הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בחינת העצרת הפרוטאזום עם רקומביננטי Archaeal הפרוטאזומים ועמוד Nondenaturing: The Case for גישה משולבת

6.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54860

⸱

17 בדצמבר 2016

 , 
1Department of Biology, Indiana University-Purdue University, Indianapolis (IUPUI)

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה משתמש בשני Coexpression למקטע ו למקטע postlysis ערבוב לבדיקה יסודית יותר של הרכבת הפרוטאזום רקומביננטי.

תקציר

הפרוטאזומים נמצאים בכל תחומי החיים. הם מספקים את המסלול העיקרי של פירוק חלבונים תאיים אאוקריוטים, אם כי הרכבה שלהם אינה מובנת לחלוטין. כל פרוטאזומים מכילים חלקיק הליבה נשמרת מבנית (CP), או הפרוטאזום 20S, המכיל שתי טבעות למקטע β heptameric דחוקה בין שתי טבעות למקטע α heptameric. פרוטאזומים 20S Archaeal פשוטים לעומת בעלי הרכב לעמיתיהם איקריוטיים שלהם, בעודם חולקים מנגנון הרכבה משותף. כתוצאה מכך, פרוטאזומים 20S archaeal להמשיך להיות מודל חשוב להרכבת הפרוטאזום איקריוטיים. באופן ספציפי, ביטוי רקומביננטי של פרוטאזומים 20S archaeal בשילוב עם ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide nondenaturing (עמוד) הניב תובנות חשובות רבות לתוך biogenesis הפרוטאזום. כאן, אנו דנים אמצעי לשפר את האסטרטגיה הרגילה של Coexpression של α הפרוטאזום archaeal ובטא יחידות משנה לפני nondenaturing עמוד. אנו מראים כי למרות מהירים ויעילים, גישת Coexpression לבדו יכולה לפספס ביניים הרכבת מפתח. במקרה של הפרוטאזום, Coexpression לא יכול לאפשר זיהוי של-הפרוטאזום וחצי, טבעת-α מלאה המכילה ביניים אחת β-טבעת אחד שלם. עם זאת, ביניים זו מזוהה בקלות באמצעות ערבוב lysate. אנו מציעים שילוב Coexpression עם ערבוב lysate מניב גישה יותר יסודית בניתוח הרכבה, עדיין נותר העבודה nonintensive. גישה זו עשויה להיות שימושית לחקר מתחמי multiprotein רקומביננטי אחרים.

מבוא

מתחמי multiprotein לבצע פעילות הסלולר קריטית רבה 1. עבור רבי קומפלקסים אלה, הרבה יותר ידוע על המבנה שלהם ותפקוד מאשר על ההרכבה שלהם 2,3. הפרוטאזום הוא מורכב אחד כזה והוא נמצא בכל תחומי החיים. אאוקריוטים, מכונה מולקולרית זה הוא הליבה של המערכת הפרוטסומית / יוביקוויטין (UPS) ומספק את המסלול העיקרי של פירוק חלבונים תאיים 4. הפרוטאזום איקריוטיים (המכונה הפרוטאזום 26s) מורכב משני מכלולים תת מרכזיים: א הפרוטאזום 20S, או חלקיקי Core (CP) 5, שניתן כתרים על קצוות אחד או שניהם על ידי חלקיק 19S תקין (RP) 6.

הפרוטאזום 20S הוא פרוטאז מידור גדול. המבנה הרביעון שלה נשמר לחלוטין בכל תחומי חיים והוא מורכב ערימה של ארבע טבעות שבע membered המכיל שני סוגים של יחידות משנה הקשורות מבני, α; ובטא 5,7,8. אאוקריוטים, שתי הטבעות החיצוניות כל מונה שבע יחידות משנת α ברורות ואת שתי הטבעות פנימיות כל מונה שבע יחידות משנת β ברורות; פעילות פרוטאוליטים מתגוררת בתוך שלוש של יחידות מהשנה β. לעומת זאת, טבעות CP של קדומים וחיידקים הן בדרך כלל מורכבות רק סוג אחד של α וסוג אחד של למקטע β. פרוטאזומים Archaeal סיפקו מערכת מודל חשוב ללמוד הרכבה הפרוטאזום הן בשל פשטות ההלחנה שלהם ושיתוף שלהם מנגנון הרכבה משותף עם עמיתיהם איקריוטיים שלהם 9-13. בקיצור, יחידות משנה α להרכיב לטבעות α ראשונה, אשר לשמש פיגום שעליו בטא יחידות משנה להרכיב. וכתוצאה מכך חצי פרוטאזומים (α 7 β 7) dimerize, והוליד התאספו מלא CP (α 7 β 7 β 7 α 7). במהלך dimerization, את propeptides להציג על יחידות משנה בטאיוסרו autocatalytically, חשיפת threonines N-terminal קטליטי. השימוש פרוטאזומים archaeal מודל הרכבה לעתים קרובות מנצל את הייצור של חלבונים הפרוטאזום archaeal רקומביננטי coli Escherichia. זוהי גישה כדאית משום שהוא מאפשר יחידות משנה להיות מיוצר בצירופים שונים, כמו גם WT וגרסאות מוטציה, בתוך הפונדקאי כי אינו מייצר פרוטאזומים משלה.

