השרשה של תאורה אוטומטית, Culturing, מערכת דגימה עבור יישומים מיקרוביאלית optogenetic

Summary

עיצבנו מנגנון culturing רציפה לשימוש עם מערכות optogenetic להאיר תרבויות של חיידקים ותאים תמונה בקביעות הקולחים עם מיקרוסקופ הפוכה. Culturing, הדגימה, ההדמיה, וניתוח התמונה באופן אוטומטי לחלוטין, כך תגובות דינמיות תאורה ניתן למדוד על פני כמה ימים.

Abstract

מערכות optogenetic לנצל חלבונים גנטיים בקידוד משני קונפורמציה בתגובת אורכי גל מסוים של אור לשנות תהליכים תאיים. יש צורך culturing ומדידת מערכות המשלבות מתוכנת תאורה וגירוי של מערכות optogenetic. אנו מציגים פרוטוקול לבנייה באמצעות מנגנון culturing רציף להאיר תאים מיקרוביאליים עם מינונים מתוכנים של אור, ובאופן אוטומטי לרכוש ולנתח תמונות של תאי השפכים. המבצע של מנגנון זה בתור chemostat מאפשר קצב צמיחת הסביבה התאית להיות תחת פיקוח הדוק. השפכים של תרבית תאים הרציפה ידגמו בקביעות התאים הם צלמו על ידי מיקרוסקופ רב ערוצית. Culturing, הדגימה, ההדמיה, וניתוח התמונה באופן אוטומטי לחלוטין, כך תגובות דינמיות את עוצמת הקרינה ומורפולוגיה הסלולר של תאים שנדגמו הקולחים התרבות נמדדות לאורך ימים מרוביםללא קלט משתמש. אנו להדגים את התועלת של מנגנון culturing זה על ידי גרימת ייצור חלבון דינמית זן של שמר אפייה מהונדס עם מערכת optogenetic שמפעילה שעתוק.

Introduction

מערכות optogenetic להשתמש באור כדי לשלוט רשימה הולכת וגדלה של תהליכים תאיים כולל ביטוי גנים, ^{1, 2, 3, 4,} לוקליזציה חלבון ^5, פעילות חלבון ^{6, 6, 7, 8} חלבון מחייב, ^{8, 9, 10} ו פירוק חלבונים. ¹¹ שיטה culturing תאים בסביבה מבוקרת עם גירוי אופטי ובעצם למדידת תגובתם על לוחות זמנים ביולוגיים רלוונטיים יש צורך לנצל את הפוטנציאל של כלים אלה למחקר בביולוגיה של תא וביוטכנולוגיה. השיטה שלנו מנצלת chemostasis לשמור על שיעור צמיחת תאים מתמיד בתוך מוּרבָּך, AEמדורג, וכלי culturing זכוכית בקרת טמפרטורה ^{12, 13,} כי הוא חשוף תאורה מתוכנת. אנו תאים בודדים תמונה קולח התרבות עם מיקרוסקופ הפוכה כדי למדוד את התגובה של תרבות תאורה מתוכנת. Culturing, הדגימה, ההדמיה, וניתוח התמונה באופן אוטומטי לחלוטין, כך עוצמת הקרינה והמורפולוגיה הסלולר של תרבית תאים בשפכים יכולים להימדד לאורך ימים מרובים ללא קלט משתמש.

יכול להיות מיושם פרוטוקול זה ברוב המעבדות מכירות תרבות מיקרוסקופית תא גדלים, ואת המנגנון המשמש הוא זול עשויים רכיבים זמינים. כלי culturing שקוף ממוקם מעל מטריצה של דיודות פולטות אור (LEDs) מסוגל פולטות 1 μW / ² ס"מ -10 mW / cm ² של אור. חיידקים גדלים כלי culturing ברציפות; אחד משאבת peristaltic משמשת להוספת תקשורת בביתשיעור דילול, אחר משמש לסגת תרבות בקצב פחות המיקרוסקופ, וההבדל בורח דרך פורקן הצפה. כרית חימום שומרת על הטמפרטורה. האוויר נשאב ללא הרף לתוך כלי culturing כדי לשמור על לחץ חיובי כמו גם לערבב לאוורר את התרבות. פרט משאבת אוויר, חשמל למכשירים אלה מוסדר על ידי מיקרו כי גם מקבל קלט מתוך מדחום ומחשב שולחני מחובר. תרבות תא השפכים נשאבת למכשיר microfluidic על הבמה של מיקרוסקופ הפוכה. ללא פלורסנט ותמונות פלורסנט נרכשים באופן אוטומטי. התאמתי את התמונות מאופיינות אלגוריתם מאתר בכל תא כאזור של העניין (ROI) ומודד את המאפיינים של כל ROI.

