הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ביטוי גנים תא בודד באמצעות Multiplex RT-qPCR לאפיון הטרוגניות של אוכלוסיות הלימפה נדירים

10.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54858

⸱

19 בינואר 2017

 ,  ,  ,  , 
1Unit for Lymphopoieseis, Immunology Department, INSERM U1223, University Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, Cellule Pasteur, Institut Pasteur, 2Center for Translational Science, Institut Pasteur, INSERM UMS20

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר כיצד להעריך את הביטוי של מגוון רחב של גנים ברמה המשובטת. RT-qPCR מתחיל מתא בודד מייצר תוצאות אמינות ביותר עם רגישות חזקה במשך מאות דגימות וגנים.

תקציר

ההטרוגניות התבטאות גנים היא סממן מעניין שמן הראוי לחקור באוכלוסיות הלימפה. התבטאות גנים בתאים אלה משתנה במהלך תא ההפעלה, מתח, או גירוי. ביטוי גנים זמנית מתא בודד מאפשר הערכה סימולטני של עשרות 1 גנים, 2, 3. ברמה מתא בודד, ביטוי גנים זמנית קובע האוכלוסייה ההטרוגניות 4, 5. היא מאפשרת את ההבחנה של ההטרוגניות אוכלוסייה על ידי קביעה הוא התמהיל הסביר של שלבי מבשר מגוונים בין תאי בוגרים וגם המגוון של תגובות תא לגירויים.

תאי הלימפה מולדים (ILC) תוארו לאחרונה כאוכלוסייה של effectors מולד של התגובה החיסונית 6, 7. בפרוטוקול זה, ההטרוגניות התא של הוא ILCתא patic נחקר במהלך הומאוסטזיס.

נכון לעכשיו, את הטכניקה הנפוצה ביותר להעריך ביטוי גנים היא RT-qPCR. ביטוי גני אמצעי שיטה זו רק גן אחד בכל פעם. בנוסף, שיטה זו אינה יכולה להעריך ההטרוגניות של ביטוי גנים, מאז מספר תאים נדרשים עבור מבחן אחד. זה מוביל את המדידה של ביטוי גנים הממוצע של האוכלוסייה. בהערכת מספר גדול של גנים, RT-qPCR הופך הזמן-, reagent-, ושיטת רב-המדגם. לפיכך, את יחסי הגומלין להגביל את מספר גנים או אוכלוסיות תאים כי ניתן להעריך, מעלה את הסיכון של חסר בתמונה הגלובלית.

כתב יד זה מתאר כיצד זמנית תא בודד RT-qPCR ניתן להשתמש כדי להתגבר על המגבלות האלה. טכניקה זו נהנתה התקדמות טכנולוגית מיקרופלואידיקה האחרונה 1, 2. תגובות המתרחשות זמנית שבבי RT-qPCR לא EXCeed ברמת nanoliter. לפיכך, ביטוי גני תא בודד, כמו גם ביטוי גנים מרובה בו זמנית, ניתן לבצע בתוך reagent-, sample-, ואופן חסכוני. אפשר לבדוק ההטרוגניות חתימת גן התא ברמה המשובטת בין תת תא בתוך אוכלוסייה בשלבי התפתחותיים שונים או בתנאים שונים 4, 5. עבודה על אוכלוסיות נדירות עם מספר גדול של תנאים ברמה מהתא הבודד הוא כבר לא מגבלה.

מבוא

במהלך השנים האחרונות, תאי הלימפה מולד (ILCs) נחקרו יותר ויותר. למרות חוסר קולטנים אנטיגן ספציפי, הם שייכים שושלת הלימפה ולייצג זקיפים חשובים הומאוסטזיס לרקמות ודלקת. ILCs כיום מחולקים לשלוש קבוצות על בסיס הביטוי שלהם שילובים גורם שעתוק ספציפיים על יכולתם לייצר ציטוקינים 6, 7.

ILCs מובילים למצבים ההומיאוסטטית ו pathophysiological רבים באיברים מגוונים באמצעות ציטוקינים ספציפיים ייצור 8, 9. כדי להיות מסוגל להבין את התפקיד של תאים אלה, חשוב לקבוע את תת-אוכלוסיות ILC השונות לכל איבר ולזהות קשרי ההתפתחות שלהם. בנוסף, תופעות של פלסטיות בין תת השונים נקשרו. על ידי לימוד הטרוגניותשל תאים הנמצאים איבר אחד, אפשר לתחום הבמה של התבגרות שלהם להבחין הפונקציות הספציפיות שלהם.

כדי להמחיש את הטכניקה של תא בודד זמנית RT-qPCR, ILCs הכבד נבחר, עם דגש מיוחד על ההטרוגניות שלהם בתוך אותה קבוצת ILC (סוג 1 ILC) 10. ראשית, באמצעות שימוש cytometry זרימה, שלוש אוכלוסיות ILC ברורים התאפיינו בכבד. הקבוצה 1 ILC מייצג כ 80% של effectors הטבעי תוך שתי האוכלוסיות האחרות הן אוכלוסיות ILC כבדות נדירות (פחות מ -5% של effectors המולדת). אלה אוכלוסיות מוינו באמצעות סמנים על פני קרום התא ביטוי נרחב של אוכלוסיות ILC. כתוצאה מכך, מסודר אוכלוסיות ILC בכבד להסתכל אחד דומה במידה רבה אחר.

