרכובות בדיקה של עניין. לחלופין, לחשב מתקפל הפחתה פשוטה או להתחבר פי הפחתה כמו פיזיולוגית פוטנציאל ליותר רלוונטי מידה של גודל אפקט לחיידקים משכפלים גיאומטרי.

3. יחיד ורב ממדית (כלומר, סינרגיה) מנה-תגובה פרשנות לבחינות נתונים

  1. הכן מקרופאגים וחיידקים כמתואר בסעיף בפרוטוקול 1.
  2. רק לפני הדבקה או דגירת axenic, להוסיף antimicrobials עניין ניסיוני הסדרה, הכפלת סדרת דילול, במטרה פורש על הקצה הגבוה ריכוז כי מבטל לחלוטין צמיחה (כלומר, ריכוז המעכבות המינימאלי או MIC) ועל נמוך בסופו של ריכוז כי לא מראה פעילות ברורה.
  3. השתמש במערכת טיפול נוזל אוטומטית כדי להקל מנת תגובה אחת והתקנת בדיקות סינרגיה קומבינטורית דרך בנוסף ישירים, אוטומטי של דילולים מיקרוביאלית על פי הפרוטוקול של היצרן.
  4. שקול שימוש דילולים הכפלת-משנה, למשל,841 / 54841eq1.jpg "/> - לקפל סדרת דילול, ו assay משכפל מנת לשפר את דיוק ואת שחזור של נתונים.
  5. עבור זיהום מקרופאג, לדלל חיידקים זורח למקד של 2.5 x 10 6 CFU (יחידת המושבה להרכיב) / מ"ל במדיום בתרבית רקמה. הוסף 20 μl של תערובת לכל תרבות J774A.1 היטב, נפח assay הסופי 50 μl, ריכוז חיידקי הסופי 1 x 10 6 CFU / ml; לדגור על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 ב -100% לחות יחסית.
    1. לבדיקת צמיחת axenic, לדלל חיידקים זורחים לריכוז סופי של 1 x 10 6 CFU / ml במדיום AYE, להוסיף 50 μl היטב בכל צלחת 384 גם לדגור על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 ב -100% לחות יחסית.
  6. חישוב מדד ריכוזיות מעכב שבר עבור שילובים מיקרוביאלית מעכבות התפתחות חיידקים. עבור כל תרופה בשילוב (a, b,.. N) מביא מלא או> 99% עיכוב של g חיידקיםrowth, לחשב את ריכוז מעכבות שבר הפרט (FIC a, b, n...) כדלקמן: FIC a = הריכוז מתחם "a" מחולק ריכוז המעכב המינימאלי של "a" בפני עצמו. . שימוש באותה נוסחה, לחשב ב FIC, וכו 'ואז לחשב את מדד FIC קומבינטורית או figure-protocol-1 FIC = FIC a + b + FIC. . N .FIC לכל צירוף מעכב.
    1. השתמש מדד קומבינטורית שחורג קליעה מ -1.0 להעריך סינרגיה. שקול וניתוק ≤0.5 כאינדיקציה שמרנית של אפקט סינרגיסטי ≥4, השפעה אנטגוניסט. 12
    2. מגרש isobolograms, isobolograms isocontour, ו / או isosurface isobolograms 6 ייצוגים גרפיים חלופי ליום תופעות קומבינטורית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

assay צמיחה התאי microplate

איור 1 דיאגרמות הצעדים assay. השלבים האוטומטיים לראות יכולים להתבצע באופן ידני. עם זאת, התפוקה היא הקל מאוד באמצעות מערכות טיפול נוזליות.