כדי להדגים יישום של פרוטוקול זה, מדדנו את התגובה לעוצמות אור השונה של תאי שמר אפייה מהונדסות עם על אחריות כחולה-אורve מערכת optogenetic השולטת שעתוק של חלבון פלואורסצנטי. ס cerevisiae, הידוע בכינויו של שמרים בייקר, נבחר משום מערכות optogenetic מרובות לשליטת ביטוי גנים במערכת זו כבר קיימות ^{14, 15, 16.} יתר על כן, אורגניזם מודל זה משמש בדרך כלל עבור מחקרים במערכות ביולוגיה ¹⁷ וכתוצאה שלדת יישומים ביוטכנולוגיים ^{18, 19, 20.} תוצאות הנציג שלנו מראות כי פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לשלוט שעתוק של תרבות לאורך כמה ימים על ידי בעוצמות משתנות קלט אור ומדידת הייצור של כתב ניאון.

Protocol

איור 1: מנגנון culturing הרציף. דיאגרמה פשוטה זו מראה כיצד המנגנון צריך להתגודד כשהיא משמשת לתרבות, להאיר, ולמדוד תכונות אופטיות של החיידקים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2: מבט כולל של הפרוטוקול. השלבים באזור המוצל יש לחזור בכל פעם הפרוטוקול משמש. שליטה לולאה סגורה היא ³⁴ אפשרי, אך אינו מיושם פרוטוקול זה.

1. להרכיב את המדחום אל ללוחות

-page = "1">
איור 3: חיבורים לקרוא ערכי מדחום. תרשים זה מראה כיצד המדחום הדיגיטלי צריך להיות מחובר ל- PCB כך המיקרו יכול לקבל משוב כדי לשלוט על הטמפרטורה של התרבות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

1. הלחמת הקרקע, הנתונים, וקווי מתח חיוביים של המדחום הדיגיטלי כדי מיוחס להם דרך נקביים מסומנת "GD + V."
2. קליפ את פין אחד מן נגיחה 3 פינים נקבה וקוצצים את הפינים 2 הנותרים עם קוצץ תיל, כך שהוא יכול להתאים לשתי דרך נקבי שכותרתו "R2" ולא לחסום את המיקרו-בקר. הלחמה זה במקום. חבר את שתי סיכות מולחמות על ידי החדרת נגד 4.7 קילו-אוהם בכותרת הסיכה.

2. חבר את כוח Conרכיבי trol אל ללוחות

איור 4: חיבורים לשלוט בצריכת חשמל של כרית החימום. טבלה זו מראה כיצד חלקי PCB אבזר צריכים להתגודד כדי לשלוט כוח כרית החימום. החלקים לשלוט משאבות פריסטלטיות מחוברים באופן דומה. ראוי לציין, כי הרכיבים עבור המדחום הוסרו לבהירות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

