מאמר שיטה

ניתוח של CD8 וירוס ספציפי החיסוני Simian + T-התאים קופי רזוס ידי פפטיד-MHC-I tetramer מכתים

DOI:

10.3791/54881

⸱

23 בדצמבר 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, University of Miami

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים פרוטוקול אופטימיזציה עבור ספירת ואפיון מקוק רזוס CD8 + T תאים נגד נגיף האיידס. מאמר זה הוא שימושי לא רק בתחום האימונולוגיה HIV, אלא גם לאזורים אחרים של המחקר הביו-רפואי שבו התגובות תא CD8 + T ידועים בהשפעתם התוצאה המחלה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פפטיד-מרכזי histocompatibility מורכבת אני בכיתה (pMHC-I) tetramers היה כלים רבים ערך כדי ללמוד CD8 + תגובות תאי T. בגלל ריאגנטים אלה ישירות לאגד קולטני תאי T על פני השטח של CD8 + לימפוציטים מסוג T, שכותרתו fluorochrome tetramers pMHC-לי לאפשר זיהוי מדויק של אנטיגן (Ag) -specific CD8 + T-תאים ללא צורך במבחנה מחדש -גְרִיָה. יתר על כן, בשילוב עם צבע רב cytometry זרימה, pMHC-לי tetramer מכתים יכול לחשוף היבטים מרכזיים של Ag ספציפי CD8 + T-תאים, כולל שלב התמיינות, פנוטיפ זיכרון, מצב ההפעלה. מחקרים מסוג זה כבר שימושי במיוחד בתחום האימונולוגיה HIV שבו CD8 + T-תאים יכולים להשפיע על התפתחות לאיידס. זיהום ניסיוני של קופי רזוס בנגיף הכשל החיסוני סימיאן (SIV) מספק כלי רב ערך כדי ללמוד חסינות הסלולר נגד נגיף האיידס. כתוצאה מכך, progre ניכרss נעשה בהגדרה ואפיון תגובות T-cell במודל חיה זו. כאן אנו מציגים פרוטוקול אופטימיזציה עבור ספירת SIV ספציפי CD8 + T-התאים קופי רזוס ידי מכתים tetramer pMHC-לי. Assay שלנו מאפשר phenotyping כימות וזיכרון סימולטני של שתי אוכלוסיות pMHC-לי tetramer + CD8 + T-cell לכל מבחן, אשר יכול להיות שימושי לצורך מעקב תגובות SIV ספציפי CD8 + T-cell שנוצר על ידי חיסון או זיהום SIV. בהתחשב הרלוונטי של פרימטים לא אנושיים במחקר ביו, מתודולוגיה זו ישימה ללימוד תגובות CD8 + T-cell במסגרות מחלה נפוצה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CD8 + T-תאים מהווים מרכיב חיוני של המערכת החיסונית אדפטיבית כפי שהוא להשתתף מעקב חיסוני גידול ולתרום מיגור פתוגנים תאיים 1. במילות פשוטות, CD8 + T-תאים לבטא קולטנים T-cell (TCRs) כי דווקא מכירים בכיתה מורכבת histocompatibility-מרכזי פפטיד אני (pMHC-I) מולקולות נוכחיות מופעל על הממברנה של תאי מארחים. מאז פפטידים אלה נגזרים proteolysis של חלבונים מסונתזים באופן אנדוגני, pMHC-I פני תא מתחמים פותחים בפנינו צוהר אל הסביבה התאית. עם זיהום בנגיף, למשל, תאים נגועים יציגו מולקולות MHC-I המכילות פפטידים שמקורם וירוס שיכול לשמש ligands עבור TCRs שהביע מסיירי CD8 + T לתאים. במקרה וירוס ספציפי CD8 + T-cell פוגש תא נגוע ההצגה ליגנד pMHC-I שלה, מעורבות TCR תגרום CD8 + T-cell הפעלת ultimately להוביל למקד תמוגה התא. בהתחשב באופי הקריטי של אינטראקציות TCR / pMHC-לי אלה, לקביעת הגודל, הסגוליים פנוטיפ להגיב CD8 + T-תאים לעתים קרובות יכול לחשוף רמזים חשובים על מחלות אנושיות.