ניטור ההרכבה של קומפלקסי חלבונים רבים ביוכימית דורש סוג כלשהו של שיטת חלוקת המפריד מתחמים מורכבים במלואו מן ביניים ומבשרי הרכבה. בשל יכולת בפתרון מעולה, nondenaturing polyacrylamide ג'ל אלקטרופורזה (עמוד) הוכיח להיות שימושי במיוחד החלוקה של מתחמי multiprotein גדולים השונים 14-17. השילוב של ייצור הפרוטאזום archaeal רקומביננטי עמוד nondenaturing הפכה גישה חזקה ב dissectinהפרוטאזום גרם הרכבת 9,11,12,18. עם זאת, השיטה הרגילה על ידי איזו גישה זו מיושמת (כלומר. דרך Coexpression רקומביננטי של יחידות משנת α ו β) יש חסרון חשוב. תגובות עצרת מאורגנות על בסיס שיתופיות וריכוז-תלוי מאוד 3. בהתחשב בכך את ריכוז החלבון בתוך התאים הוא גבוה מאוד 19, בשל תופעות נפח נשלל, תגובות הרכבה להמשיך במהירות in vivo. מכאן אפשר לפספס ביניים הרכבה חשובים כאשר יחידות משנת α ו β הן coexpressed.

כאן, אנו טוענים בגישה המשולבת במחקר של הרכבה הפרוטאזום באמצעות יחידות משנה הפרוטאזום archaeal רקומביננטי. לפי גישה זו, הן שיטות ערבוב Coexpression ו lysate מועסקים. הראשון מאפשר ניתוח מהיר של הרכבה כי Coexpression הוא פחות עבודה אינטנסיבית. זה האחרון תלוי ביטוי נפרד של תת-יחידות α ו β, ואחריו ערבוב. למרות requi זהמיל קצת יותר מאמץ מאשר Coexpression, זה בהחלט פיצו על ידי היכולת לזהות ביניים כי הם הפסידו במהלך Coexpression. יחד, שתי שיטות יכולות לספק תמונה שלמה יותר של הרכבה הפרוטאזום.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. ביטוי חיידקית.

הערה: פלסמידים הביטוי השתמשו במחקר זה מתוארים בטבלה 1. פתרונות, תקשורת, או מאגר השתמשו במחקר זה מתוארים בטבלה 2. שיבוט של גנים למקטע הפרוטאזום archaeal והדור של פלסמידים ביטוי מתוארים במקומות אחרים 18,20. בקיצור, פלסמידים עבור Coexpression רקומביננטי של יחידות משנה להעסיק אסטרטגיה אופרון bicistronic שעוזר בהשגת רמות ביטוי דומה של יחידות משנה הפרט 18,20. פרמטרי הביטוי המפורטים להלן היו לקבוע באופן אמפירי להיות אופטימלי עבור היחידות מהשנה הפרוטאזום במחקר זה. זה עשוי להיות נחוץ כדי לייעל ביטוי מוטציות הפרוטאזום אחרים, עבור פרוטאזומים ממיני archaeal אחרים, או עבור קומפלקסי חלבונים רקומביננטיים אחרים (ראה דיון).

  1. Transform הביטוי פלסמיד עניין לתוך BL21 E.coli המוסמכות כימית (DE3) תאים.
  2. להוסיף 1 - 2 μL של פלסמיד (בדרך כלל 50 - 100 ng) כדי aliquot של תאים DE3 שהיו מופשר טרי על הקרח, ולהמשיך לדגור על קרח למשך 20 דקות.
  3. הלם חום התאים ב 42 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות ולחזור צינור קרח דק 2 additionl.
  4. הוסף 1 מ"ל של מדיום LB ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס עם רועד (150 סל"ד) במשך שעה 1.
  5. מורחים 100 - 200 μL של תערובת הטרנספורמציה לצלחות LB-kan (צלחות המכילות מדיה LB מוצק, בתוספת kanamycin (כל פלסמידים המשמשים התנגדות לקודד את המחקר הזה כדי אנטיביוטי זה)). דגירה צלחות ב 37 ºC O / N.
  6. למחרת בבוקר, לחסן מושבה אחת מהצלחת LB-kan לתוך 3 מ"ל של התקשורת LB-kan נוזל בתוך שפופרת זכוכית תרבות. לדגור על 37 מעלות צלזיוס עם רועד (150 סל"ד) במשך 2.5 כ - הוא ציין 3 שעות, או עד עכירות.
  7. מדוד את הצפיפות האופטית של התרבות ב 600 ננומטר (OD 600) ב ספקטרופוטומטר. לדלל את פולחן התאיור עם כמות מתאימה של התקשורת LB-kan prewarmed ל OD 600 של 0.4 בנפח סופי של 6 מ"ל. קורות חיים רועד ב 37 ºC במשך 40 דקות.
  8. להשרות ביטוי חלבון התרבויות הנוזלות על ידי הוספת IPTG מפתרון מניות לריכוז סופי של 1 מ"מ. לדגור על 37 מעלות צלזיוס עם רועד (150 סל"ד) במשך 6 כ - 7 שעות.
  9. קציר תרבויות תא החיידק בשלמותן לתוך 1.5 מ"ל צינורות microcentrifuge.
  10. הוסף 1.5 מ"ל של תרבות לתוך צינור microcentrifuge. צנטריפוגה ב g 10,000 × 1 דקות.
  11. בטל supernatant ולהוסיף 1.5 מיליליטר של אותה התרבות של הגלולה. צנטריפוגה ב g 10,000 × 1 דקות.
  12. חזור על שלב 1.11 עד שהתרבות כולה נאסף לתוך צינור microcentrifuge.
  13. אחסן את כדורי המושרה ב -80 ° C עד תמוגה.

2. בקטריאלי תמוגה Lysate ערבוב.

הערה: לקבלת דוגמיות למד באמצעות Coexpression, בצע סעיף 2.1 (ו סעיפי המשנה שבו). לקבלת דוגמיות המחייב ערבוב lysate, בצע סעיף 2.2 (ו סעיפי המשנה שבו). TSP (סה"כ, מסיסים, גלולה) הניתוח כלול בפרוטוקול הוא שימושי לאופטימיזציה ביטוי חלבון אשר יכול לעזור להבטיח כי כ כמויות שווות של יחידות משנת α ו β משולבים במהלך lysate ערבוב (ראה דיון). הוא גם מספק פקד חשוב אם תוצאות במורד אינן כצפויות (כלומר היא מאמתת החלבון בא לידי ביטוי ומסיס). לפיכך, אנו ממליצים בחום כולל ניתוח TSP בתחילה. לאחר פרוטוקול אופטימלי הושג עבור שילוב למקטע מסוים, ניתוח TSP אינו נדרש הקפדה ולכן היא מתוארת אופציונלית להלן.