זמנית מתא בודד RT-qPCR התפתחה אחת הטכניקות הטובות ביותר כדי לחקור את ההטרוגניות ללא דיחוי על אוכלוסיות אלה 11 . שני מאפיינים עיקריים נקבעים על ידי ניצול של טכניקת תא הבודד זמנית RT-qPCR. ראשית, על ידי הסתכלות על רמת המשובטים, אפשר לשחזר ביטוי גנים תא ספציפי להשוואה בין תאים שכנראה להציג שלבי ההתפתחות דומה. לאחר מכן, ע"י הסתכלות שילוב שנבחר מראש של ביטוי גנים, נוכל לקבוע חתימות גן חדשות המבוססת על דפוסי ביטוי גנים בו זמנית בנקודת זמן אחת. היבטים אלה מאפשרים גביית מגוון רחב של נתונים הביטוי עבור מספר גדול של תאים, אפילו על אוכלוסיות נדירות, מאז הטכניקה מבוצעת ברמה המשובטת. ובכך, ההטרוגניות ILC בכבד ניתן להעריך כראוי.

לאחר מכן, על ידי מיון כל התאים עם פנוטיפ עולמי ILC, סקירה רחבה של הביטוי המרובה הגן של האוכלוסיות הכבדות ILC מתקבלת, למרות שהם מייצגים אוכלוסיות נדירות ביותר. שבב מבוסס microfluidic מאפשר התנסות אפילוכמות קטנה של חומר תא. כתוצאה מכך, פרופילי ביטוי גנים של אוכלוסיות תאים נדירות ניתן להשיג. באמצעות תוכנת ניתוח חתימת הגן באינטרנט, אשכולות אוכלוסיית תאים ומערכות יחסים תא פוטנציאליים יכולים להיחקר. כתוצאה מכך, ניתן לבצע בדיקות פונקציונליות כדי לאמת את נתוני אשכולות ברמת vivo.

עשרות ביטויי גנים ניתן להעריך בו זמנית על מאה או תאים בודדים יותר על אותו השבב 3, 11, 12. עיצוב של assay הוא החלק הארוך ביותר והחשוב ביותר של הניסוי. הקביעה של הגנים הרלוונטיים להשערה להיבדק היא בעל חשיבות עליונה כדי לקבל תוצאות רלוונטיות. שנית, בקרה פנימית (כגון משטח סמנים ידועים הנמצאים בשימוש למיון) ובקרות ספציפיות נדרשות. זה חיוני כדי לבדוק את הספציפיות הגברת פריימר, את היעילות של ההגברה, ו- Tהוא היעדר תחרות פריימר. לכן, עבודה עם רב מפלסי תא בודד RT-qPCR היא טכניקה חיסכון בזמן, כביטוי-גן המרובה של תא נבחן בעת ​​ובעונה האחת.

שימוש באותו שבב ותמהיל ריאגנטים עבור כל התאים מגביל את השגיאות האפשריות של מניפולציה ומאפשר שחזור בין דגימות. בסך הכל, את ההיבטים השונים של תא בודד זמנית RT-qPCR מאפשרים לייצור תוצאות האמינות ביותר ברמה המשובטת, עם רמה גדולה של רגישות למגוון רחב של דוגמאות וגנים. התוצאות שהתקבלו להציע נתונים חזקים ויציבים לבדיקות biostatistical.

זו יכולה להיות מושגת בשל היבט microfluidic של השיטה, המאפשרת עבודה על כמויות קטנות מאוד של חומר ומובילה לתוצאות ממצות. לבסוף, בעזרת תוכנה באופן מקוון, אפשר להשוות את האוכלוסיות הרצויות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הניסויים בבעלי חיים אושרו של ידי הוועדה לבטיחות מכון פסטר בהתאם משרד החקלאות הצרפתי ואת הנחיות האיחוד האירופי.

1. הכינו צלחת אחת תאים מיון היטב 96

  1. הכינו תערובת טרום הגברה צינור 1.5 מ"ל על ידי הוספת 5.0 μl של חיץ רטרו-שעתוק ספציפיים, 1.3 μl של חומצה ethylenediaminetetraacetic נמוך (EDTA) TE חיץ (10 פתרון מ"מ TE, pH 8, ו -0.1 פתרון mM EDTA; 0.2 מיקרומטר מסוננים ), ו -0.2 μl של היטב לכל פולימראז תקי DNA (איור 1 א).
  2. על צלחת 96-היטב, להפיץ 6.5 μl של תמהיל מראש הגברה בכל טוב (עד 48 בארות). צלחת זו היא צלחת מיון תא בודד 96-היטב.
    הערה: בעזרת פיפטה אלקטרונית מומלצת עבור פרוטוקול זה. היא מאפשרת מדידות נפח מדויקות לשחזור וחוסכת זמן.

