פרוטוקול אופטימיזציה עבור Assay Shift ניידות Electrophoretic שימוש פלורסנט אינפרא אדום Oligonucleotides דיי שכותרתו

Yi-Wen Hsieh; Amel Alqadah; Chiou-Fen Chuang

doi:10.3791/54863

Method Article

פרוטוקול אופטימיזציה עבור Assay Shift ניידות Electrophoretic שימוש פלורסנט אינפרא אדום Oligonucleotides דיי שכותרתו

DOI:

10.3791/54863

⸱

November 29th, 2016

Yi-Wen Hsieh¹ , Amel Alqadah¹ , Chiou-Fen Chuang¹

¹Department of Biological Sciences, University of Illinois at Chicago

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים כאן פרוטוקול אופטימיזציה של מבחני Electrophoretic פלורסנט Shift הניידות (fEMSA) באמצעות חלבוני SOX-2 מטוהר יחד עם בדיקות DNA שכותרתו צבע פלואורסצנטי אינפרא אדומות כמקרה מבחן כדי להתמודד עם שאלה ביולוגית חשובה.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מבחני Electrophoretic Shift ניידות (Emsa) הם כלי אינסטרומנטלי לאפיין אינטראקציות בין חלבונים ורצפי DNA היעד שלהם. רדיואקטיביות כבר השיטה השלטת של תיוג DNA ב EMSAs. עם זאת, התקדמות צבעי ניאון שיטות סריקה יש הנחיות שימוש תיוג פלורסנט של DNA כחלופת רדיואקטיביות עבור היתרונות של טיפול קל, תוך חיסכון בזמן, הפחתת עלויות, ושיפור בטיחות. השתמשנו Emsa פלורסנט לאחרונה (fEMSA) כדי לטפל שאלה ביולוגית חשובה בהצלחה. ניתוח fEMSA שלנו מספק תובנה מכניסטית לתוך השפעת מוטציה missense, G73E, ב SOX-2 גורם שעתוק HMG שמור ביותר על פיזור סוג נוירון חוש הריח. מצאנו כי מוטצית SOX-2 חלבון ^G73E משנת פעילות מחייב DNA הספציפי, ובכך לגרום שינוי זהות נוירון חוש ריח. כאן, אנו מציגים אופטימיזציה וחסכוניים צעד-אחר-צעד פרוטוקולעבור fEMSA באמצעות oligonucleotides צבען שכותרתו ניאון אדום המכיל את LIM-4 / SOX-2 אתרי היעד סמוכים מטוהרים SOX-2 חלבונים (WT ו מוטנטים SOX-2 חלבוני ^G73E) כדוגמא ביולוגית.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EMSAs משמש לנתח אינטראקציות בין דנ"א וחלבונים באמצעות אלקטרופורזה polyacrylamide ג'ל ילידים (עמוד) כדי לפתור תערובת של חלבון של עניין בדיקת DNA שכותרתו המכיל אתרי יעד פוטנציאליים של החלבון ^1. בדיקת DNA קשרה עם חלבון יהגר לעומת איטית עם בדיקת DNA חופשית, ולכן הוא מפגר הגירה שלה באמצעות מטריצת polyacrylamide. Radiolabeling של DNA ב ^-32 P כבר השיטה השלטת לגילוי ב EMSAs. על אף שהבקשה של radiolabeling במחקר ביוכימי הועילה, שיטות תיוג DNA אלטרנטיבה ברגישות דומה שמתבצעות מועסקים בשל סיכוני בריאות ובטיחות הקשורים בטיפול רדיואקטיביות. שיטות חלופיות אלה כוללים נטיה של DNA עם ביוטין ² או digoxigenin (D....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: EMSAs באמצעות בדיקות DNA שכותרתו fluorescently או צורות אחרות של DNA שכותרתו לשתף את הפרוטוקולים זהים עבור חלבון או תא תמצית הכנה, חלבון-דנ"א תגובה מחייבת, ואת עמוד ג'ל הכנה והפעלה (איור 1 א). ההבדלים העיקריים הם הליכי תיוג DNA, מדרגות עיבוד ג'ל שלאחר הפעלה ולאחר שיטות זיהוי.

1. הכנת ג'ל

הכן ג'ל polyacrylamide יליד 5% המכיל TBE 0.5x (45 מ"מ טריס-Borate, 1 mM EDTA) ו -2.5% גליצרול, באמצעות מערכת ג'ל חלבון מיני (x רוחב 8.3 ס"מ עובי 7.3 ס"מ אורך x 0.75....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לצבוע טעינת אורנג G (6x: 0.12 גר 'אורנג' G ב 100 מ"ל 30% גליצרול) ניתן להוסיף התגובה מחייב לפני טעינת לדמיין את ההתקדמות של אלקטרופורזה. צבעי טעינת אחרים כולל כחול bromophenol יזוהו במהלך הסריקה ולכן להפריע ניתוח התמונה (איור 1B).