עד תחילת 1990, כימות של Ag ספציפי CD8 + T-תאי הסתמכה על assay דילול בדרישה להגביל טכנית (LDA) 2,3. לא זו בלבד LDA לדרוש כמה ימים להסתיים, זה גם לא הצליח לאתר תאים חסרי פוטנציאל שגשוג. כתוצאה מכך, LDA לזלזל בהרבה התדירות בפועל של אנטיגן (Ag) CD8 + T-תאי -specific השתתפות תגובה חיסונית. למרות הפיתוח של ELISPOT מבחני מכתים ציטוקינים תאיים מאוד שיפר את היכולת למדוד חסינות הסלולר, שיטות אלה עדיין יש צורך גירוי במבחנה לכימות Ag ספציפי מתאי T 4. זה לא היה עד 1996 אלטמן, דייויס, ואת הפיצוץeagues פרסם מאמר ציון הדרך שלהם ולדווח על ההתפתחות של טכנולוגית tetramer pMHC-לי 5. קריטי להצלחה של טכניקה זו הייתה multimerization של מולקולות pMHC-I, אשר האריך את זמן מחצית החיים של אינטראקציות TCR / pMHC-I, ובכך להפחית את ההסתברות של tetramers pMHC-לי ליפול במהלך השלבים כביסה של מבחני תזרים cytometric. היתרון העיקרי של tetramers pMHC-לי על מבחני הנ"ל היא היכולת לזהות במדויק Ag ספציפי CD8 + T-תאים ישירות vivo לשעבר ללא צורך גירוי מחדש במבחנה. מעבר לכך, השילוב של מכתים tetramer pMHC-לי עם צבע רב cytometry זרימה אפשר ניתוחים מפורטים של שלב הבידול, פנוטיפ זיכרון, מצב הפעלה של Ag ספציפי CD8 + T-תאי 2-4. לאור התקדמות טכנית האחרונה לאפיון רפרטוארי CD8 + T-cell ידי pMHC-לי multimer מכתים 6, את רוחב היריעה של יישומי FOr מתודולוגיה זו צפויה להימשך מתרחבת.

אזורים מעטים במחקר ביו היה ליהנות יותר מכתים tetramer pMHC-לי מאשר בתחום האימונולוגיה HIV 7. למרות CD8 + T לתאים היו קשורים באופן זמני באמצעות השלט הראשוני של viremia HIV עד מועד הפרסום ידי אלטמן, דייויס, ועמיתיו 8,9, השימוש tetramers pMHC-לי בשנים שלאחר מכן הרחיב את הבנתנו משמעותית של תגובת CD8 + T-cell הספציפית ל- HIV. לדוגמא, מכתים tetramer pMHC-עזר לאשר את הגודל החזק של תגובות וירוס ספציפי CD8 + T-cell ברוב האנשים שנדבקו ב- HIV 10-12. מתודולוגיה זו גם כדי להקל על האפיון של HIV- ו SIV ספציפי תגובות CD8 + T-cell המוגבל על ידי מולקולות MHC-I הקשורות בשליטה ספונטנית של תרבות נגיף בהעדר-טיפול בתופעה תרופתית המכונה "שליטת אליטה" 13-15. יתר על כן, tetramers pMHC-לי סייע בהקמת מוות המתוכן 1 (PD-1) / PD ליגנד 1 (PD-L1) הציר כמו מסלול הפיך עבור הפנוטיפ מתפקדת הספציפי ל- HIV CD8 + T-תאי זיהום כרוני בלתי מבוקר 16,17. ככלל, מחקרים אלה מדגישים את התועלת של tetramers pMHC-לי לניטור CD8 + T-cell תגובות נגד נגיף האיידס.

זיהום ניסיוני SIV של קופי רזוס (מולאטית מאכאכה) נשאר מודל החיה הכי הטוב להערכת התערבויות חיסון נגד HIV / איידס 18,19. ב -25 השנים האחרונות, התקדמות משמעותית נעשתה זיהוי ואפיון של SIV ספציפי CD8 + T-תאי במינים זה קוף, לרבות גילוי אללים MHC-I ו- ההגדרה של מוטיבים מחייב פפטיד 13,20-27 . כתוצאה מכך, tetramers pMHC-לי פותח לניתוח SIV הספציפי CD8 + T-cellתגובות במודל החיה הזאת 28. רוב ריאגנטים אלה עשויים המוצרים הגן של ארבעה אללים רזוס מקוק MHC-I: ממו-A1 * 001, ממו-A1 * 002: 01, * ממו-B 008: 01, ו ממו-B * 017: 01. ראוי לציין, קופי רזוס מחווים מוקד MHC-C 29. הרוב המכריע של tetramers pMHC-השתמשתי בניסויים הנוכחי הופקו במתקן Core NIH tetramer באוניברסיטת אמורי. עם זאת, חלק ריאגנטים אלה, כולל ממו-A1 * 001 tetramers מאוגד epitope Gag CM9 immunodominant, ניתן להשיג רק ממקורות מסחריים בשל הסכמי רישוי. Tetramers pMHC-לי שימוש של ארבעה אללים מקוק רזוס המפורטים לעיל, יש לנו המנויים בהצלחה CD8 + T-תאי נגד סך של 21 אפיטופים SIV (טבלה 1), שהיו המושרה על ידי חיסון או זיהום SIV העיקרי 30,31 (et מרטינס al., תצפיות לא פורסם).

כתב היד הנוכחי מספקתpMHC-לי tetramer מכתים מותאם פרוטוקול לקביעת פנוטיפ תדירות וזיכרון של SIV ספציפי CD8 + T-התאים קופי רזוס. את assay מתחיל עם הדגירה אלקטיבי 30 דקות עם מעכב קינאז חלבון (PKI; כאן, dasatinib משמש) על מנת להקטין הפנמה TCR ובכך לשפר pMHC-לי tetramer מכתים 32. כפי שנראה בהמשך, הטיפול הזה הוא שימושי במיוחד בעת השימוש ממו-B * 017: 01 tetramers. הוראות כיצד לתייג את התאים עם tetramers fluorochrome מצומדות pMHC-I ו- נוגדנים חד שבטיים (מבז) ניתנים גם. פרוטוקול זה כולל גם צעד התא permeabilization לאיתור התאי של B granzyme המולקולה הקשורים cytolysis (Gzm B). מב נגד CD3 מתווספת בשלב זה, כמו גם כדי לשפר את היכולת לזהות מולקולת איתות TCR זה. כהפניה, כל fluorochromes מועסק לוח מכתים זה מפורט.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תא הדם ההיקפי mononuclear (PBMC) הדגימות מנוצלות כתב היד הזה התקבלו קופי רזוס ההודי שוכנו במרכז לחקר הפרימטים הלאומי ויסקונסין. חיות אלה טופלו בהתאם לדוח Weatherall תחת פרוטוקול שאושר על ידי אוניברסיטת טיפול בבעלי חיים המדרשה ויסקונסין ועדת שימוש 33. נהלי כל החיה בוצעו בהרדמה וכל המאמצים שנעשו כדי למזער את הסבל פוטנציאלי.

1. טיפול PKI

הערה: זה הוא אופציונלי, אבל מומלץ ממו-B * 017: 01 tetramers. ראה תוצאות וסעיפי דיון.

  1. Resuspend PBMC במדיום R10 בריכוז של 1.6 x 10 7 תאים / מ"ל.
  2. הוסף 50 μl של השעית תא זה לזרימה המקבילה cytometry צינורות. הוסף 50 μl של פתרון 100 ננומטר של PKI על צינור אחד.
  3. וורטקס צינור אחד. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. עד סוף שנת הזהצעד, כל צינור צריך 100 μl של השעיה תא המכיל 8.0 x 10 5 PBMC ו -50 ננומטר של PKI.
  4. המשך לשלב מכתים tetramer pMHC-לי.