איור 2 מציג תוצאות נציג מתוך microplate 384 גם,-...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים מבחנים בזמן אמת עבור זיהוי סימולטני של התפתחות חיידקים תאית cytotoxicity תא מארח. ישנם מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול. ראשית, עבור ביצועים assay חזקים, חייבת להיעשות הפרדה ספקטרלי מספיק בין readouts חיידקים cytotoxicity. הפרדה כזו היא חלק מובנה עבור שילובים של כתבים אופרון בלוציפראז וצבעים-DNA מחייבת ניאון. עם זאת, על סמך הניסיון שלנו (לוח 1-3, איור 2), השימוש כפול, הודעת פלורסנט דורשת אותות ניאון שאינם חופפים (למשל, שימוש עיתונא...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר דיווח בכתב היד הזה נתמך על ידי המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות של המכונים הלאומיים לבריאות תחת מספר פרסי R01AI099122 כדי JEK התוכן הוא באחריות בלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של המכון הלאומי בְּרִיאוּת. ברצוננו להודות ג'ניפר סמית, הדוד וורובל, סו צ'יאנג, דאג מבול, שון ג'ונסטון, ג'ניפר רציונל, סטיוארט רודניצקי, פול יאן, ריצ'רד סיו, ורחל וורדן ממתקן הקרנת ICCB-Longwood ו / או מעבדת ההקרנה הארצית המרכזים האזוריים של ניו אינגלנד מצוינת להגנה מפני טרור ביולוגי ומתפתחים מחלות זיהומיות (נתמכות על ידי U54AI057159) על עזרת פיתוח וביצוע מבחני תפוקה גבוהה הקרנה. כמו כן, אנו רוצים להודות קנת פ סמית על הערות מועילות על כתב היד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תאי J774A.1אוסף תרבית מסוג אמריקאיTIB-67תא מארח
ACESSigma-AldrichA9758 להכנת תמצית שמרי פחם חומציים אגר ותמצית שמרים חומצה בינונית
תמצית שמרים, 210929 בקטון-דיקינסון/דיפקו אולטרה-מסונניםלהכנת תמצית שמרי פחם חומציים אגר ותמצית שמרים חומצית; דרגות נמוכות יותר עלולות לגרום לפגיעה בגדילה ו/או לשנות את הרגישות של לגיונלה למעכבי גדילה
חומצה אלפא-קטוגלוטרית, מלח מונופוטסיוםסיגמא-אולדריץ'K2000להכנת תמצית שמרי פחם חומציים אגר ותמצית שמרים חומציים בינונית
סודיום פירובטSigma-AldrichP5280להכנת תמצית שמרי פחם חומצית אגר ותמצית שמרים חומצה בינונית
אשלגן פוספט, dibasicThermo Fisher ScientificP288-500להכנת תמצית שמרי פחם חומצית אגר ותמצית שמרים חומצה
בינונית L-ציסטאיןSigma-AldrichC-7755להכנת תמצית שמרי פחם חומצית אגר ותמצית שמרים חומצה בינונית
אמוניום ברזל (III) ציטראטSigma-AldrichF5879להכנת תמצית שמרי פחם חומציים אגר ומדיום תמצית שמרים חומציים; ניתן להשתמש בפירופוספט ברזל במקום זאת אך קשה יותר לשקול במדויק
תמיסת אשלגן הידרוקסיד, מרוכזתThermo Fisher ScientificSP236-500להכנת תמצית שמרי פחם חומציים אגר ותמצית שמרים חומצה בינונית
מים נטולי שונייםN/AN/Aלהכנת תמצית שמרי פחם חומציים אגר ותמצית שמרים חומצה בינונית
תימידין (דרגת תרבית רקמות)Sigma-AldrichT1895להשלמת RPMI 1640 ותמצית שמרים חוצצת אגר/בינוני — ניתן להשתמש בתימידין בדרגה נמוכה יותר עבור האחרון, אך עלול לגרום לפגיעה בצמיחת תאים ו/או למוות תאים ב-RPMI 1640
RPMI 1640, ניסוח סטנדרטיCorning via Thermo Fisher Scientific10-040-CVלגידול תאי J774A.1 לפני הציפוי; כולל 2 מ"מ L-גלוטמין
RPMI 1640 חסר פנול אדוםקורנינג באמצעות Thermo Fisher Scientific17-105-CVלציפוי תאי J774A.1 ב-384 צלחות באר (לא מתאים לגידול לפני הציפוי); חסר גם L-גלוטמין ו-mdash; תוספת ל-2 מ"מ לפני השימוש
L-גלוטמין, 200 מ"מ ב-0.85% NaCl (דרגת תרבית רקמות)HyClone באמצעות Thermo Fisher ScientificSH30034.02להשלמת RPMI 1640 חסר L-גלוטמין, לריכוז סופי של 2 מ"מ
סרום עגל בתוספת ברזלGemini Bioproducts100-510להשלמת RPMI 1640, לריכוז סופי של 9.1%
תמיסת טריפן כחולSigma-AldrichT8154לצביעה לקביעת מוות תאים J774A.1 תוך ספירת צפיפות התאים
SYTOX Green, תמיסה של 5 מ"מ ב-DMSOThermo Fisher ScientificS7020לצביעה לקביעת מוות תאים J774A.1 על ידי קריאת פלואורסצנציה או מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי (בשילוב עם חיידקים פלואורסצנטיים כתומים-אדומים או אדומים רחוקים). יש להשתמש בריכוז סופי של 125 ננומטר.
חממת תרבית תאיםThermo Fisher Scientific13-255-26לדגירה של תאי J774A.1 (לפני ואחרי הדבקה); יכול לשמש גם לדגירה של חיידקים, או שניתן להשתמש בחממת אטמוספירה סטנדרטית במקום)
שייקר אורביטליBellCo Glass7744-01010לנער דגירה של תאי J774A.1 לפני הדבקה; מתאים לאינקובטור תרבית תאים; כולל בסיס שייקר 7744-01000 ומגש 7740-01010 (אלה זמינים גם בנפרד)
צלוחיות שייקר (250 מ"ל)ChemGlass Life SciencesCLS-2038-04לנערוע דגירה של תאי J774A.1 לפני הדבקה
מהדקי שייקר לצלוחיות (250 מ"ל)BellCo Glass7744-16250לטלטול דגירה של תאי J774A.1 לפני הדבקה
צלוחיות שייקר (1,000 מ"ל)ChemGlass Life SciencesCLS-2038-07לניעור דגירה של תאי J774A.1 לפני הדבקה
מהדקי שייקר לצלוחיות (1,000 מ"ל)BellCo Glass7744-16100לדגירה של תאי J774A.1 לפני הדבקה
מכסי קצף ספוג לצלוחיות (250 מ"ל-1,000 מ"ל)ChemGlass Life SciencesCLS-1490-038לדגירה מטלטלת של תאי J774A.1 לפני ההדבקה; מפחית את הסיכון לזיהום ביחס למכסי מתכת סטנדרטיים
MultiDrop Combi משאבה פריסטלטית רב-ערוצית הניתנת לתכנותThermo Fisher Scientific5840300להפצת תאי J774A.1, תרחיף בינוני וחיידקי המכיל פלואורופורים למספר רב של 384 כלי באר
סעפת קידוח סטנדרטית CombiThermo Fisher Scientific24072670נפח ברירת מחדל של 20 μ l אינו מספיק כדי לפצות על התיישבות — עלייה ל-80 μ l
לבן 384 כלים שטופלו היטב לתרבית רקמותקורנינג3570לקריאת זוהר ופלואורסצנטיות; קטלוג גריינר # 781080 נבדק גם בהצלחה
DMSO (דרגת תרבית רקמות, באמפולות אטומות)Sigma-AldrichD2650להמסת תרכובות בקרה ובדיקה חיוביות
AzithromycinSigma-AldrichPHR1088אנטיביוטיקה בקרה חיובית
Saponin (מקליפת Quillaja)Sigma-AldrichS-4521פיפטור
חיובי לבקרת ציטוקסיות רב-ערוציThermo Fisher ScientificFinnpipetteלהעברת כמויות קבועות של תרכובות בקרה חיוביות; הפיפטור חייב להיות בעל חלוקה דיגיטלית עם עצירות כדי לאפשר חלוקה חוזרת של נפח קבוע
רובוט העברת פיניםשל Epson Epson/ICCB-L(ציוד מותאם אישית)להעברת כמויות קבועות של תרכובות בדיקה ממערכי ספרייה
מערכת ניפוק דיגיטלית D300Hewlett-Packard באמצעות TecanD300להעברת כמויות משתנות של תרכובות בדיקה הנעות בין 11 פיקוליטר ל-10 ומיקרו; l
מחסניות T8+ למערכת חלוקה דיגיטלית D300Hewlett-Packard באמצעות TecanT8 +לחלוקת תרכובות בדיקה
מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי עם מצלמה דיגיטלית המחוברת למחשבNikonTiלהדמיית תאים חיים; כל מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטנדרטי יכול להחליף, בניגודיות פאזה או אופטיקה DIC, המסוגל לדמות ירוק (פלואורסצאין), כתום-אדום לאדום (טקסס אדום) ואדום רחוק (Cy5), עם שמן פי 100 מטרה לרזולוציה הגבוהה ביותר
כלי תרבית רקמה עם תחתית זכוכיתMatTek CorporationP35G-1.5-20-Cלהדמיית תאים חיים. צלחות כמו ה-MatTek מאפשרות הדמיה מיקרוסקופית בהגדלה של 600X או 1,000X באמצעות שימוש במיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי או קונפוקלי הפוך. כלים ספציפיים אלה הם בקוטר נומינלי של 3.5 ס"מ, קוטר פנימי של 3.3 ס"מ, עם החלקות כיסוי בעובי 20 מ"מ #1.5 המוכנסות לתחתית.
ניתן להשתמש בפוטושופ CS6ב-Adobe, בפוטושופ או בתוכנות דומות כדי למזג תמונות בהיר, מיקרוסקופיות ופלואורסצנטיות.
Mathematica 10Wolfamליצירת איזובלוגרמות איזוקונטור דו-ממדיות ואיזובולוגרמות פני שטח תלת מימדיות.
,