בחלק מהמקרים של EMSAs, במיוחד אם הכנת תמצית גרעיני משמש, deoxyinosinic-deoxycytidylic פולי (DI-DC) נכל.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

fEMSAs מהווים כלי יעיל לחקור אינטראקציות חלבון-דנ"א, והם אלטרנטיבה הסימון הרדיואקטיבי של DNA. צבעי ניאון כגון צבעי אינפרא אדומים זמינים מסחרי, ולספק שיטה בטוחה יותר ויותר ידידותית לסביבה לעומת תיוג DNA רדיואקטיבי. EMSAs באמצעות oligonucleotides אינפרא אדום הניאון שכותרתו לצבוע אינו דורש צעדי עיבוד ג'ל postrun, ולכן לחסוך זמן ועלות לעומת טכניקות תיוג DNA אחרות. השעה לזהות להקות באמצעות EMSAs רדיואקטיבי יכול לנוע בין 30 דקות עד מספר ימים, תלוי רדיואקטיביות וריכוז של בדיקות .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מלגת מחקר של אלפרד פ. סלואן (ל-C.-F.C.) ומענק NIH R01 (5R01GM098026-05 ל-C.-F.C). אנו מודים לדיוויד קרואו על הגישה למערכת ההדמיה האינפרא אדום המתקדמת.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
30% תמיסת אקרילאמיד/ביס (BIS), 37.5:1	Bio-Rad	1610158	אקרילאמיד מזיק ורעיל.
6x-נוגדן תג האפיטופ שלו (HIS. H8)	ThermoFisher	MA1-21315
נוגדן נגד דגל M2	Sigma-Aldrich	F3165-.2MG
סרום בקר אלבומין (BSA) כיתה ביולוגיה מולקולרית	ניו אינגלנד Biolabs	B9000S
5'IRDye700 עם תווית DNA אוליגוס	טכנולוגיות DNA משולבות	אוליגו DNA מותאם אישית	אלה מכונים "אוליגוס DNA פלואורסצנטי 5'Dye או אינפרא אדום פלואורסצנטי" בכתב היד. החברה תסנתז בהתאמה אישית אוליגונוקלאוטידים של 5 אינץ' IRDye עם תווית DNA. דורש מינימום 100 μ סינתזה בקנה מידה M וטיהור HPLC.
שבר קלנוב (3'-->5' exo-)	ניו אינגלנד Biolabs	M0212S
LightShif Poly (dI-dC)	ThermoFisher	20148E
Mini-PROTEAN תא אלקטרופורזה אנכית	ביו-ראד	1658000FC	זה מכונה 'מערכת מיני חלבון ג'ל' בכתב היד. ניתן להשתמש בכל מערכת אלקטרופורטית כל עוד מדובר בלוחות זכוכית שקופים בגודל של פחות מ- 25 ס"מ על 25 ס"מ.
מערכת הדמיה אינפרא אדום Odyssey CLx	LI-COR ביוטכנולוגיה	Odyssey CLx מערכת הדמיה אינפרא אדום	זו מכונה 'מערכת הדמיה אינפרא אדום מתקדמת' בכתב היד.
מערכת הדמיה Odyssey Fc	LI-COR Biotechnology	Odyssey Fc Dual-Mode Imaging System	זה מכונה 'מערכת הדמיה פלואורסצנטית קרובה לאינפרא אדום בעיקר עבור כתמים מערביים' בכתב היד.
תוכנת אימג' סטודיו (גרסה 4.0)	LI-COR תוכנת אימג' סטודיו ביוטכנולוגיה		זה מכונה 'תוכנת הדמיה מסוימת' בכתב היד.
כתום G	Sigma-Aldrich	O3756-25G
6x צבע			כתום 0.25% כתום G; 30% גליצרול
0.5x TBE			45 מ"מ Tris-Borate; 1 מ"מ EDTA
1x TE			10 מ"מ Tris-HCl, pH 8.0; 1 מ"מ EDTA
1x STE			100 מ"מ NaCl; 10 מ"מ Tris-HCl, pH 8.0; 1 מ"מ EDTA
5x מאגר			מחייב50 מ"מ Tris-HCl, pH 7.5; 50 מ"מ NaCl; 200 מ"מ KCl; 5 מ"מ MgCl<תת>2; 5 מ"מ EDTA, pH 8.0; 5 מ"מ DTT; 250 & #956; גרם/מ"ל BSA

טעינה

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat Protoc. 2, 1849-1861 (2007).
Ludwig, L. B., Hughes, B. J., Schwartz, S. A.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

פרוטוקול אופטימיזציה עבור Assay Shift ניידות Electrophoretic שימוש פלורסנט אינפרא אדום Oligonucleotides דיי שכותרתו

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles