מאמר שיטה

שילוב רטוב טכניקות מעבדה יבשות כדי להנחות את ההתגבשות של חלבונים מפותל, סליל גדולים המכיל

DOI:

10.3791/54886

⸱

6 בינואר 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Pittsburgh, 2Institute of Structural Biology, German Research Center for Environmental Health

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים מסגרת המשלבת ניתוח ביוכימי וחישובי פשוט כדי להנחות את האפיון וההתגבשות של תחומי סליל מפותלים גדולים. ניתן להתאים מסגרת זו לחלבונים כדוריים או להרחיב אותה כדי לשלב מגוון טכניקות בעלות תפוקה גבוהה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השגת גבישים לקביעת מבנה יכולה להיות הצעה קשה וגוזלת זמן עבור כל חלבון. חלבונים ותחומים של סליל מפותל נמצאים ברחבי הטבע, אולם בגלל תכונותיהם הפיזיקליות ונטייתם לצבור, הם נתפסים באופן מסורתי כקשים במיוחד לגיבוש. כאן, אנו משתמשים במגוון טכניקות מהירות ופשוטות שנועדו לזהות סדרה של גבולות תחום אפשריים עבור חלבון סליל מפותל נתון, ולאחר מכן לאפיין במהירות את התנהגות החלבונים הללו בתמיסה. עם תוספת של תג פלואורסצנטי חזק (mRuby2), אפיון החלבון הוא פשוט ופשוט. ניתן לדמיין בקלות את חלבון המטרה בתאורה רגילה וניתן לכמת אותו באמצעות הדמיה מתאימה. המטרה היא לזהות במהירות מועמדים שניתן להסיר מצינור ההתגבשות מכיוון שהם לא צפויים להצליח, מה שמאפשר יותר זמן למועמדים הטובים ביותר ופחות כספים שמושקעים בחלבונים שאינם מייצרים גבישים. ניתן לחזור על תהליך זה כדי לשלב מידע שהושג ממאמצי סינון ראשוניים, ניתן להתאים אותו להליכי ביטוי וטיהור בתפוקה גבוהה, והוא מוגבר על ידי סינון רובוטי להתגבשות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קביעת מבנה באמצעות קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן תרם תרומות היסוד לכל תחום הביולוגיה המודרנית; מתן נוף אטומי של מקרומולקולות תומכי חיים וכיצד הם פועלים אחד עם השני במגוון קשרים; מה שמאפשר לנו להבין את המנגנונים שגורמים הזדמנויות מחלה ומתן לתכנן תרופות לטיפול במחלות באופן רציונלי. קריסטלוגרפיה כבר זמן רב בטכניקה הניסויית הדומיננטית לקביעת מבנה macromolecular, וכיום מהווה 89.3% של מסד הנתונים המבניים (www.rcsb.org). טכניקה זו יש יתרונות רבים, לרבות הסכנה האפשרית ברזולוציה גבוהה מאוד, את היכולת לדמיין מקרומולקולות עם מגוון רחב של גדלים, איסוף נתונים קל יחסית, ואת ההזדמנות כדי להמחיש כיצד מקרומולקולה אינטראקציה עם ממס וכן הליגנדים.

למרות שיפורים טכנולוגיים רבים בביטוי חלבון רקומביננטי 1,2, PURification 3, וביולוגיה מולקולרית המשמשת לייצור מערכות אלה 4, המכשול הגדול ביותר בתהליך crystallographic נשאר היכולת לצמוח גבישים באיכות עקיפה. זה היה נכון במיוחד עבור חלבונים אשר מכילים תחומים מפותל-סליל גדול. הערכה הוא כי ככל 5% מכלל חומצות אמינו נמצאים בתוך מפותל, סליליים 5,6, כך שתכונה זו יישאר 7 מבנית מאוד נפוצה, עדיין חלבונים אלה הם בדרך כלל יותר קשים לטהר להתגבש מאשר חלבונים כדוריים 8-10 . זה מורכב עוד יותר בשל העובדה כי תחומים סליל מפותל נמצאים לעתים קרובות בהקשר של חלבון גדול יותר, ולכן כראוי מנבאים את גבולות תחומים אלה היא קריטית כדי למנוע הכללת רצף מובנה או גמיש כי הוא לעתים קרובות מזיק לתהליך גיבושו.

כאן אנו מציגים מסגרת מושגית שילוב חישובית מבוסס אינטרנט מנתח עם experimentaנתוני l מהספסל, כדי לסייע למשתמשי מדריך דרך בשלבים הראשונים של תהליך crystallographic כוללים: כיצד לבחור מקטעי חלבון (ים) ללימודים מבניים, וכיצד להכין ולאפיין דגימות חלבון לפני ניסיונות התגבשות. המחקר הנוכחי על שני חלבונים המכילים תחומים מפותל-סליל גדול, Shroom (SHRM) ו Rho-kinase (רוק). חלבונים אלה נבחרו שניהם מכילים תחומי סליל מפותל וידועים לגבש 11-16 מורכבים רלוונטיים מבחינה ביולוגית. Shroom ו Rho-kinase (רוק) הם חזו מכילים ~ 200 ו 680 שאריות של סליל מפותל בהתאמה, רבי חלקים אשר מתאפיינים מבני 17-20. השיטה המתוארת כאן מספקת זרימת עבודה יעילה לזהות שברים במהירות של חלבון המכיל סליל מפותל כי יהיו מוכנים לשתף פעולה עבור התגבשות, אולם, הטכניקות המתוארות ניתן להתאים בקלות עבור רוב החלבון או חלבון מתחמים או שונות לשלב approa תפוקה גבוההצ 'ס כזמין. לבסוף, שיטות אלה הן זולות בדרך כלל יכולות להתבצע על ידי משתמש כמעט בכל רמות הניסיון.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: תרשים של המסגרת המושגית או העבודה מתוארת באיור 1 לעיון. הפרוטוקול יכול להיות בחלוקה לארבעה שלבים: תחזיות מבוססות חישובית או רצף, ביטוי חלבון וטיהור, אפיון ביוכימי, וגיבוש. הדוגמות הראו לנתח תחומי Shroom SD2 ו / או מתחמי Shroom-רוק, אבל יכולות להיות מנוצלות עם חלבון כלשהו.

1. השתמש הוקם כלים מבוססי אינטרנט ליצירת חיזויים חישובית של גבולות דומיין סלילי-סליל

  1. אסוף למערך אבולוציונית מגוון של הרצף homologs.
    1. עבור אל www.uniprot.org באמצעות הקלדת Shroom בשורת החיפוש העליון.
    2. רצפים בחרו להוריד על ידי סימון התיבה לצד מספר הצטרפותן. רצפים עם כוכב עולים רצפים נסקרו על ידי Uniprot והם בדרך כלל אמינים יותר. תשמור על מנת להבטיח שכל הרצפים הם מלאים ומדויקים.
    3. שמור את הים שנבחרequences ידי לחיצה על לחצן הורד.
    4. יישר את אוסף של רצפים Shroom באמצעות Clustal-אומגה 21 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/). לחצו על כפתור "עיון" כדי לבחור את הקובץ עם רצפים Shroom ולאחר מכן דחף שלח.
    5. לאחר היישור הושלם, לחץ על כפתור "הורד יישור קובץ".
    6. פתח את יישור הרצף הנפוץ שנוצר 1.1.5 באמצעות Jalview (קובץ | קלט מערך | מקובץ). בתוך חלון היישור החדש, הצבע על ידי זהות (צבע | אחוז הזהות).
  2. חישוב תחזיות של מבנה משני, תחזיות של רצף גמיש או לא תקין וחזה אזורים-סליל מפותל בתוך החלבון (ים) של עניין.
    1. עבור אל http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi, לחשב תחזיות המתקפלים-Coil. העתק והדבק את הרצף לתוך תיבת הרצף ולחץ על שלח.
      הערה: ניתוח זה יכול לקחת כמה שעות כדי complete. מאז רצפים Shroom הם גדולים למדי, רצפים ייתכן שיהיה צורך לפצל לגושים של פחות מ -1,000 חומצות אמינו כדי להתאים בתוך מגבלת הגודל של האינטרנט. כשמנתחים Shrm2, מומלץ כי בטרמינל C-1000 חומצות אמינו משמשות סעיף זה כולל את תחום SHRM SD2 אשר ידוע מכילים אזורים סליל מפותל. כאשר חוזר ניתוח זה עם חלבונים אחרים, מומלץ להשתמש רצפי חלבונים באורך מלא במידת האפשר. אם כי היא לא אופציה, השתמש שהבר הגדול ככל האפשר או לנתח את הרצף מבוסס על נתונים ביוכימיים או תפקודיים ידועים.
    2. עבור אל http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi, לחשב תחזיות המתקפלים-Coil. העתק והדבק את הרצף לתוך תיבת הרצף ולחץ על שלח.
  3. מערבבים את התוצאות של צעדים 1.1 ל 1.2.2 לתוך ביאור מקיף יחיד של רצף Shroom.
    הערה: אנו מעודדים מאוד כדי לכלול גם את וכל מה שאני הרלוונטייםnformation כי ניתן ללמוד מן הספרות או ממקורות אחרים על תפקוד החלבון או טיהור בשלב זה.
  4. באמצעות רצף מבואר מקיף זה, לחזות גבולות תחום (או סדרה של גבולות האפשר) של החלבון, מנסה למקסם שימור וחזה תכונות מבניות תוך מזעור כמות רצף סדר או גמיש. אם ידוע, החלבון וכתוצאה מכך צריך לשמור על תכונות פעילות של עניין.

2. אקספרס וחלבונים לטהר עם גבולות הדומיין שזוהו בסעיף 1

הערה: מטרת סעיף זה היא להשתמש שורה של מבחנים מהירים לכימות בקלות להקרין גבולות תחום היפותטי שנוצרו בסעיף 1.

  1. שימוש בטכניקות ביולוגיה מולקולריות רגילות, ליצור פלסמיד ביטוי עם רצף הקידוד הרצוי מסגרת בתוך פלסמיד 10 -mRuby2-XH2 שלו (ראה איור 3 עבור מפת הווקטורnd לפרטים נוספים).
  2. רמות הביטוי מבחן עבור כל פלסמיד ביטוי באמצעות BL21 (DE3) E. coli או זן ביטוי מתאים אחר במדיה autoinduction 1 בטמפרטורת החדר למשך 18-24 שעות.
    1. Transform פלסמידים ביטוי וכן פקד פלסמיד ריק לתוך BL21 (DE3) בעקבות ההוראות מצורפות התאים או באמצעות פרוטוקול טרנספורמציה חזק, כמו זה כאן (https://www.addgene.org/plasmid-protocols/bacterial -transformation /).
    2. מהצלחת טרי טרנספורמציה, פיק מושבה אחת ולגדול תרבות המתנע 5 מ"ל ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה ב Lysogeny מרק (LB) בתקשורת עם 34 מיקרוגרם / מ"ל ​​kanamycin.
    3. למחרת, גלול התרבות לשטוף את הכדור עם LB. הטרי
    4. מוסיפים את תרבות המתנע 50 מ"ל של התקשורת autoinduction עם 34 מיקרוגרם / מ"ל ​​kanamycin. אפשר התרבות לגדול ל רוויה או בטמפרטורת חדר או 37 מעלות צלזיוס. בדרך כלל, לגדול במשך ~ 18-24 שעות.
    5. תא גלולים ולהקפיא את כדורי תא וכתוצאה מכך ב -80 ° C ללא הגבלת זמן לפני טיהור.
    6. השוואת תמציות תא כולו מכל זן ביטוי לבין בקרת הווקטור הריקה על ידי SDS-PAGE כדי לקבוע את המתח בצורה המועילה ביותר, מייצר את חלבון ההיתוך הרצוי. עבור שלו 10 -mRuby2-Shroom חלבונים היתוך SD2, לרוץ 10% ג'ל SDS-PAGE ב 180 V עבור ~ 50 דקות או עד בחזית לצבוע מגיע לתחתית הג'ל 22.
    7. ג'ל הכתם עם Coomassie כחול לדמיין חלבונים תאיים הכולל בתוך כל זן 23.
  3. בצע צעד כרומטוגרפיה זיקה ראשוני על כל זן שבטא בהצלחת חלבון mRuby2-פיוז'ן. בדרך כלל, לבצע טיהור שלבים 2.3.2-2.3.7 בטמפרטורת החדר, אלא אם כן חלבון יהנה בנסיבות משתנות כגון טיהור על 4 מעלות צלזיוס.
    1. כדורי תא הפשרה משלבים 2.2.5.
    2. Resuspend כל גלולה תא ב 1.5 מ"ל של חיץ תמוגה (גליצרול 10%, 500 מ"מ NaCl, 40imidazole מ"מ, 20 מ"מ טריס pH8.0, 1 מ"מ בטא mercaptoethanol). מוסף למאגר תמוגה עם מעכבי פרוטאז על פי הצורך.
    3. הוסף 30 μl של 10 מ"ג / מ"ל ​​ליזוזים ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. Sonicate ביצוע ההוראות עבור המכשיר בשימוש.
    4. העבר לתוך צינור 1.5 מ"ל ו צנטריפוגות בצנטריפוגה בראש הטבלה במשך 30 דקות ב 14,000 XG כדי גלולה חומר מסיס או תאים unlysed. שמור הן supernatant ו גלולה לניתוח שלאחר מכן באמצעות SDS-PAGE.
    5. בצע טיהור זיקת ניקל, דוגרי השבר המסיס עם 100 μl של חרוזי Ni-נת"ע. דגירה חרוזה עם lysate המסיס למשך 5-10 דקות, היפוך מספר פעמים כדי לערבב חרוזים.
    6. צנטריפוגה ב 800 XG במשך 30 שניות בצנטריפוגה השולחן כדי גלולה את החרוזים. בצע את זה על ידי שטיפה הגלולה 3-5 פעמים עם חיץ תמוגה לנקות מזהמים שאינם ספציפיים.
    7. Elute רובי היתוך חלבון מן החרוזים עם חיץ תמוגה בתוספת 1imidazole M.
    8. השתמש SDS-PAGE כדי להשוות את ההתנהגות של חלבונים-mRuby2-Shroom שלו בתחום הטיהור "מהיר ומלוכלך" לעיל.

3. מדגם חלבון לאפיין לזהות את אלה עם מאפייני יתרון

  1. להשתמש במערך ספקטרופוטומטר ב 280 ננומטר למדוד את הריכוז של חלבון היתוך רובי, ולאחר מכן להעריך את ההומוגניות של המדגם על ידי טעינת 1-5 מיקרוגרם של חלבון היתוך על ג'ל עמוד יליד 24. הרץ את הג'ל עמוד Native 10% ב 4 מעלות צלזיוס במשך 140 דקות ב 175 V.
    1. תמונת מקשי PAGE הילידים באמצעות תרמי המצויד לדמיין קרינה, התבוננות שבו ההיתוך מתויג mRuby נודד assay זה.
      הערה: היזהר להתבונן חלבון היתוך כי תקוע גם חלבון זה נאסף סביר. אם תרמי קרינה אינו זמין, ניתן לעתים קרובות לדמיין דגימות מרוכזות תמונה של רובה מתויגות חלבון תחת אור שחור או עם תיבת אור UV.
  2. בצע proteolysis מוגבלת לזהות תחומים מקופל ביציבות. דגירה 95 μl של היתוך SD2 רובי-SHRM ב ~ 1 מ"ג / מ"ל ​​עם 5 μl של א סבטיליזין 0.025%
    1. בואו לטעום את התגובה בנקודות זמן של 0, 0.5, 2, 5, 15, 60, ו -120 דקות, הסרת 10 μl מן התגובה לכל נקודת זמן לדמיין את התקדמות התגובה באמצעות SDS-PAGE באמצעות ג'ל acrylamide 15% .
    2. הכתם עם Coomassie כחול כמו בשלב 2.2.7 ולהעריך אם זן עמיד פרוטאז ניתן לזהות.
  3. שלב נתוני יעילות הטיהור, התנהגות עמוד מקומי, proteolysis המוגבלת על חלבוני ההיתוך mRuby2-Shroom מטוהר חלקית לתוך הערכה מקיפה של כל התופעות הכוללות של החלבונים האלה פתרון.
    1. (אופציונלי) אם assay פונקציונלי מתאים זמין, בדוק אם בוצעה פעילות בשלב זה.

4. הפקת גבישים באיכות גבוהה של סלילי-סליל SD2דומיין מ Shroom

הערה: כל השלבים שונים בסעיף 4.1 מבוצעים בטמפרטורת חדר אלא אם החלבון ירוויח טיהור בטמפרטורה שונה, בדרך כלל 4 מעלות צלזיוס.

  1. באמצעות 50 מ"ל גידולים כמו הערכה גסה הביטוי ופוטנציאל טיהור, לבצע ביטויים בקנה מידה גדול של SD2 mRuby2-Shroom עם המטרה של השגת 5-20 מ"ג של המדגם מטוהרים לחלוטין. בדרך כלל 2 L של התרבות מספק חומר-מוצא נאות. לאחר תאים גלולי צמיחה על ידי צנטריפוגה ב 8000 XG במשך 10 דקות.
    1. Resuspend גלולה מהגידול 2 L במאגר תמוגה כמו קודם, באמצעות ~ 2 מ"ל של תמוגה לגרם של התא גלולה קפוא אם באמצעות ליזוזים עבור תמוגה. לחלופין, גלולה ב ~ 8 מ"ל / g של גלולה אם באמצעות homogenizer או בעיתונות הצרפתית. גלולת פסולת הסלולר באמצעות צנטריפוגה ב 30,000 XG במשך 30 דקות.
    2. אצווה לאגד את השבר מסיס מ 4.1.1 באמצעות 10 מ"ל של שרף Ni-נת"ע. יוצק לתוך עמודת הכבידה מתאימהולאפשר חלבונים מאוגדים כדי לנקז.
    3. לשטוף שרף 3-5 פעמים עם 40 מ"ל של חיץ תמוגה, ואחריו לשטוף עם חיץ תמוגה שיושלם עד 1 M NaCl.
    4. שרף לשטוף עם 40 מ"ל של חיץ תמוגה בתוספת 80 imidazole מ"מ.
    5. Elute החלבון היתוך רובי-Shroom עם 40 מ"ל של חיץ תמוגה שיושלם עד 1 M imidazole. ידני fractionate החלבון eluted לתוך 4-10 מ"ל שברים.
    6. אשר שברים המכילים חלבון היתוך רובי-Shroom באמצעות 10% SDS-PAGE.
    7. Dialyze שברים המתאים (בדרך כלל שברים 2-4) לתוך גליצרול 8%, 250 מ"מ NaCl, 15 imidazole מ"מ, 20 מ"מ טריס pH8.0, 1 מ"מ β-ME, באמצעות 6-8 צינורות דיאליזה kDa MWCO. הוסף 1 מ"ג של פרוטאז TEV לכל 25-50 מ"ג של חלבון היתוך. Dialyze לילה בטמפרטורת החדר עם ערבוב איטי.
    8. טיהור זיקת ניקל חוזר על שלבי 4.1.2. כדי 4.1.6. תחום Shroom SD2 צריך עכשיו להישאר החלק המאוגד בעוד 10 -mRuby2 שלו יישאר כבולהשרף יימצא שברי elution. אשר זה מכתים באמצעות 12% SDS-PAGE עם Coomassie כחול.
    9. Dialyze שברים המכיל תחום Shroom SD2 ל -8 גליצרול%, 100 מ"מ NaCl, 20 מ"מ טריס pH 8.0, 5 חיץ בטא mercaptoethanol מ"מ לילה.
    10. בצע כרומטוגרפיה אניוני 25 באמצעות FPLC, משחררים עם שיפוע NaCl מן 0.1-1.0 M NaCl. לנתח שברים באמצעות 12% SDS-PAGE.
    11. באמצעות concentrator ספין (MWCO של 10 kDa או יותר תלוי החלבון נלמד), להתרכז שברי שיא ~ 0 מ"ג / מיליליטר, ולאחר מכן לבצע כרומטוגרפיה הדרת גודל 26, וניתוח שברי שיא באמצעות 12% SDS-PAGE.
    12. בריכת שברים שיא dialyze לתוך 20 מ"מ טריס pH 8.0, 50 mM NaCl, 2% גליצרול, 1 מ"מ β-ME, ולהתרכז ל -10 מ"ג / מ"ל ​​לפני התגבשות.
      אופציונלי: במהלך שלב זה, להסיר 5 דגימות μl בריכוזים של 1, 2, 5, ו -10 מ"ג / מ"ל ​​במהלך להתרכז המדגם.הפעל μl עמוד טעינה 2-5 יליד מדגם להסתכל על התנהגות של המדגם במהלך שלב זה.
  2. מסך מערך קטן של 12 תנאים לזהות ריכוז חלבון אופטימלי לניסויי התגבשות. הרכב בתנאים אלה מתואר באיור 7.
    1. באמצעות מגשי התגבשות ירידה 24 גם יושבים, לבצע ניסויי התגבשות בשיטת דיפוזיה אדי, pipetting 500 μl של כל אחד מ -12 התנאים לתוך בארות נפרדות ואחריו טיפות כי בתחילה להכיל 1 μl של פתרון היטב 1 μl של מדגם חלבון על coverslips . אנא ראה 27 לפרטים נוספים על הטכניקה הזו.
    2. במהירות לאטום את המגש עם קלטת ברורה להזיז את המגש בסביבה מבוקרת טמפרטורה מתאימה כי היא רטט חופשי. הטמפרטורה בשימוש יכול להשתנות, אבל 4 ° C, 16 ° C, 20 ° C הם נפוצים למדי.
    3. בדוק את טיפות במגשים במהלך 3 ד הבאays באמצעות מיקרוסקופ במהירות של עד בהגדלה 100X. בסוף תקופת 3 הימים, להבקיע כל טיפה כמכילה לא ממטרים (ברור), משקעי אור, ממטרים כבדים (חום), או גבישים. ריכוז חלבון מתאים אמור להכיל לא יותר מ -6 משקעים כבדים.
    4. באמצעות ריכוז החלבון מזוהה 4.2, מסך מגוון רחב של מסכי התגבשות זמינים מסחרי. השימוש רובוט טיפול או התגבשות נוזלי מאוד במהירויות את התהליך הזה תוך צמצום שגיאות הטיפות. זה דורש הרבה פחות חלבון, כמו גם, המאפשר למשתמש להקרין תנאים נוספים עם מדגם יחיד.
    5. שפר תנאים ראשוניים המזוהים ממסכי רחבה על ידי שיטתי משתנה כל אחד מהמשתנים בתוך טיפת ההתגבשות באמצעות 24 גם מגשים הקרנה כמו קודם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תרשים המתאר את זרימת העבודה מנוצלת במערכת זו מוצג באיור 1 ו כולל שלושה שלבים עיקריים. ניתוח חישובית של הרצף מנוצל לפתח השערות לגבי גבולות התחום של החלבון-הסליל המפותל של עניין. דוגמא לניתוח מבואר של תחום Shrm2 SD2 מוצגת באיור 2. בתרשים זה, המטרה הייתה לזהות גבולות תחום אפשריים עבור תחום שימור בבית C- הסופי של רגולטור cytoskeletal Shroom שנקרא SD2. מניתוח זה היה שלוש סדרות שונות של גבולות תחום היפותטי נוצרו המכיל שב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול המתואר כאן נועד לעזור למשתמש לזהות גבולות התחום בתוך חלבונים מפותל-סליל גדול כדי להקל התגבשות שלהם. הפרוטוקול מסתמך על שילוב הוליסטי של מגוון נתונים מתחזיות חישובית ומקורות אחרים כדי ליצור סדרה של גבולות תחום פוטנציאליים. אלה ואחריו סט של ניסויים ביוכימיים שהן מהירים וזולים, והם משמשים להמשך צמצום השערות הראשוניות אלה. בגישה זו, המשתמש יכול לחסל שברי חלבון פוטנציאל במהירות כי הם רצויים, ולמקד את תשומת לב יותר על מועמדים טובים יותר, ובכך לשפר את סיכויי קבלת גבישים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH R01 GM097204 (APV ו-JDH). המימון ל-JHM סופק על ידי מלגת קיץ למחקר לתואר ראשון של HHMI.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
BL21 (DE3) RosettaEmd Millipore70954-3
BL21 (DE3) StarThermoFisher ScientificC601003
BL21 (DE3) Codon PlusAgilent Technologies230245
LysozymeSpectrum Chemical Mfg CorpL3008-5GM
Ni-NTAשרף Life Technologies25216
SubtilisinAספקטרום כימי Mfg CorpS1211-10ML
24 באר Cryschem צלחתהמפטון מחקרHR3-160
INTELLI-PLATE   96:ארט רובינס מכשירים102-0001-03
PEG 3350מחקר המפטוןHR2-591
PEG 8000מחקר המפטוןHR2-515
PEG 400מחקר המפטוןHR2-603
PEG 4000מחקר המפטוןHR2-605
pcDNA3.1-Clover-mRuby2Addgene49089
מערכת אינדוקציה אוטומטית אקספרס לילה 1Emd Millipore71300
אבקת מרק ליזוגניThermoFisher Scientific12795027 

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Studier, F. W. Stable expression clones and auto-induction for protein production in E. coli. Methods Mol Biol. 1091, 17-32 (2014).
  2. Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J Mol Biol. 189 (1), 113-130 (1986).
  3. Chapman, T. Protein purification: pure but not simple. Nature. 434 (7034), 795-798 (2005).
  4. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  5. Lupas, A., Van Dyke, M., Stock, J. Predicting coiled coils from protein sequences. Science. 252 (5009), 1162-1164 (1991).
  6. Offer, G., Hicks, M. R., Woolfson, D. N. Generalized Crick equations for modeling noncanonical coiled coils. J Struct Biol. 137 (1-2), 41-53 (2002).
  7. Lupas, A. N., Gruber, M. The structure of alpha-helical coiled coils. Adv Protein Chem. 70, 37-78 (2005).
  8. Hernandez Alvarez, B., et al. A new expression system for protein crystallization using trimeric coiled-coil adaptors. Protein Eng Des Sel. 21 (1), 11-18 (2008).
  9. Slabinski, L., et al. The challenge of protein structure determination--lessons from structural genomics. Protein Sci. 16 (11), 2472-2482 (2007).
  10. Slabinski, L., et al. XtalPred: a web server for prediction of protein crystallizability. Bioinformatics. 23 (24), 3403-3405 (2007).
  11. Haigo, S. L., Hildebrand, J. D., Harland, R. M., Wallingford, J. B. Shroom induces apical constriction and is required for hingepoint formation during neural tube closure. Curr Biol. 13 (24), 2125-2137 (2003).
  12. Hildebrand, J. D. Shroom regulates epithelial cell shape via the apical positioning of an actomyosin network. J Cell Sci. 118 (Pt 22), 5191-5203 (2005).
  13. Dietz, M. L., Bernaciak, T. M., Vendetti, F., Kielec, J. M., Hildebrand, J. D. Differential actin-dependent localization modulates the evolutionarily conserved activity of Shroom family proteins. J Biol Chem. 281 (29), 20542-20554 (2006).
  14. Bolinger, C., Zasadil, L., Rizaldy, R., Hildebrand, J. D. Specific isoforms of drosophila shroom define spatial requirements for the induction of apical constriction. Dev Dyn. 239 (7), 2078-2093 (2010).
  15. Farber, M. J., Rizaldy, R., Hildebrand, J. D. Shroom2 regulates contractility to control endothelial morphogenesis. Mol Biol Cell. 22 (6), 795-805 (2011).
  16. Das, D., et al. The interaction between Shroom3 and Rho-kinase is required for neural tube morphogenesis in mice. Biol Open. 3 (9), 850-860 (2014).
  17. Dvorsky, R., Blumenstein, L., Vetter, I. R., Ahmadian, M. R. Structural insights into the interaction of ROCKI with the switch regions of RhoA. J Biol Chem. 279 (8), 7098-7104 (2004).
  18. Mohan, S., et al. Structure of a highly conserved domain of Rock1 required for Shroom-mediated regulation of cell morphology. PLoS One. 8 (12), e81075(2013).
  19. Mohan, S., et al. Structure of Shroom domain 2 reveals a three-segmented coiled-coil required for dimerization, Rock binding, and apical constriction. Mol Biol Cell. 23 (11), 2131-2142 (2012).
  20. Tu, D., et al. Crystal structure of a coiled-coil domain from human ROCK I. PLoS One. 6 (3), e18080(2011).
  21. Sievers, F., et al. Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega. Mol Syst Biol. 7, 539(2011).
  22. Shapiro, A. L., Vinuela, E., Maizel, J. V. Jr Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem Biophys Res Commun. 28 (5), 815-820 (1967).
  23. Diezel, W., Kopperschlager, G., Hofmann, E. An improved procedure for protein staining in polyacrylamide gels with a new type of Coomassie Brilliant Blue. Anal Biochem. 48 (2), 617-620 (1972).
  24. Wittig, I., Schagger, H. Advantages and limitations of clear-native PAGE. Proteomics. 5 (17), 4338-4346 (2005).
  25. Jungbauer, A., Hahn, R. Ion-exchange chromatography. Methods Enzymol. 463, 349-371 (2009).
  26. Yu, C. M., Mun, S., Wang, N. H. Theoretical analysis of the effects of reversible dimerization in size exclusion chromatography. J Chromatogr A. 1132 (1-2), 98-108 (2006).
  27. Giege, R. A historical perspective on protein crystallization from 1840 to the present day. FEBS J. 280 (24), 6456-6497 (2013).
  28. Lobley, A., Sadowski, M. I., Jones, D. T. pGenTHREADER and pDomTHREADER: new methods for improved protein fold recognition and superfamily discrimination. Bioinformatics. 25 (14), 1761-1767 (2009).
  29. Marsden, R. L., McGuffin, L. J., Jones, D. T. Rapid protein domain assignment from amino acid sequence using predicted secondary structure. Protein Sci. 11 (12), 2814-2824 (2002).
  30. Kelley, L. A., Mezulis, S., Yates, C. M., Wass, M. N., Sternberg, M. J. The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis. Nat Protoc. 10 (6), 845-858 (2015).
  31. Elsliger, M. A., et al. The JCSG high-throughput structural biology pipeline. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 66 (Pt 10), 1137-1142 (2010).
  32. Bach, H., et al. Escherichia coli maltose-binding protein as a molecular chaperone for recombinant intracellular cytoplasmic single-chain antibodies. J Mol Biol. 312 (1), 79-93 (2001).
  33. Strong, M., et al. Toward the structural genomics of complexes: crystal structure of a PE/PPE protein complex from Mycobacterium tuberculosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (21), 8060-8065 (2006).
  34. Heras, B., Martin, J. L. Post-crystallization treatments for improving diffraction quality of protein crystals. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61 (Pt 9), 1173-1180 (2005).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Coiled coil ProteinsProtein CrystallizationDomain Boundary PredictionNickel Affinity PurificationLimited ProteolysisNative PAGE AnalysisSize Exclusion ChromatographyVapor Diffusion MethodCrystallization ScreeningRuby Tag Fusion

מאמרים קשורים