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Garzoni, C., Kelley, W. L. Staphylococcus aureus: new evidence for intracellular persistence. Trends Microbiol. 17 (2), 59-65 (2009).
  2. Rosen, D. A., et al. Utilization of an intracellular bacterial community pathway in Klebsiella pneumoniae urinary tract infection and the effects of FimK on type 1 pilus expression. Infect Immun. 76 (7), 3337-3345 (2008).
  3. Blango, M. G., Mulvey, M. A. Persistence of uropathogenic Escherichia coli in the face of multiple antibiotics. Antimicrob Agents Chemother. 54 (5), 1855-1863 (2010).
  4. Chiaraviglio, L., Kirby, J. E. Evaluation of impermeant, DNA-binding dye fluorescence as a real-time readout of eukaryotic cell toxicity in a high throughput screening format. Assay Drug Dev Technol. 12 (4), 219-228 (2014).
  5. Edelstein, P. H. Antimicrobial chemotherapy for legionnaires' disease: a review. Clin Infect Dis. 21 Suppl 3, S265-S276 (1995).
  6. Chiaraviglio, L., Kirby, J. E. High-Throughput Intracellular Antimicrobial Susceptibility Testing of Legionella pneumophila. Antimicrob Agents Chemother. 59 (12), 7517-7529 (2015).
  7. Pedro-Botet, L., Yu, V. L. Legionella: macrolides or quinolones? Clin Microbiol Infect. 12 Suppl 3, 25-30 (2006).
  8. Coers, J., Vance, R. E., Fontana, M. F., Dietrich, W. F. Restriction of Legionella pneumophila growth in macrophages requires the concerted action of cytokine and Naip5/Ipaf signalling pathways. Cell Microbiol. 9 (10), 2344-2357 (2007).
  9. Chu, J., et al. Non-invasive intravital imaging of cellular differentiation with a bright red-excitable fluorescent protein. Nat Methods. 11 (5), 572-578 (2014).
  10. Eliopoulos, G. M., Moellering, R. C. Ch. 9. Antimicrobial combinations. In: Antibiotics in Laboratory Medicin. Lorian, V. , Williams and Wilkins. 330-396 (1996).
  11. Jones, R. E., Zheng, W., McKew, J. C., Chen, C. Z. An alternative direct compound dispensing method using the HP D300 digital dispenser. J Lab Autom. 18 (5), 367-374 (2013).
  12. Odds, F. C. Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them. J Antimicrob Chemother. 52 (1), (2003).
  13. Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat Biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).
  14. Lam, A. J., et al. Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins. Nat Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).
  15. Berger, K. H., Merriam, J. J., Isberg, R. R. Altered intracellular targeting properties associated with mutations in the Legionella pneumophila dotA gene. Mol Microbiol. 14 (4), 809-822 (1994).
  16. Berger, K. H., Isberg, R. R. Two distinct defects in intracellular growth complemented by a single genetic locus in Legionella pneumophila. Mol Microbiol. 7 (1), 7-19 (1993).
  17. Vogel, J. P., Isberg, R. R. Cell biology of Legionella pneumophila. Curr Opin Microbiol. 2 (1), 30-34 (1999).
  18. Kirby, J. E., Isberg, R. R. Legionnaires' disease: the pore macrophage and the legion of terror within. Trends Microbiol. 6 (7), 256-258 (1998).
  19. Kirby, J. E., Vogel, J. P., Andrews, H. L., Isberg, R. R. Evidence for pore-forming ability by Legionella pneumophila. Mol Microbiol. 27 (2), 323-336 (1998).
  20. Vogel, J. P., Andrews, H. L., Wong, S. K., Isberg, R. R. Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila. Science. 279 (5352), 873-876 (1998).
  21. Song, H., Fares, M., Maguire, K. R., Sidén, A., Potácová, Z. Cytotoxic Effects of Tetracycline Analogues (Doxycycline, Minocycline and COL-3) in Acute Myeloid Leukemia HL-60 Cells. PLoS ONE. 9 (12), e114457(2014).
  22. Isberg, R. R., Falkow, S. A single genetic locus encoded by Yersinia pseudotuberculosis permits invasion of cultured animal cells by Escherichia coli K-12. Nature. 317 (6034), 262-264 (1985).
  23. Niles, A. L., Moravec, R. A., Riss, T. L. Update on in vitro cytotoxicity assays for drug development. Expert Opin Drug Discov. 3 (6), 655-669 (2008).
  24. Niles, A. L., Moravec, R. A., Riss, T. L. In vitro viability and cytotoxicity testing and same-well multi-parametric combinations for high throughput screening. Curr Chem Genomics. 3, 33-41 (2009).
  25. Mayr, L. M., Bojanic, D. Novel trends in high-throughput screening. Curr Opin Pharmacol. 9 (5), 580-588 (2009).
  26. Dunlap, P. Biochemistry and genetics of bacterial bioluminescence. Bioluminescence: Fundamentals and Applications in Biotechnology - Volume 1. Thouand, G., Marks, R. 1, Springer. 37-64 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Lux

מאמרים קשורים