  1. תמוגה של תאים חיידקיים והכנת שברים מסיסים.
    1. להפשיר את התא גלול המושרה על קרח למשך 5 דקות. Resuspend גלולה ב 600 μL של חיץ תמוגה.
    2. Incאובאטה ההשעיה 30 ºC עם רועד (150 סל"ד) למשך 30 דקות כדי ליצור lysate גולמי בסך הכל.
      הערה: השלב הבא ואת הקטן העוקב הם אופציונליים.
    3. הסר שני 25 aliquots μL מן lysate הכולל גולמי 1.5 מ"ל microcentrifuge צינורות נפרדים ולבצע ניתוח TSP כדלקמן.
      1. לאחד aliquots שני 25 μL, להוסיף למאגר מדגם 5X SDS לריכוז סופי של 1X. לייבל הצינור עם "T" עבור "lysate הגולמי הכולל".
      2. דגירה מדגם "T" ב -100 ºC למשך 5 דקות כדי לפגל חלבונים לחלוטין.
      3. בינתיים, לקחת את aliquot השני 25 μL צנטריפוגות אותו ב 10,000 g × במשך 10 דקות. מוציאים בזהירות את supernatant מבלי להפריע גלולה זעירה, ולהעביר אותו צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge חדש. לייבל צינור חדש זה "S" עבור "חלק מסיס".
      4. כדי גלולה זעירה behi עזבnd בשלב הקודם, להוסיף 25 μL של חיץ תמוגה מערבולת כדי resuspend. לייבל הצינור הזה "P" עבור "חלק גלול".
      5. הוסף 6 μL של 5X SDS מדגם חיץ הצינורות "S" ו- "P" לדגור על 100 ºC כמתואר לעיל.
        הערה: אם דגימות TSP לא תשמשנה באותו היום לנתח ביטוי, הם עשויים להיות קפוא ב -20 ºC עד צורך. לאחר מופשר, הם חייבים להיות reincubated ב -100 ºC, כמתואר לעיל, מיד לפני טעינת על 12% ו / או 15% ג'ל SDS-PAGE סטנדרטי.
    4. בעוד ניתוח TSP מתבצע, צנטריפוגה הנותר 550 μL של lysate הגולמי כולל (או כולו 600 μL של lysate הגולמי סך אם ניתוח TSP לא מתבצע) ב g 10,000 × במשך 10 דקות. אסוף את supernatant בצינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge טרי. זהו lysate המסיס אשר ישמש לטיהור.
  2. ערבוב lysate.
    1. לבצע תמוגה כמתואר בשלבים 2.1.1 ו 2.1.2 לעיל.
    2. מערבבים 600 μL של lysate גולמי סך מחיידקים להביע למקטע α הרצוי עם 600 μL של lysate גולמי סך מחיידקים להביע למקטע β הרצוי. לדגור על 37 מעלות צלזיוס עם רעד איטי למשך 30 דקות.
      הערה: זה עשוי להיות נחוץ כדי לייעל את זמן הדגירה להשלים את התכנסותו מקסימלית במהלך lysate ערבוב (ראה דיון). השעה והטמפרטורה המוצגים כאן הם אופטימליים עבור חלבונים רקומביננטיים במחקר זה והיו נחושים במקום אחר 18.
    3. צנטריפוגה lysate המעורבת ב g 10,000 × במשך 10 דקות כדי להפריד חומר מסיס מן הגלולה מסיסה. מעבירים את supernatant לצינור 1.5 מ"ל microcentrifuge חדש. השתמש lysate המסיס המעורב זו לטיהור חלבון.

3. טיהור חלבון באמצעות שרף משותק קובלט זיקה(קואליציית עיקר).