2. מכתים עם שכותרתו Fluorochrome pMHC-לי Tetramers

  1. לפני הכנת pMHC-לי tetramer תערובת הורים, צנטריפוגה צינורות tetramer pMHC-I ב -20,000 XG לפחות 15 דקות ב 4 ° C. מטרת צעד זה היא גלולה אגרגטים חלבון בתמיסה tetramer pMHC-לי שעלולים להגביר מכתים רקע. לאחר הצעד צנטריפוגה נעשה, להימנע pipetting מהחלק התחתון של הצינור שבו אגרגטים חלבון צברו.
  2. הכן מספיק לערבב מאסטר tetramer pMHC-לי להכתים את כל הצינורות הניסיונות. כן עודף של 15% מהנפח הכולל של תערובת אמן זה לחשבון pipetting שגיאה.
  3. לדלל tetramers pMHC-לי במאגר כתם (למשל, הצפת כתם מבריקה), כך 25 μl של תמהיל pMHC-לי tetramer האב הוא אדהד כל בדיקה.
    1. לייבל PBMC עם שני tetramers pMHC-לי לכל מבחן; אחד מצומדות כדי allophycocyanin (APC), ואת הקצה השני מבריק ויולט (BV) 421.
  4. להוסיף 8.0 x 10 5 PBMC לזרימה המקבילה cytometry צינור בנפח סופי של 100 μl. אם התאים היו נתונים לטיפול PKI שתואר לעיל, הם צריכים להיות resuspended כבר 100 μl בשלב זה.
  5. הוסף 25 μl של pMHC-לי tetramer תערובת אמן לזרימה המקביל cytometry צינורות. עד סוף שלב זה, הכרך האחרון בצינור אחד צריך להיות 125 μl.
  6. וורטקס צינור אחד כדי homogenize השעית התא.
  7. דגירה בחושך בטמפ 'החדר למשך 45 דקות. הכן את קוקטייל מב מכתים השטח במהלך הדגירה 45 דקות זה.

מכתים Surface 3.

  1. הכין תערובת מאסטר מב מספיק כדי להכתים את כל הצינורות הניסיונות. כן עודף של 15% מהנפח הכולל של תערובת אמן זה לתת דין וחשבוןpipetting שגיאה.
  2. כוון את עוצמת הקול של מיקס מאסטר עם חיץ כתם כך 50 μl מתווספים לכל מבחן.
  3. לקבלת הדרה ראויה של אי-CD8 + T-תאי תיחום של תת זיכרון, שימוש טיטרציה כמויות של מבז המכוון נגד המולקולות הבאות מיקס מאסטר מכתים פני שטח.
    הערה: fluorochromes מצומדות לכל מבז ניתנים כהפניה: CD14 BV 510, CD16 BV 510, CD20 BV 510, CD8α BV 785, CD28 PE Cy7, ו CCR7 FITC. ראוי לציין, כי מבז נגד CD14, CD16, CD20 ו הם מצומדות לאותו fluorochrome (כלומר, BV 510) שכן הם ייכללו השער "להיפטר".
  4. כלול לצבוע fixable חדות-הבחנה תאים מתים בתמהיל מאסטר מכתים משטח [כלומר, לצבוע תגובתי אמין (ARD)]. ודא כי מגיב ARD הוא מצומדות כדי fluorochrome עם ספקטרום פליטה דומה כמו אלה המשמשים את השער "להיפטר". במקרה זה, להשתמש ARD אקווה.
  5. הוסף 50 μl שלמיקס מאסטר המכתים מתואר 3.1-3.4 לזרימה המקבילה cytometry צינורות. עד סוף שלב זה, הכרך האחרון בצינור אחד צריך להיות 175 μl.
  6. וורטקס צינור אחד. דגירה בחושך בטמפ 'החדר למשך 25 דקות.
  7. שטפו תאים עם חיץ לשטוף (פתרון PBS המכיל 0.1% אלבומין בסרום שור ו 0.45 גר '/ ל NaN 3).
    זהירות: אזיד הנתרן הוא חומר רעיל. חשיפה אפילו כמויות זעירות יכולה לגרום לסימפטומים. ידית חומר זה על פי ההנחיות המפורטות על ידי בריאות הסביבה ובטיחות (EHS) Office במוסד שבו ניסויים אלה מבוצעים.
  8. צינורות צנטריפוגה ב 510 XG במשך 5 דקות. בזהירות למזוג supernatant לתוך מיכל פסולת נפרד. הקפד לא להפריע גלולה.
    זהירות: אין למזוג לשטוף חיץ supernatant לתוך מאגרים המכילים אקונומיקה כפי שהוא יכול להגיב עם ההווה יזיד הנתרן למאגר לשטוף לגרום להיווצרות של גז רעיל 34. Contact משרד EHS במוסד שבו ניסויים אלה מבוצעים על הנחיות כיצד להיפטר יזיד הנתרן.
  9. לאחר decanting, מערבולת התאים בנוזל שאריות שמר בצינור אחד.