figure-protocol-1
(א) על התא הבודד היטב 96 מיון צלחת, תמהיל ההגברה מראש מופץ תחילה, ואחריו תערובת assay 0.2X. (ב) השיא של כל עמדה חד-תאיים צריך להישמר על גיליון אלקטרוני. באר בלי תא נקרא גם "לא קלט" והוא יכול לשמש כביקורת. שתי שורות ניתן לחסוך לשלוט יעילות פריימר בדילול cDNA (רציפים אחד מכל עשרה דילולים מ סכום השווה ל -10 5 תאים לתא אחד). (ג) על צלחת assay 96-היטב, מגיב טעינת assay מופץ תחילה, ואחריו התוספת של פריימרים. אל תשכחו לשמור על פריסה של כל עמדת פריימר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

  1. להכין תערובת assay 0.2X צינור 1.5 מ"ל על ידי הוספת 1.4 μl של כל צבע יסוד (פריימרים 20x; עד 48 בדיקות שונות; ראו טבלה 1). התאם את הנפח הסופי 140 μl עם חיץ EDTA TE נמוך.
  2. הפץ 2.5 μl של תמהיל assay 0.2X ל -48 בארות בצלחת 96-גם תא בודד מיון המכיל תמהיל הגברה מראש.
    הערה: ההיקף הסופי בכל טוב של צלחת מדגם 96-גם צריך להיות 9 μl.
  3. חותם את הצלחת עם סרט כיסוי. וורטקס הצלחת ומסובב אותו ב 280 XG במשך 45 שניות. אחסן את צלחת תא בודד מיון 96-היטב ב -20 ° C או להשתמש בו באופן מיידי.

2. דיסוציאציה תא יחיד

  1. באמצעות מערכת המסירה CO 2, להרדים עכבר ידי היפוקסיה. תקן את העכבר על צלחת לנתיחה ולפתוח את חלל הצפק longitudinally באמצעות מספריים.
  2. שחזור ILCs מהכבד.
    1. לפני הבידוד כבד, לרוקן את ליבאה-תאי.
      1. כדי להבליט את וריד השער, להזיז את קטן המעי הגס אל הצד השמאלי של העכבר; וריד השער מופיע הווריד הגדול חלל הצפק.
      2. עם מזרק 10 מ"ל ומחט 0.45 מ"מ, לשטוף את הכבד עם המדיום שנאגרו מלוחים פוספט (PBS) דרך וריד השער. כדי להקל על שטיפה כבדה, לחתוך את עורק הקיבה במספריים.
      3. כדי להסיר את כיס המרה, לצבוט את הבסיס של כיס המרה עם מלקחיים ולהפריד אותו מהכבד במספריים.
      4. כדי לבודד את הכבד, לצבוט את לבסיס הכבד עם מלקחיים, באמצעות מספריים, להפריד את הכבד משאר חלל הצפק.
      5. מעבירים את הכבד בתוך שפופרת פוטר עם 5 מ"ל של מדיום מכון הזיכרון רוזוול פארק (RPMI) 2% נסיוב עגל עוברית (FCS).
  3. לנתק את הכבד עם דיסוציאציה מכונאי באמצעות עלי. מעבירים את המדיום לצינור 15 מ"ל. תביא את הנפח הכוללעד 14 מ"ל עם 2% FCS RPMI. השאירו את ההשעיה התא על קרח למשך 15-20 דקות כדי למזוג את hepatocytes.
  4. שחזור supernatant (ללא hepatocytes) בצינור חדש 15 מ"ל בעזרת פיפטה 1 מ"ל (12 מ"ל של supernatant ניתן לצפות). ספין למטה ב 120 XG במשך 7 דקות ב 10 מעלות צלזיוס. בטל supernatant לאחר צנטריפוגה.
  5. Resuspend גלולה שהושגו בשלב 2.4 ב 14 מ"ל של מדיום שיפוע צפיפות (למשל, Percoll 40%). ספין למטה ב 600 XG במשך 20 דקות ב 20 מעלות צלזיוס. הסר את supernatant על ידי שאיפה.
  6. Resuspend גלולה ב 1 מ"ל של אצטט אשלגן (ACK). השאירו בטמפרטורת החדר למשך 1 דקה. לאחר 1 דקות, ולהביא את הנפח הכולל עד 14 מיליליטר עם הפתרון המלוח המאוזן של האנק (HBSS) 2% FCS. ספין למטה ב 120 XG במשך 7 דקות ב 10 מעלות צלזיוס. בטל supernatant.
  7. כתם התאים.
    1. Resuspend גלולה ב 300 μl של תערובת נוגדנים biotinylated (ראה לוח חומרים, מוסיפים את כל הנוגדנים biotinylated להזכירed) ולהעביר את התאים ב 1.5 מ"ל צינור. תשאיר את זה בחושך במשך 20 דקות ב 4 ° C.
    2. תביאו את הנפח הכולל עד 1 מ"ל עם FCS% 2 HBSS. ספין למטה ב 120 XG במשך 7 דקות ב 10 מעלות צלזיוס. Resuspend גלולה ב 300 μl של תערובת נוגדנים מצמידים fluorochrome ו streptavidin מצומדות fluorochrome (ראה לוח חומרים, מוסיפים את כל הנוגדנים fluorochrome מצמידים ציינו). תשאיר את זה בחושך במשך 20 דקות ב 4 ° C.
  8. תביאו את הנפח הכולל עד 1 מ"ל עם FCS% 2 HBSS. ספין למטה ב 120 XG במשך 7 דקות ב 10 מעלות צלזיוס. הסר את supernatant בעזרת פיפטה 1 מ"ל. Resuspend גלולה ב 1 מ"ל יודיד HBSS ו propidium (Pi; 1: 4,000).
    הערה: בעת שימוש סמנים על פני קרום התא ILC ביטוי נרחב, 3 אוכלוסיות מוגדרות: NKp46 + IL-7Rα -, NKp46 + IL-7Rα +, ו NKp46 - IL-7Rα +. כל האוכלוסיות מסודרות שושלת - CD3 - CD4 - CD45.2 +.

3. תא בודד מופעל קרינת מיון תאים (FACS)

  1. השתמש FACS למיין תאים בודדים 13.
    הערה: סוגי תאים שונים ניתן למיין על אותו 96-גם תא בודד מיון צלחת (איור 2).
    1. השתמש FACS למיין תא אחד לכל היטב המכיל תמהיל assay 0.2X ותמהיל מראש הגברה על צלחת מיון 96-גם תא בודד. השתמש בצלחת חד-תאיים מיון 96-גם מוכן טרי או להמיס אותו אם מאוחסן ב -20 ° C.
      1. שם צלחת 96-גם אטום על בעל צלחת FACS. השתמש צלחת 96-היטב ריקה כמבחן. מקמו את צלחת עם A1 היטב מצד שמאל לעבר הנסיין.
      2. התאם את בעל הצלחת להשיג ירידה במרכז הבאר-A1 עם חרוזי אימות.
      3. חזור על שלב 3.1.1.2 עם כל בארות קו A.
      4. הסר את החותם מצלחת 96-היטב ולמיין 100 חרוזי אימות לכל טוב. בדוק דהיווצרות ROP במרכז הבארות.
      5. כאשר מכוונים כראוי, למקם את 96-גם תא בודד המיון הצליח על בעל הצלחת. צייר את הצלחת הפריסה ולמיין 1 תא לכל טוב.
        הערה: מיקום נכון של כל תא על צלחת מיון תא בודד 96-היטב היא חיונית. פריסת צלחת צריך להישמר על תוכנת גיליון אלקטרוני. פריסת הצלחת תשמש את הצעדים הבאים (איור 1b) 14. השאר תערובת assay 0.2X אחד היטב המכילה ותמהיל מראש הגברה על צלחת מדגם 96-גם ללא תאים. גם זה משמש כביקורת לא קלט. השאר שתי שורות של 6 בארות דילול cDNA. בארות אלה משמשות כקבוצת ביקורת על יעילות פריימר (איור 1b).
      6. אחסן את צלחת תא בודד מיון 96-היטב ב -20 ° C או להשתמש בו באופן מיידי.

4. טרום הגברה

  1. השתמש OBT צלחת מיון טרי או מופשר 96-גם תא בודדained בשלב 3.1.1.6. וורטקס הצלחת ומסובב אותו (280 XG במשך 45 שניות).
  2. מניחים את הצלחת מיון תא בודד 96-היטב על thermocycler. בצע שעתוק לאחור ו-הגברה מראש על פי התכנית ציינה באיור 3 ולוח 2.

figure-protocol-2
איור 3: תוכנית קדם הגברה. על מנת לקבל מספיק חומר, טרום הגברה של גני מטרה ספציפית על תאים בודדים מיון נדרש. צלחת מיון תא בודד 96-גם נטען על thermocycler לבצע את המכינה הקדם-הגברה. המוצרים מראש הגברה מדוללים אז עם חיץ נמוך EDTA TE וניתן להשתמש בו מיד או קפוא ב -20 מעלות צלזיוס. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

  1. לדלל את המגבר מראשlified דגימות על ידי הוספת 36 μl של חיץ נמוך EDTA TE לבאר כל אחד.
  2. חותם את הצלחת עם סרט כיסוי. וורטקס הצלחת ומסובב אותו (280 גרם במשך 45 שניות). אחסן את הצלחת מיון מראש מוגבר, 96-גם תא בודד ב -20 ° C או להשתמש בו באופן מיידי.

5. הכינו צלחת מדגם 96-היטב

  1. הכן 191 μl של תמהיל מאסטר על ידי הוספת 175 μl של תמהיל מאסטר qPCR ו -17.5 μl של מגיב טעינת המדגם.
  2. על צלחת 96-באר חדשה, להפיץ 3.6 μl של תמהיל מאסטר בכל טוב (עד 48 בארות). זהו צלחת מדגם 96-היטב.
  3. עבר 2.9 μl של cDNA מראש מוגבר מצלחת המדגם 96-גם צלחת 96-הבאר החדשה. שמור באותה תנוחה במשך כל דגימה בין צלחת מיון 96-תא בודד ואת צלחת מדגם 96-היטב.
  4. חותם את הצלחת עם סרט כיסוי. וורטקס הצלחת ומסובב אותו (280 XG במשך 45 שניות). מניחים את צלחת 96-באר חדשה על הקרח מוגן מפני אור. אחסן את s 96-היטבצלחת בשפע ב -20 ° C או להשתמש בו באופן מיידי.

6. הכינו צלחת Assay 96-היטב

  1. על צלחת 96-באר חדשה, להפיץ 3 μl של מגיב טעינת assay בכל טוב (עד 48 בארות). צלחת זו נקראת הצלחת assay 96-היטב.
  2. הוסף 3 μl של פריימרים היטב כל אחד. שמור פריסה על תוכנת גיליון אלקטרוני (איור 1 ג 'ולוח 1; להשתמש בכל פריימרים המפורטים בטבלה 1). המיצוב הנכון של כל צבע יסוד על צלחת assay 96-גם הוא חיוני עבור השלבים הבאים.
    1. אם מספר דגימות מתחת 48, להוסיף מים במקום פריימרים לבארות בשימוש.
  3. חותם את הצלחת עם סרט כיסוי. וורטקס הצלחת ומסובב אותו (280 XG במשך 45 שניות). אחסן את הצלחת assay 96-היטב ב -20 ° C או להשתמש בו באופן מיידי.
    הערה: כדי למנוע קפיאה חוזרת פשרה של פריימרים, להפיץ את פריימרים עבור לערבב מראש ההגברה עבור 96-welצלחת assay l בעת ובעונה אחת.

צ'יפ ג'ין-ביטוי מתא בודד 7.

  1. מניחים את מעגל microfluidic משולב (IFC) על הספסל ולבדוק השסתומים באמצעות מזרק עטוף. פתח את המזרק, למקם אותו בניצב השסתום, ולחץ בחוזקה. O-Ring צריך לזוז. מלאו את השבב עם נוזל פקד הקו (0.3 מ"ל של טוברקולין).
  2. חזור על שלב 7.1 עם השסתום השני.
    הערה: אין נוזל צריך להישפך על השבב.
  3. הסר את הסרט הכחול מלמטה של ​​השבב. טען את השבב לתוך בקר IFC. במסך הבקר IFC, בחר "PRIME" ולאחר מכן "הפעלה". הפיקוח על קווי microfluidic להימשך 10 דקות.
  4. הוצא את השבב מחדש לאטום את הסרט הכחול על החלק התחתון של השבב.

figure-protocol-3
איור 4: טעינת שבב זמנית מתא בודד גן ביטוי. צעדים אלה דורשים gדיוק reat, במיוחד במהלך ההעברה של צלחת 96-היטב על שבב גנטי ביטוי זמנית תא בודד. כדי למנוע טעינת שגיאות misplacements, מומלץ מאוד לעבוד ברצף. ההיקף לקח עבור כל העברה צריך להיות מבוקר במהלך תהליך pipetting. לבסוף, חשוב להימנע מכל בועות כדי להסיר אותם במקרה של היווצרות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

  1. בעזרת פיפטה 8 ערוצים, העברת 5 μl מהצלחת assay 96-היטב בצד A1 (צד שמאל) של השבב. מלאו את אגף שמאל של השבב, כמצוין באיור 4. היזהר תמיד לצייר אותו הנפח לתוך הטיפים.
    1. אין ליצור בועות. אם יופיעו בועות, להסיר אותם באמצעות 10 טיפים μl. טיפי שינוי עבור כל טוב של השבב.
  2. חזור על שלב 7.5 על o בצד ימיןf השבב באמצעות 5 μl מהצלחת מדגם 96-היטב.
  3. הסר את הסרט הכחול מלמטה של ​​השבב. טען את השבב לתוך בקר IFC. במסך בקר IFC, בחר "רץ סקריפט" ולאחר מכן "הפעלה". העמסת קווי microfluidic נמשכת 45 דקות.
  4. הוצא את השבב מחדש לאטום את הסרט הכחול על החלק התחתון של השבב.

8. הפעל את צ'יפ

  1. במחשב qPCR microfluidic, בחר בתוכנה "איסוף נתונים". ברגע שזה מתחיל, בחר "חדש הפעלה."
  2. בחר "הוצאתי," הסיר את הסרט הכחול מהעומק של השבב, ולטעון את השבב. מניחים את שבב כדי לקבל את A1 היטב מצד שמאל לעבר הנסיין.
  3. על "הגדרת פרויקט," לבחור "אף אחד" ולאחר מכן "הבא."
  4. בחר באפשרות "הפעל שבב חדש," "מדריך שבב חדש" (ליצור תיקייה לצורך הניסוי), ו "באה."
  5. על "התבטאות גנים" לבחור "; פסיבי התייחסות = רוקס "(carboxy-x-rhodamine) ו" בדיקה בודדת; "בחר את הפילטר הנכון על פי פריימרים בחר." הבא ".
  6. בחר "עיון" ובחרו את התוכנית הנכונה על פי פריימרים בשימוש.
    הערה: "ברירה-10min-Hotstart.pcl" היא התכנית הנפוצה ביותר עבור תא בודד זמנית RT-qPCR.
  7. בחר "התחל הפעלה". התגובה לוקחת כ 90 דקות.
  8. לאחר שסיים, בחר "הוצא-בוצע."

ניתוח 9. נתונים

  1. פתח את תוכנת "Real-Time PCR ניתוח", בחר "קובץ" ו "פתח," למצוא את תיקיית הניסוי, ובחר "קובץ ChipRun.bml."
  2. לחץ על "ניתוח צפה", "לוח תוצאות," ו "תצוגת מפה חומה;" תיבות מסומנות "X" הם מתחת לרמת זיהוי הסף ו / או היו עקומות הגברה רעות.
  3. שם הדגימות. יש להקליק על "הגדרת דוגמה" ו select "ניו SBS 96." לחץ על "מיפוי" ובחר "..." העתק והדבק את פריסת תכנון המדגם מתוך תוכנת גיליון אלקטרוני. הגדר את הפריסה הודבקה כמו "שם לדוגמא."
  4. שם המבחנים. חזור על שלב 9.3 עם שמות פריימר "הגדרת גלאי." הגדר את הפריסה הודבקה כמו "גלאי שם."
  5. לחץ על "צג ניתוח" ו- "ניתוח;" שמות מדגם פריימר ייוחס אוטומטית דגימות פריימרים (איור 7).
  6. חישוב ה- CT, דלתא Ct, ומקפלים שינוי עבור כל דגימה. השתמש גן משק בקרה פנימית (כאן, GAPDH):
    ΔCt = מדגם CT - בקרה פנימית Ct
    מקפלים שינוי = 2 - (שליטה ΔCtsample-ΔCtnegative)
    1. לחץ על "הגדרת גלאי" ובחר הבאר ללא שליטה קלט (השתמש גן משק בקרה פנימית לנרמל ביטוי גנים). בחר "Editor, "" להגדיר התייחסות ", ו" עדכון ".
    2. בחר את כל הבארות אשר בבקרה הפנימית-שהוגדר לעיל תיושם. בחר "עורך" ו "מגדיר מבחן." בחר גן התייחסות מתאים ולחץ על "עדכן".
    3. בחר "הגדרת דוגמה" כדי לבחור את הביקורת השלילית היטב. בחר "עורך" ולהגדיר "הפניה". לחץ על "עדכן".
    4. בחר באפשרות "תצוגה ניתוח" ו- "ניתוח;" דלתא CT ו- מקפל שינוי יחושבו אוטומטית.
  7. לייצא את הנתונים. בחר "קובץ" ו "ייצוא, שמירה בשם" תוצאות טבלה ", בחר את תיקיית היעד, ופגע" שמור "ו" יציאה ".
  8. חזור על שלב 9.7, אבל במקום "תוצאות שולחן," שמירה בשם "תוצאות HEATMAP."

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

אוכלוסיות הלימפה להציג מגוון גדול בביטוי גנים. בפרוטוקול זה, ההטרוגניות תא כבד ILC נחקרו באמצעות ביטוי גני תא בודד זמנית RT-qPCR. שלא כמו טכניקות ביטוי גנים אחרים, רב מפלסי תא בודד ביטוי גנים RT-qPCR מאפשר עבודה על אוכלוסיות שונות, אפילו הנדירים, בעת ובעונה אחת. סגולי זה, יחד עם רגישות גבוהה ברמה המשובטת, מאפשר לחקירת הבדלי חתימות גנים בתוך אוכלוסייה ובין אוכלוסיות נדירות. כדוגמא, את חתימות הגן של 3 אוכלוסיות ILC מן הכבדים של עכברים בן 4 שבועות הוע...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול זה מתאר כיצד להשיג מידע ביטוי גנים ממצה ברמה המשובטת. הנה, חקרנו ההטרוגניות תא כבדות ILC. לאחר מיון תא הבודד של אוכלוסיות ILC שונות (המבוססות על משטח סמני ILC ביטוי נרחב), דגימות מראש מוגברות עבור גנים שנבחרו מראש ספציפיים. לאחר מכן, cDNA ו פריימרים השיג הועמסו על גבי שבב microfluidic זמנית RT-qPCR. לבסוף, השגנו את הביטוי של 48 גנים שונים מ -48 תאים בודדים. תוצאות התבטאות גנים נותחו באמצעות תוכנה באינטרנט כדי לחקור מערכות יחסי אוכלוסיית חתימה ותא גנים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מכון פסטר, INSERM, אוניברסיטת פריז דידרו ומשרד המחקר (לדרום קרוליינה); האגודה למחקר על הסרטן (לדרום קרוליינה); תוכנית ההשקעות העתידיות REVIVE והסוכנות הלאומית למחקר (ANR; הענקת "Twothyme" ל-A.C.); מענק ANR "Myeloten" (ל-R.G.); והמכון הלאומי לסרטן (תפקיד המיקרו-סביבה החיסונית במהלך סרטן הכבד, ל-R.G). אנו מודים לפלטפורמת המרכז לאימונולוגיה אנושית וציטומטריה במכון פסטר על תמיכתם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Cells Direct One Step qRT-PCR ערכת AppliedBiosystems 11753100ערכת זיהוי בדיקה פריימר. מכיל תערובת תגובה 2x, אנזים SSIII פלטיניום.
Low TE EDTA BufferAffymetrix75793 100 מ"ל
צלחות 96 בארותThermofisher ScientificAB 1100צלחות 96 בארות המותאמות למיון תאים ומחזור תרמי
סרט כיסוידומיניק דוטשר106570סרט כיסוי אלומיניום; הימנע מזיהום ואידוי
ActbThermofisher ScientificMm00607939_s120x פריימר
AesThermofisher ScientificMm01148854_s120x פריימר
AhrThermofisher ScientificMm00478932_s120x פריימר
Bcl2Thermofisher ScientificMm00477631_s120x פריימר
c-mycThermofisher ScientificMm00487804_s120x פריימר
CbfbThermofisher ScientificMm01251026_s120x פריימר
Cd27Thermofisher ScientificMm01185212_s120x פריימר
Cd49aThermofisher ScientificMm01306375_s120x פריימר
CD49bThermofisher ScientificMm00434371_s120x פריימר
Cxcr5Thermofisher ScientificMm00432086_s120x פריימר
Cxcr6Thermofisher ScientificMm02620517_s120x פריימר
EomesThermofisher ScientificMm01351985_s120x פריימר
Ets1Thermofisher ScientificMm01175819_s120x פריימר
Foxo1Thermofisher ScientificMm00490672_s120x פריימר
GapdhThermofisher ScientificMm03302249_s120x פריימר
Gata3Thermofisher ScientificMm00484683_s120x פריימר
Gm-csfThermofisher ScientificMm01136644_s120x פריימר
Hes1Thermofisher ScientificMm01342805_s120x פריימר
HprtThermofisher ScientificMm00446968_s120x פריימר
Id2Thermofisher ScientificMm01293217_s120x פריימר
Il-12rb2Thermofisher ScientificMm00711781_s120x פריימר
Il-18r1Thermofisher ScientificMm00515178_s120x פריימר
Il-1rl1Thermofisher ScientificMm00434237_s120x פריימר
Il-22Thermofisher ScientificMm001226722_s120x פריימר
Il-23rThermofisher ScientificMm00519943_s120x פריימר
Il-2raThermofisher ScientificMm01340213_s120x פריימר
Il-2rbThermofisher ScientificMm01195267_s120x פריימר
IL-7rThermofisher ScientificMm00434295_s120x פריימר
Klr5Thermofisher ScientificMm04207528_s120x פריימר
Lef1Thermofisher ScientificMm00550265_s120x פריימר
Ncr1Thermofisher ScientificMm01337324_s120x פריימר
Nfil3Thermofisher ScientificMm01339838_s120x פריימר
Notch1Thermofisher ScientificMm00435249_s120x פריימר
Notch2Thermofisher ScientificMm00803069_s120x פריימר
RoraThermofisher ScientificMm01173766_s120x פריימר
RorcThermofisher ScientificMm01261022_s120x פריימר
Runx3Thermofisher ScientificMm00490666_s120x פריימר
Tbx21Thermofisher ScientificMm01299453_s120x פריימר
Tcf3Thermofisher ScientificMm01175588_s120x פריימר
Tcf7Thermofisher ScientificMm00493445_s120x פריימר
Tle1Thermofisher ScientificMm00495643_s120x פריימר
Tle3Thermofisher ScientificMm00437097_s120x פריימר
Tsc22d3Thermofisher ScientificMm01306210_s120x פריימר
Tnfrsf11aThermofisher ScientificMm00437132_s120x פריימר
טוקסThermofisher ScientificMm00455231_s120x פריימר
Zbtb16Thermofisher ScientificMm01176868_s120x פריימר
Zbtb7bThermofisher ScientificMm00784709_s120x פריימר
qPCR Master mix Applied BioSystemsP/N 4304437
2x Assay Reagent ReagentFluidigmP/N 85000736מבחני צפיפות ספציפית בינונית לעומס בשבב מיקרופלואידיקה RT-qPCR. 
2x מגיב טעינת דגימהFluidigmP/N 85000735צפיפות ספציפית בינונית לטעינת דגימות בשבב מיקרופלואידית RT-qPCR. 
48.48 mutliplex RT qPCR שבב מיקרופלואידי,FluidigmBMK-M-48.4848.48 מערך דינמי IFC לביטוי גנים; שבב למולטיפלקס תא יחיד RT-qPCR תגובת
48.48 mutliplex RT qPCR בקר שבב מיקרופלואידיFluidigm8900002048.48 IFC בקר; לשלוט במערכת הנוזלית הפנימית של השבב, דגימות עומס ובדיקות בתאי תגובה
mutliplex RT qPCR תרמוציקלר מיקרופלואידיתFluidigmGE48.4848.48 מערך דינמי IFC תרמו-סייקלר
96 בארות צלחותThermofisher ScientificAB 1100צלחות 96 בארות מותאמות למיון תאים ומחזור תרמי
עכברי C57Bl/6 JanvierC57Bl/6
10 מ"ל מזרקBD Biosciences309639
PBSLife Technologies14040174
HBSSLife Technologies24020133
RPMILife Technologies61870044
FCSCVFSVF000UEurobio Abcysסרום עגל עוברי סטנדרטי
צינור פוטרצינור N/A
צינור 15 מ"לצינור קורנינג352097
1.5 מ"למכונת Sigma-AldrichT9661-1000EA
FACS צנטריפוגהN/A
 Thermofisher Scientific75004538
1,000 ומיקרו; l טיפיםפישר סיינטיפיק10313272
P1000 גילסוןF123602
פרקולדומיניק דוטשר17-0891-01
צינור Facsפלקון352235
נוגדן לעכבר ביוטין נוגדן1103520סונישושלת שושלת
אנטי-CD19 נוגדן עכבר ביוטיןסוני1177520שושלת
נוגדן אנטי-TCRab נוגדן עכברביוטין BioLegendנוגדן שושלת
נוגדן TCRgd נוגדן עכבר ביוטיןBD Biosciencesנוגדןשושלת
553176 נוגדן עכבר Ter119 נוגדן עכבר ביוטיןBD Biosciencesנוגדן שושלת
נוגדן עכבר ביוטין נגד Gr1 נוגדן עכבר ביוטיןBD Biosciences553125נוגדן שושלת
אנטי-CD45.2 נוגדן עכבר PerCPCy5.5BioLegend109828
נוגדן לעכבר אנטי-IL7ra PeCy7ebioSciences25-1271-82
נוגדן לעכבר CD3 BV510 נוגדן לעכברBD Biosciences563024
נוגדן לעכבר CD4 BV786 נוגדן לעכברBD Biosciences563727
נוגדן לעכבר NKp46 PEebioSciences12-3351-82
סטרפטווידיןסוני2626025
Propidium IodideSigma-AldrichP4864-10ML
פיפטה אלקטרוניתEppendorf4986000017
Combitips 0.1 מ"לEppendorf30089405
פיפטה רב ערוציתRaininL8-10XLS+
AccudropBD Biosciencesחרוזי אימות 345249 עבור FACS
miceJ@RJ 109204553672

מקורות

  1. Sun, H., et al. A Bead-Based Microfluidic Approach to Integrated Single-Cell Gene Expression Analysis by Quantitative RT-PCR. RSC Adv. 5, 4886-4893 (2015).
  2. Kellogg, R. A., Berg, R. G., Leyrat, A. A., Tay, S. High-throughput microfluidic single-cell analysis pipeline for studies of signaling dynamics. Nat. Protoc. 9 (7), 1713-1726 (2014).
  3. Moignard, V., Macaulay, I. C., Swiers, G., Buettner, F., Schütte, J. Characterisation of transcriptional networks in blood stem and progenitor cells using high-throughput single cell gene expression analysis. Nat. Cell Biol. 15 (4), 363-372 (2013).
  4. Chea, S., Schmutz, S., et al. Single-Cell Gene Expression Analyses Reveal Heterogeneous Responsiveness of Fetal Innate Lymphoid Progenitors to Notch Signaling. Cell Rep. 14 (6), 1500-1516 (2016).
  5. Ishizuka, I. E., Chea, S., et al. Single-cell analysis defines the divergence between the innate lymphoid cell lineage and lymphoid tissue - inducer cell lineage. Nat. Immunol. 17, 1-9 (2016).
  6. Spits, H., Artis, D., et al. Innate lymphoid cells - a proposal for uniform nomenclature. Nat.Rev. Immunol. 13 (2), 145-149 (2013).
  7. Walker, J. A., Barlow, J. L., McKenzie, A. N. J. Innate lymphoid cells- how did we miss them. Nat. Rev. Immunol. 13 (2), 75-87 (2013).
  8. Vallentin, B., Barlogis, V., et al. Innate Lymphoid Cells in Cancer. Cancer Immunol. Res. 3 (10), 1109-1114 (2015).
  9. Monticelli, L. a, Artis, D. Innate lymphoid cells promote lung tissue homeostasis following acute influenza virus infection. Nat. Immunol. 12 (11), 1045-1054 (2012).
  10. Tang, L., et al. Differential phenotypic and functional properties of liver-resident NK cells and mucosal ILC1s. J. Autoimmun. 67, 29-35 (2015).
  11. Durum, K., Gilfillan, S., Colonna, M., Consortium, G. Transcriptional Programs Define Molecular Characteristics of Innate Lymphoid Cell Classes and Subsets. Nat. Immunol. 16 (3), 306-317 (2015).
  12. Wang, H., Ramakrishnan, A., Fletcher, S., Prochownik, E. V., Genetics, M. Clonal dynamics of native haematopoiesis. Nature. 2 (2), 322-327 (2015).
  13. Samsa, L. A., Fleming, N., Magness, S., Qian, L., Liu, J. Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (109), e1-e10 (2016).
  14. Klose, C., Flach, M., et al. Differentiation of Type 1 ILCs from a Common Progenitor to All Helper-like Innate Lymhpoid Cell Lineages. Cell. 157, 340-356 (2014).
  15. Dicle, Y., et al. Bioinformatics Approaches to Single-Cell Analysis in Developmental Biology. MHR. 22, 182-192 (2016).
  16. Setty, M., et al. Wishbone identifies bifurcating developmental trajectories from single-cell data. Nat Biotechnol. 34, 637-645 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

תאי לימפואיד מולדיםמדור תאי ILC כבדייםמיון תאים מופעל פלואורסצנציהשבב qPCR מיקרופלואידיתערובת טרום-הגברההטרוגניות בביטוי גניםאנליזת PCR בזמן אמת
ביטוי גנים תא בודד באמצעות Multiplex RT-qPCR לאפיון הטרוגניות של אוכלוסיות הלימפה נדירים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.