  1. לאזן את השרף.
    1. ביסודיות resuspend שרף על ידי היפוך בקבוק ולהעביר 50 μL של תרחיף לצינור 1.5 מ"ל microcentrifuge. צנטריפוגה ב g 700 × 2 דקות כדי שרף גלול. בזהירות לשאוב supernatant.
      הערה: אנו מבצעים השאיפה פיפטה באמצעות קצה פיפטה כחול 1 מ"ל כדי להסיר את חלק הארי של הנוזל. טיפ 2 μL לבן משמש לשליטה קנס של הסרת supernatant הנותרים, משאיר שכבה דקה מאוד של נוזל מכסה את החרוזים.
    2. הוסף 1 מ"ל של הצפת א מערבבים בעדינות כדי resuspend שרף צנטריפוגות ב g 700 × 2 דקות עד גלולה שרף. בזהירות לשאוב supernatant וחזור על שלב זה לשטוף פעם נוספת.
  2. החל lysate המסיס שהושג בעבר בסעיף 2.1 או 2.2 שרף equilibrated. דגירת הצינור עם סיבוב עדין ב 4 ºC למשך 60 דקות. צנטריפוגה הצינור ב 700 × גרם </ Em> במשך 5 דקות ובזהירות לשאוב supernatant.
  3. שטוף את השרף כדלקמן להסיר חלבונים מחויבים nonspecifically.
    1. שרף גלולה עם 1 מ"ל של הצפת דגירה עם נדנדה עדין ב 4 ºC למשך 10 דקות. צנטריפוגה הצינור ב g 700 × 5 דקות ובזהירות לשאוב supernatant. חזור על שלב זה לשטוף פעם נוספת.
    2. שרף גלולה עם 1 מ"ל של הצפת B (חיץ עם 5 מ"מ Imidazole) דגירה עם נדנדה עדין ב 4 ºC למשך 5 דקות. צנטריפוגה הצינור ב g 700 × 5 דקות ובזהירות לשאוב supernatant. חזור על שלב זה לשטוף פעם נוספת.
    3. שרף גלולה עם 1 מ"ל של חיץ C (חיץ עם 10 מ"מ Imidazole) דגירה עם נדנדה עדין ב 4 ºC למשך 5 דקות. צנטריפוגה הצינור ב g 700 × 5 דקות ובזהירות לשאוב supernatant.
  4. Elute החלבון על ידי הוספת 400 μL של הצפת E (הצפת עם 200 מ"מ Imidazole) to שרף. דגירה עם נדנדה עדין ב 4 ºC למשך 5 דקות. צנטריפוגה ב g 700 × למשך 5 דקות.
  5. העברת supernatant המכיל חלבון מטוהר אל צינור 1.5 מיליליטר צנטריפוגות חדש.
  6. Desalt החלבון מטוהר על ידי צנטריפוגה סדר כדלקמן.
    1. 400 μL של חלבונים מטוהרים, להוסיף 100 μL הצפת (זה מפחית ריכוז Imidazole מ -200 מ"מ ל -160 מ"מ). החל חלבון מטוהר 0.5 מסנני ultracentrifugal מיליליטר עם חתוך משקל מולקולרי 10 kDa. צנטריפוגה ב g 14,000 × למשך 5 דקות.
    2. מחק את התסנין ולהוסיף 400 μL הציף לדלל את retentate צנטריפוגות שוב. המשך מחזורי צנטריפוגה / דילול עד ריכוז imidazole נופל מתחת ל -4 מ"מ. כדוגמא, אם כל צנטריפוגה מתרכז 500 μl אל ~ 70 μl (או כ פי 7), אז שני מחזורים יפחיתו את ריכוז imidazole 160 מ"מ החל (7 × 7 = 49-פי) כדי approximately 3.3 מ"מ.
    3. למדוד את ריכוז החלבון של המדגם desalted באמצעות assay BCA 21.
      הערה: Desalting נדרש להפחית את רמות Imidazole מתחת לגבול הסובלנות עבור assay BCA, כמתואר הוראות היצרן. המעבדה שלנו מעדיף את assay BCA כי הוא רגיש, יש טווח דינמי גדול, ותערוכות הרבה פחות וריאציה חלבון לחלבון. עם זאת, שיטות אחרות כדי לקבוע ריכוז החלבון ניתן להחליף עבור assay BCA. המפתח הוא להיות מודע לכל היתרונות והמגבלות של שיטה.
  7. הוסף חוצץ מדגם 5X יליד לריכוז סופי של 1X והמשך אלקטרופורזה. לחלופין, לאחסן דגימות ב -20 ºC לצורך ניתוח מאוחר יותר.

4. ג'ל אלקטרופורזה Nondenaturing polyacrylamide (עמוד).

זהירות: acrylamide Unpolymerized הוא עצבי. תלבש GEA הגנה המתאימהr.

  1. הכן את ג'ל עמוד nondenaturing כדלקמן.
    1. הכן את קלטת ג'ל ליציקה באמצעות לוחות זכוכית נקיים ליהוק עמדה. מניחים יצרנית שיפוע על גבי בוחש מגנטי קטן ומניחים בר ומערבבים זעירים לתוך כל תא.
    2. באמצעות 40% (w / v) acrylamide ו -2% (w / v) פתרונות המניות bisacrylamide, להכין 5% ו -10% (w / v) פתרונות ג'ל acrylamide חיץ בפתרון הילידים. ודא כי היחס של acrylamide סך bisacrylamide הוא 37.5: 1. צ'יל על הקרח לפני המזיגה.
      הערה: מערכת עמוד nondenaturing משמשת כאן היא כמעט זהה למערכת SDS-PAGE Laemmli, עם SDS השמיט 22.
    3. להוסיף אמוניום persulfate (מתוך 10% (w / v) פתרון המניות מוכן במים) כדי הפתרונות acrylamide ליזום פילמור. ריכוז סופי של אמוניום persulfate הוא 0.1% (w / v).
    4. יוצקי פתרונות acrylamide לתוך שתי לשכות יצרנית השיפוע. עם B לשקע צינורות המוכנסיםetween הצלחות של קלטת ג'ל, להפעיל את הבוחש המגנטי ולפתוח את השסתומים יצרני שיפוע. יוצקים את 5 - ג'ל שיפוע nondenaturing 10%.
    5. לאחר שפך, כיסוי ג'ל עם שכבה דקה של Isopropanol ולאפשר הג'ל לפלמר למשך 30 דקות. במהלך תקופה זו, להכין פתרון ג'ל טרי 5% acrylamide במאגר בפתרון הילידים. לאחר ערכות ג'ל, יוצקים מעל Isopropanol ולשטוף העליון של ג'ל עם מים ללא יונים מבקבוק להשפריץ.
    6. כדי הפתרון ג'ל 5% המוכנים לעיל, להוסיף אמוניום persulfate (בדיוק כמתואר 4.1.3) ויוצק על גבי ג'ל polymerized עד צלחות זכוכית מלאות. כנס מסרק ג'ל. אפשר הג'ל המעולף לפלמר עבור 30 דקות נוספות.
    7. לאחר ג'ל הוא polymerized, להרכיב ג'ל קלט לתוך מנגנון אלקטרופורזה. לחלופין, לאחסן את הג'ל על 4 ºC, עטוף במגבות נייר לחות בניילון נצמד עד לשימוש.
  2. לאחר ג'ל עמוד nondenaturing מורכב לתוך ELECמנגנון trophoresis, למלא את המכל עם חיץ ריצת יליד 1X המוכן טרי מלאה ריצת חיץ יליד 10X.
  3. טען 10 מיקרוגרם של חלבונים מטוהרים, שהושג בסוף סעיף 3, לתוך כל שימוש היטב מזרק זכוכית.
  4. טען 2 μL לסטנדרטים חלבון יליד משקל מולקולרי גבוה (מדולל במאגר ריצה 1X הילידים) לאחת הבארות.
  5. הפעל ג'ל ב- V ו -4 ºC 55 עד בחזית לצבוע בורח הג'ל (כ 4 - 4.5 שעות).
  6. בנוסף הג'ל nondenaturing, לנתח aliquots של החלבון מטוהרים על ידי 22 SDS-PAGE סטנדרטי.
    1. מערבבים aliquots (10 מיקרוגרם) של דגימות חלבון מטוהרים, שהושג בסוף סעיף 3, עם חיץ 5X SDS-מדגם לריכוז סופי של 1X.
    2. לדגור על 100 ºC למשך 5 דקות ו לטעון על תקן 12% ו / או 15% ג'ל SDS-PAGE 22.
    3. הפעלה ב 80V למשך 20 דקות ולאחר מכן ב 120 V עד בחזית לצבוע בורח הג'ל (זה כ תוספתitional 75 דקות עבור ג'ל 12%, ו -120 דקות עבור ג'ל 15%).

5. פעילות חזותיות מכתים חלבון.

  1. בעקבות אלקטרופורזה, צלחות זכוכית נפרדות בזהירות ולהעביר את הג'ל nondenaturing למגש ג'ל המכיל 50 מיליליטר של מים ללא יונים. לשטוף ג'ל עם נדנדה עדין למשך 5 דקות. בטל מים וחזרו על שלב זה לשטוף שלוש פעמים.
  2. בצע assay כיסוי המצע כדלקמן.
    1. הוסף 1 מ"ל של פיתוח מאגר המכיל המצע פפטיד fluorogenic Suc-LLVY-AMC ולהפיץ באופן אחיד על פני הג'ל. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
      הערה: מוט זכוכית או releaser ג'ל (טריז קטן של פלסטיק המשמש לוחות זכוכית נפרדים) ניתן להשתמש כדי להפיץ את הנוזל על ג'ל.
    2. בזהירות להעביר את הג'ל על UV transilluminator של מערכת ההדמיה ג'ל ולבחון קרינה בשל מצע פפטיד בקע. תמונת שיא. להעביר בזהירות את ba ג'לck למגש ג'ל.
    3. יש לשטוף את הג'ל פעמיים עם 50 מ"ל של מים ללא יונים במשך 5 דקות עם נדנדה עדין.
    4. כתם ג'ל עם 10 מיליליטר של ריאגנט כתם coomassie קולואידים במשך 60 דקות עם נדנדה עדינה. ג'ל destain עם 50 מ"ל מים עד רקע מתבהר. צעד מכתים זה חל על ג'לים SDS-PAGE הסטנדרטי גם כן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הפרוטאזום הרכבה (איור 1) מתחילה כאשר יחידות משנת אלפא לשלב טבעות טופס 9. אפשר להדגים זאת כאשר יחידות משנה אלפא מן archaeon Methanococcus maripaludis S2 מבוטאים החיידק כמו C- סופני hexahistidine מתויג (מתויג שלו) נגזרים (טבלה 1). כאשר α-שלו רקומביננטי החלבון היה מטוהר על ידי קואליציית עיקר ונותח על ידי nondenaturing עמוד, שתי להקות נצפו (איור 2 א ', מסלול 1). אנחנו הוכחנו בעבר כי אלה מתאימים טבעות α...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

אנו מדגימים את היתרון של גישה משולבת לניתוח הרכבה הפרוטאזום ידי nondenaturing עמוד באמצעות פרוטאזומים archaeal רקומביננטי. 9,11 השיטה הרגילה של Coexpression בקטריאלי של יחידות משנה הפרוטאזום מאפשר ניתוח מהיר אבל לא יכול לחשוף ביניים הרכבה מפתח. אנו מציעים שילוב Coexpression עם lysate ערבוב לפתח תמונה רחבה יותר של אירועי הרכבה.

היתרון של גישה משולבת זו הוא שלמרות מחייב ביטוי נפרד של α ובטא יחידות משנה ע...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענק קרנות לתשתיות למחקר (RSFG) מאוניברסיטת אינדיאנה-Purdue University, אינדיאנפוליס, ובחלקה על ידי בפרס של איגוד הלב האמריקאי 14GRNT20390154, כדי ARK

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תמיסת אקרילאמיד (40%)Biorad1610104אקרילאמיד לא פולימרי הוא רעלן עצבי. ללבוש ציוד מגן מתאים
Amicon אולטרה 0.5 מ"ל מסננים צנטריפוגלייםEMD UFC501024
אמוניום פרסולפטסיגמאA3678
ATPSigmaA7699
ערכת בדיקת BCAפירס23225
תמיסת ביסקרילאמיד (2%)Biorad1610142
ברומופנול כחולSigmaB8026
DNaseISigmaDN25
Dithiothreitol (DTT)Thermo FisherBP172
E. coli BL21 תאים מוכשריםEMD Millipore69450
GelCode BlueThermo Fisher24592מגיב כתמים קולואידי לג'לים
מערכת Gel doc EZBiorad1708270מערכת תיעוד ג'ל
משחררי ג'לBiorad1653320פלסטיק בצורת טריז המשמש להפרדת לוחות ג'ל; שימושי לפיזור נוזלים.
מוט זכוכיתתרמו פישר11-380B
גליצרולסיגמא49767
גליציןתרמו פישרBP3865
מזרק המילטוןתרמו פישר14-813-38מזרק זכוכית להעמסת ג'לים
HEPESארה"ב ביולוגיתH2010
HMW ערכת כיול מקוריתGE Healthcare170445-01תקני חלבון במשקל מולקולרי גבוה
Hoefer SG30Thermo Fisher03-500-277יצרנית שיפוע
ImidazoleUS Biologicals280671
IPTGUS BiologicalsI8500לאינדוקציה של ביטוי חלבון
IsopropanolThermo FisherBP26181
Kanamycin sulfateUS BiologicalsK0010
LysozymeSigmaL6876
MgCl<>sub2Fluka אנליטי630680
מיני פרוטאן Tetra CellBiorad1658002EDUמכשיר אלקטרופורזה ג'ל
NaClThermo FisherS640-3
NaOHThermo FisherS318-1
Pefabloc SCRoche11429876001מעכב פרוטאז
pET42EMD Millipore70562ביטוי פלסמיד
דיוק בתוספת כל תקןכחול Biorad1610373תקן חלבון מולקולרי תקן עבור SDS-PAGE
ערכת מוטגנזה Quickchangeטכנולוגיות Agilent200521
נתרן דודציל סולפט (SDS)Thermo FisherBP166
Suc-LLVY-AMCEnzo lifesciencesBML P802-0005מצע פלואורוגני
שרף זיקה למתכת TalonClontech635502שרף זיקה קובלט משותק
TEMEDSigmaT7024
TrisUS BiologicalsT8600
Triton-X100Sigma93426
TryptoneBacto BD
מגש דגימת UVBiorad1708271להדמיית UV של ג'לים
תמצית שמריםBacto BD212720
211699