קיבוע תא 4.

  1. הוסף 250 μl של פתרון paraformaldehyde 2% (PFA) לכל הצינורות לתקן את התאים.
    זהירות: PFA הוא חומר רעיל. חשיפה אפילו כמויות זעירות יכולה לגרום לסימפטומים. ידית חומר זה על פי ההנחיות המפורטות על ידי משרד EHS במוסד שבו ניסויים אלה מבוצעים.
    1. מאז הפתרון 2% PFA חייב להיות שוה אל התאים, להשתמש PBS להכין פתרון זה. מאה מיליליטר של פתרון 2% PFA מספיק ניסויים מרובים. ביסודיות מערבולת כל הצינורות מיד לאחר תוספת של 2% PFA כדי למנוע היווצרות של אגרגטים התא.
  2. דגירה בחושך ב 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות.
  3. Wתאי אפר ידי חזרה על שלבי 3.7-3.9. לאחר שלב זה הושלם, התאים ניתן לאחסן בחושך על 4 מעלות צלזיוס במשך 24-48 שעות. לפני שאתה ממשיך לשלב Permeabilization, מערבולת הצינורות ביסודיות.

5. Permeabilization של תאים

  1. הוסף 500 μl של חיץ permeabilization. וורטקס כל הצינורות.
  2. דגירה בחושך בטמפ 'החדר למשך 10 דקות.
  3. שטפו תאים על ידי חזרה על שלבים 3.7-3.9.

6. תאיים מכתימים

  1. הכין תערובת מאסטר מב מספיק כדי להכתים את כל הצינורות הניסיונות.
  2. כוון את עוצמת הקול עם PBS או כתם חיץ כך 50 μl של מיקס מאסטר מב התאי מתווספים לכל מבחן.
  3. מכינים את תערובת מאסטר מב המתוארים 6.1 ו -6.2 באמצעות טיטרציה כמויות של מבז המכוונים נגד CD3 ו Gzm B.
    הערה: מעורבות TCR ידי tetramers pMHC-אני יכול לגרום הפנמה CD3, אשר יכול להפריע איתור של tetramer + CD3 + CD8 +תאי T אם מב אנטי CD3 מתווסף מיקס מאסטר משטח מכתים. כדי למנוע זאת, להוסיף את מב אנטי CD3 בשלב זה, כלומר, לאחר התאים permeabilized. Fluorochromes מצומדות לכל מב מפורטים כהפניה: CD3 PerCP Cy5.5 ו Gzm B PE.
  4. הוסף 50 μl של קוקטייל מב אל הצינורות המקבילים. דגירה בחושך בטמפ 'החדר למשך 30 דקות.
  5. שטפו תאים על ידי חזרה על שלבים 3.7-3.9. הצינורות מוכנים להירכש cytometer זרימה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול המתואר כאן נעשה שימוש כדי לקבוע את הפנוטיפ הגודל וזיכרון של נגרמת חיסון, Gag CM9 ספציפי תגובות CD8 + T-cell בתוך מקוק ממו-A1 * 001 + רזוס. לניתוח זה, tetramer APC-מצומדות ממו-A1 * 001 / Gag CM9 שימש בהרכב מכתים תזרים cytometric 8 צבעים. איור 1 א - F מציג את האסטרטגיה gating להשתמש כדי לנתח את הנתונים, שאמור להיות מיושם הן tetramers נוכח כל בדיקה. ראוי לציין, כי tetramer pMHC-I + CD8

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כמה צעדים שידונו בו הליך זה כיוון שהן חיוניות על כניעתה תוצאות אופטימליות. ראשית, מאז איכות הדגימות הביולוגיות היא מנבא חזק של ההצלחה של כל assay תזרים cytometric 38, כל הטיפול יש לנקוט כדי להבטיח כי התאים הם קיימא וב ההשעיה במהלך ההליך המכתים. זה רלוונטי במיוחד כאשר עובדים עם דגימות cryopreserved שכן הם נוטים יותר בצעדים כבדים בדרך כלל מכילים מספרים גבוהים יותר של תאים מתים. במקרים אלה, להעביר את השעית התא דרך מסננת תא 70 מיקרומטר לפני הליך תיוג tetramer pMHC-I עשוי לש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ברצוננו להודות דוד ווטקינס לתמיכה בניסויים שאפשרו אופטימיזציה של המתודולוגיה הנוכחית. מחקר מדווח בפרסום זה מומן בחלקו על ידי מענק טייס שמספק מרכז מיאמי לאיידס מחקר של המכון הלאומי לבריאות בארה"ב תחת מספר פרסי P30AI073961. התוכן הוא באחריות בלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של מכוני הבריאות הלאומיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
DasatinibAxon medchemAxon  1392יש להשעות מחדש ב-DMSO ולאחסן מיד ב-20 מעלות; C
RPMI עם Glutamaxgibco/ Life Technologies61870-036יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C 
FBSgibco/ Life Technologies10082-147מושבת בחום יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C 
פניצילין-סטרפטומיצין-אמפוטריצין BLonza17-745Eיש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C 
DMSO,טכנולוגיות חייםD12345יש לאחסן בטמפרטורת החדר.
5 מ"ל צינורות פוליפרופילן תחתונים עגוליםVWR60819-728
טטרמרים pMHC-I מצומדים פלואורוכרוםNIH Tetramer Core או MBL, Inc.יש לאחסן ולתחזק בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס צנטריפוגה בטמפרטורה של 20,000 x גרם למשך 15 דקות לפני השימוש. אין להקפיא.
mAbs מצומד פלואורוכרוםחברותבטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. אין להקפיא.
חי/מת  מים ניתנים לתיקון  מתים  ערכת כתמי תאיםLife Technologiesl34957חייבת להיות מאוחסנת בטמפרטורה של -20 & מעלות צלזיוס. l של DMSO לפני השימוש.
חוצץ כתמים מבריקBD Biosciences563794יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C 
פוספט חוצץ מלחVWR97064-158יש לאחסן בטמפרטורת החדר
אלבומין בקרVWR700011-230יש לאחסן ב   4 & deg; C 
נתרן אזידVWR97064-646יש לאחסן בטמפרטורת החדר. חומר רעיל. אין לערבב עם אקונומיקה.
אקונומיקהVWR89501-620כימיקל מאכל, לא ניתן לערבב עם נתרן אזיד. טפל בזהירות
ParaformaldehydeElectron Microscopy Sciences15714-Sמגיב דליק, קורוזיבי ורעיל. יש לטפל בזהירות
Polysorbate 20 (Tween-20)Alfa AesarL15029יש לאחסן בטמפרטורת החדר
תמיסת פרמיביליזציה 2 BD Biosciences340973מגיב רעיל וקורוזיבי. לטפל בזהירות
צינורות Sarsdet 1.5 מ"ל בורג עליוןVWR72.692.005
2.0 מ"ל DNA/RNA צינורות כריכה נמוכהEppendorf22431048השימוש במיקרו-צינורות סטריליים מועדף 
מערבל מערבולתלשיקול דעתו
קבינט בטיחות ביולוגית לפי שיקול דעתו של המדען
Milli Q מערכת טיהור מים בין-גרליתEMD MilliporeZRXQ010WWמים בדרגת ביולוגיה מולקולרית מכל ספק ניתן להשתמש
במיקרוצנטריפוגהלשיקול דעתו של המדען
צנטריפוגהלשיקול דעתו של מדען
4 & deg; C  מקררלפי שיקול דעתו של המדען
BD LSR IIBD Biosciencesציטומטר זרימה חייב להכיל לייזרים ומסננים התואמים ללוח הצביעה בו נעשה שימוש.
רדיד אלומיניום מים
VWR SCIENTIFIC INC.89068-738
החממהחייבת להיות מסוגלת לשמור על 37 מעלות; C  טמפרטורה פנימית
תוכנת FACS DivaBD Biosciences
תוכנת Flowjo גרסה 9.6Flowjoמשמשת לניתוח קבצי FCS שנוצרו על ידי תוכנת FACS Diva
קצות
נטולות מים יש לאחסן ולתחזק שונות של המדעןנטול יונים Micropippette

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Parham, P. Antigen Recognition by T Lymphocytes. The Immune System, 3rd ed. Foltin, J., Masson, S., Ghezzi, K., Engels, A., Lawrence, E., Jeffcock, E. , Garland Science, Taylor & Francis Group, LLC. New York, NY. 125-154 (2009).
  2. Doherty, P. C. The tetramer transformation. J Immunol. 187 (1), 5-6 (2011).
  3. Masopust, D., Vezys, V., Wherry, E. J., Ahmed, R. A brief history of CD8 T cells. Eur J Immunol. 37, Suppl 1 103-110 (2007).
  4. Murali-Krishna, K., et al. Counting antigen-specific CD8 T cells: a reevaluation of bystander activation during viral infection. Immunity. 8 (2), 177-187 (1998).
  5. Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
  6. Davis, M. M., Altman, J. D., Newell, E. W. Interrogating the repertoire: broadening the scope of peptide-MHC multimer analysis. Nat Rev Immunol. 11 (8), 551-558 (2011).
  7. Walker, B., McMichael, A. The T-cell response to HIV. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (11), (2012).
  8. Borrow, P., Lewicki, H., Hahn, B. H., Shaw, G. M., Oldstone, M. B. Virus-specific CD8+ cytotoxic T-lymphocyte activity associated with control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 infection. J Virol. 68 (9), 6103-6110 (1994).
  9. Koup, R. A., et al. Temporal association of cellular immune responses with the initial control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 syndrome. J Virol. 68 (7), 4650-4655 (1994).
  10. Gray, C. M., et al. Frequency of class I HLA-restricted anti-HIV CD8+ T cells in individuals receiving highly active antiretroviral therapy (HAART). J Immunol. 162 (3), 1780-1788 (1999).
  11. Papagno, L., et al. Comparison between HIV- and CMV-specific T cell responses in long-term HIV infected donors. Clin Exp Immunol. 130 (3), 509-517 (2002).
  12. Spiegel, H. M., et al. Human immunodeficiency virus type 1- and cytomegalovirus-specific cytotoxic T lymphocytes can persist at high frequency for prolonged periods in the absence of circulating peripheral CD4(+) T cells. J Virol. 74 (2), 1018-1022 (2000).
  13. Loffredo, J. T., et al. Patterns of CD8+ immunodominance may influence the ability of Mamu-B*08-positive macaques to naturally control simian immunodeficiency virus SIVmac239 replication. J Virol. 82 (4), 1723-1738 (2008).
  14. Migueles, S. A., et al. HLA B*5701 is highly associated with restriction of virus replication in a subgroup of HIV-infected long term nonprogressors. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (6), 2709-2714 (2000).
  15. Valentine, L. E., et al. Infection with "escaped" virus variants impairs control of simian immunodeficiency virus SIVmac239 replication in Mamu-B*08-positive macaques. J Virol. 83 (22), 11514-11527 (2009).
  16. Day, C. L., et al. PD-1 expression on HIV-specific T cells is associated with T-cell exhaustion and disease progression. Nature. 443 (7109), 350-354 (2006).
  17. Trautmann, L., et al. Upregulation of PD-1 expression on HIV-specific CD8+ T cells leads to reversible immune dysfunction. Nat Med. 12 (10), 1198-1202 (2006).
  18. Mudd, P. A., Watkins, D. I. Understanding animal models of elite control: windows on effective immune responses against immunodeficiency viruses. Curr Opin HIV AIDS. 6 (3), 197-201 (2011).
  19. Valentine, L. E., Watkins, D. I. Relevance of studying T cell responses in SIV-infected rhesus macaques. Trends Microbiol. 16 (12), 605-611 (2008).
  20. Allen, T. M., et al. Characterization of the peptide binding motif of a rhesus MHC class I molecule (Mamu-A*01) that binds an immunodominant CTL epitope from simian immunodeficiency virus. J Immunol. 160 (12), 6062-6071 (1998).
  21. Allen, T. M., et al. CD8(+) lymphocytes from simian immunodeficiency virus-infected rhesus macaques recognize 14 different epitopes bound by the major histocompatibility complex class I molecule mamu-A*01: implications for vaccine design and testing. J Virol. 75 (2), 738-749 (2001).
  22. Kaizu, M., et al. Molecular typing of major histocompatibility complex class I alleles in the Indian rhesus macaque which restrict SIV CD8+ T cell epitopes. Immunogenetics. 59 (9), 693-703 (2007).
  23. Loffredo, J. T., et al. Identification of seventeen new simian immunodeficiency virus-derived CD8+ T cell epitopes restricted by the high frequency molecule, Mamu-A*02, and potential escape from CTL recognition. J Immunol. 173 (8), 5064-5076 (2004).
  24. Loffredo, J. T., Valentine, L. E., Watkins, D. I. Beyond Mamu-A*01+ Indian Rhesus Macaques: Continued Discovery of New MHC Class I Molecules that Bind Epitopes from the Simian AIDS Viruses. HIV mol immunol. 2007, 29-51 (2006).
  25. Loffredo, J. T., et al. Two MHC class I molecules associated with elite control of immunodeficiency virus replication, Mamu-B*08 and HLA-B*2705, bind peptides with sequence similarity. J Immunol. 182 (12), 7763-7775 (2009).
  26. Mothe, B. R., et al. Characterization of the peptide-binding specificity of Mamu-B*17 and identification of Mamu-B*17-restricted epitopes derived from simian immunodeficiency virus proteins. J Immunol. 169 (1), 210-219 (2002).
  27. Miller, M. D., Yamamoto, H., Hughes, A. L., Watkins, D. I., Letvin, N. L. Definition of an epitope and MHC class I molecule recognized by gag-specific cytotoxic T lymphocytes in SIVmac-infected rhesus monkeys. J Immunol. 147 (1), 320-329 (1991).
  28. Kuroda, M. J., et al. Analysis of Gag-specific cytotoxic T lymphocytes in simian immunodeficiency virus-infected rhesus monkeys by cell staining with a tetrameric major histocompatibility complex class I-peptide complex. J Exp Med. 187 (9), 1373-1381 (1998).
  29. Otting, N., et al. Unparalleled complexity of the MHC class I region in rhesus macaques. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (5), 1626-1631 (2005).
  30. Martins, M. A., et al. Vaccine-Induced Simian Immunodeficiency Virus-Specific CD8+ T-Cell Responses Focused on a Single Nef Epitope Select for Escape Variants Shortly after Infection. J Virol. 89 (21), 10802-10820 (2015).
  31. Mudd, P. A., et al. Vaccine-induced CD8+ T cells control AIDS virus replication. Nature. 491 (7422), 129-133 (2012).
  32. Lissina, A., et al. Protein kinase inhibitors substantially improve the physical detection of T-cells with peptide-MHC tetramers. J Immunol Methods. 340 (1), 11-24 (2009).
  33. Weatherall, D. The use of non-human primates in research. A working group report. , 152(2006).
  34. Betterton, E. A., Lowry, J., Ingamells, R., Venner, B. Kinetics and mechanism of the reaction of sodium azide with hypochlorite in aqueous solution. J Hazard Mater. 182 (1-3), 716-722 (2010).
  35. Picker, L. J., et al. IL-15 induces CD4 effector memory T cell production and tissue emigration in nonhuman primates. J Clin Invest. 116 (6), 1514-1524 (2006).
  36. Dolton, G., et al. More tricks with tetramers: a practical guide to staining T cells with peptide-MHC multimers. Immunology. 146 (1), 11-22 (2015).
  37. Wooldridge, L., Lissina, A., Cole, D. K., vanden Berg, H. A., Price, D. A., Sewell, A. K. Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide-MHC. Immunology. 126 (2), 147-164 (2009).
  38. Roederer, M., et al. FACS Analysis of Leukocyes. Weir's Handbook of Experimental Immunology, 5th ed. Herzenberg, L. A., Weir, D. M., Blackwell, C. , Blackwell Science. Boston. 1-49 (1996).
  39. Colantonio, A. D., et al. KIR polymorphisms modulate peptide-dependent binding to an MHC class I ligand with a Bw6 motif. PLoS Pathog. 7 (3), e1001316(2011).
  40. Schafer, J. L., et al. Suppression of a Natural Killer Cell Response by Simian Immunodeficiency Virus Peptides. PLoS Pathog. 11 (9), 1005145(2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

CD8 T SIVTPBMCI MHC

מאמרים קשורים