מקורות

  1. Wan, C., et al. Panorama of ancient metazoan macromolecular complexes. Nature. 525, 339-344 (2015).
  2. Marsh, J. A., Teichmann, S. A. Structure, dynamics, assembly, and evolution of protein complexes. Annu Rev Biochem. 84, 551-575 (2015).
  3. Williamson, J. R. Cooperativity in macromolecular assembly. Nat Chem Biol. 4, 458-465 (2008).
  4. Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T., Kaiser, P. The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 192, 319-360 (2012).
  5. Groll, M., et al. Structure of 20S proteasome from yeast at 2.4 A resolution. Nature. 386, 463-471 (1997).
  6. Lander, G. C., et al. Complete subunit architecture of the proteasome regulatory particle. Nature. 482, 186-191 (2012).
  7. Lowe, J., et al. Crystal structure of the 20S proteasome from the archaeon T. acidophilum at 3.4 A resolution. Science. 268, 533-539 (1995).
  8. Hu, G., et al. Structure of the Mycobacterium tuberculosis proteasome and mechanism of inhibition by a peptidyl boronate. Mol Microbiol. 59, 1417-1428 (2006).
  9. Zwickl, P., Kleinz, J., Baumeister, W. Critical elements in proteasome assembly. Nat Struct Biol. 1, 765-770 (1994).
  10. Groll, M., Brandstetter, H., Bartunik, H., Bourenkow, G., Huber, R. Investigations on the maturation and regulation of archaebacterial proteasomes. J Mol Biol. 327, 75-83 (2003).
  11. Frankenberg, R. J., Hsu, T. S., Yakota, H., Kim, R., Clark, D. S. Chemical denaturation and elevated folding temperatures are required for wild-type activity and stability of recombinant Methanococcus jannaschii 20S proteasome. Protein Sci. 10, 1887-1896 (2001).
  12. Maupin-Furlow, J. A., Aldrich, H. C., Ferry, J. G. Biochemical characterization of the 20S proteasome from the methanoarchaeon Methanosarcina thermophila. J Bacteriol. 180, 1480-1487 (1998).
  13. Maupin-Furlow, J. A., Ferry, J. G. A proteasome from the methanogenic archaeon Methanosarcina thermophila. J Biol Chem. 270, 28617-28622 (1995).
  14. Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 1, 418-428 (2006).
  15. Langer, T., Pfeifer, G., Martin, J., Baumeister, W., Hartl, F. U. Chaperonin-mediated protein folding: GroES binds to one end of the GroEL cylinder, which accommodates the protein substrate within its central cavity. EMBO J. 11, 4757-4765 (1992).
  16. McKenzie, M., Lazarou, M., Thorburn, D. R., Ryan, M. T. Analysis of mitochondrial subunit assembly into respiratory chain complexes using Blue Native polyacrylamide gel electrophoresis. Anal Biochem. 364, 128-137 (2007).
  17. Tomko, R. J., Hochstrasser, M. Incorporation of the Rpn12 subunit couples completion of proteasome regulatory particle lid assembly to lid-base joining. Mol Cell. 44, 907-917 (2011).
  18. Panfair, D., Ramamurthy, A., Kusmierczyk, A. R. Alpha-ring Independent Assembly of the 20S Proteasome. Sci Rep. 5, 13130(2015).
  19. Zimmerman, S. B., Trach, S. O. Estimation of macromolecule concentrations and excluded volume effects for the cytoplasm of Escherichia coli. J Mol Biol. 222, 599-620 (1991).
  20. Kusmierczyk, A. R., Kunjappu, M. J., Kim, R. Y., Hochstrasser, M. A conserved 20S proteasome assembly factor requires a C-terminal HbYX motif for proteasomal precursor binding. Nat Struct Mol Biol. 18, 622-629 (2011).
  21. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 150, 76-85 (1985).
  22. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
  23. Chen, P., Hochstrasser, M. Autocatalytic subunit processing couples active site formation in the 20S proteasome to completion of assembly. Cell. 86, 961-972 (1996).
  24. Li, X., Kusmierczyk, A. R., Wong, P., Emili, A., Hochstrasser, M. beta-Subunit appendages promote 20S proteasome assembly by overcoming an Ump1-dependent checkpoint. EMBO J. 26, 2339-2349 (2007).
  25. Kusmierczyk, A. R., Kunjappu, M. J., Funakoshi, M., Hochstrasser, M. A multimeric assembly factor controls the formation of alternative 20S proteasomes. Nat Struct Mol Biol. 15, 237-244 (2008).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

20S
בחינת העצרת הפרוטאזום עם רקומביננטי Archaeal הפרוטאזומים ועמוד Nondenaturing: The Case for גישה משולבת
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.