1. חתוך 1 ס"מ מהפינים של חמש כותרות 3 פינים נקבה. הלחמה אלה לעמדות על המעגלים המודפסים (PCB) מסומן "# 1", "# 2", "# 3", "מס '4," ו "CB א"
2. חתוך 1 ס"מ מהפינים של נגיחה 6 פינים ו 8 פינים נקבה. הלחמת לוואי אלה על ידי צדהטור של דרך-חורים שכותרתו K1 דרך K14.
3. חבר את כרית חימום על המעגלים.
   1. הכנס את הקצוות של נגד 100 קילו-אוהם ב דרך נקבי שכותרתו K1 ו- K2 על PCB. הכנס טרנזיסטור אפקט שדה metal-oxide-מוליך למחצה (MOSFET) לתוך המיקום מסומן 1 # על PCB, עם התווית של MOSFET הפונה לכיוון K1 דרך K14 דרך חורים כך סיכת המקור קרובה אל "# "תווית, והפין לטמיון נמצאת במרחק מרבי" תווית # ".
   2. חותכים את קו הקרקע של כבל החשמל (DC) זרם חשמלי קבוע 5 V ולחבר אותו J2. חבר את קו הקרקע של כרית החימום כדי J1. חבר K3 להצמיד 3 עם נגד 1 קילו-אוהם. נוכחי צריך עכשיו רק לזרום J1 כדי J2 כאשר פינים 3 מוגדר + 5V.z
      הערה: פונקציות סט הנגד / MOSFET כמתג המאפשר לזרם לזרום מן J1 פינים J2 כאשר פינים 3 של מיקרו מוגדר +5 V.
4. לְחַבֵּרמשאבת peristaltic האיטית.
   1. הכנס את הקצוות של נגד 100 קילו-אוהם ב דרך נקבי שכותרתו K4 ו K5 על PCB. הכנס MOSFET למצב מסומן 2 # על PCB, עם התווית של MOSFET הפונה לכיוון K1 דרך K14 דרך חורים כך סיכת המקור קרובה תווית "#", והפין לטמיון נמצא במרחק מרבי "#" תווית.
   2. חותך את קו הקרקע של כבל החשמל של 12 וולט DC של משאבת peristaltic האיטית. חבר את משאבת peristaltic מול קץ J3 ואת יבלת הקיר פונה קץ J4. חבר K6 להצמיד 4 עם נגד 1 קילו-אוהם. נוכחי צריך והיום הם קמים רק J3 כדי J4 כאשר 4 פינים מוגדר +5 V.
5. חבר את המשאבה peristaltic מהר
   1. הכנס את הקצוות של נגד 100 קילו-אוהם ב דרך נקבי שכותרתו K7 ו K9 על PCB. הכנס MOSFET למצב מסומן 3 # על PCB, עם התווית של MOSFET הפונה לכיוון K1 דרך K14 דרך החורים של o כי סיכת המקור קרובה תווית "#", ופין ניקוז קליעה מהתווית "#".
   2. חותכים את קו הקרקע של כבל החשמל של 12 וולט DC של המשאבה peristaltic מהר. חבר את משאבת peristaltic מול קץ J5 ואת יבלת הקיר פונה קץ J6. חבר K9 להצמיד 5 עם נגד 1 קילו-אוהם. נוכחי צריכים והיום הם קמים רק J5 כדי J6 כאשר סיכה 5 מוגדרת +5 V.

3. חבר את מטריקס LED אל ללוחות

איור 5: חיבורים לשלוט מטריקס LED. תרשים זה מראה כיצד מטריקס LED צריך להיות מחובר ל- PCB. הוא גם מראה כי PCB יכול להערם על מיקרו-בקר. ראוי לציין, כי הרכיבים עבור המדחום לשליטת כוח DC למכשירים אחרים הוסרו לבהירות.es / ftp_upload / 54,894 / 54894fig5large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

1. הלחם את 6 פינים, 10 פינים, ושתיים כותרות הסיכה נשיות 8 הפינים לתוך דרך החורים בצדדים של PCB כזה שהוא יכול להיערם על גבי מייקרו.
2. הלחמת 100 nF ואת 10 קבלי μF לעמדות המסומנות שלהם על PCB, וציינה כי הקוטב השלילי של 10 קבל μF (הספקה הקצרה) צריך להיות מחובר לאינטרנט-החור מסומן עם סימן שלילי.
3. הלחם את הנהג LED אל 2 על ידי 12 סט של דרך-חורים, עם הכניסה על הנהג הרחק דרך נקבי שמורות עבור המטריצה ​​LED.
4. הלחמה 2 טורים של כותרות פין זכר אל דרך-חורים המיועדים המטריצה ​​LED, וקוצצים את הקצוות של אלה מתחת לאמצעי כזה שהם לא יקשו על המיקרו-בקר. חבר אלה שתי רצועות 8-חוט של חוטי מגשר נקבה / נקבה. חבר קבוצה שנייה של גבריםכותרות סיכה אל הקצה השני של חוטי המגשר.
5. הכנס את מטריקס LED מעל החציון של קרש החיתוך, ולאחר מכן הכנס את הסט השני של כותרות סיכה כדי העמודים משני צדי המטריצה. ודא כי חיבורים חשמליים זהים אם המטריצה ​​LED היה מחובר ישירות ל- PCB עם הצד שכותרתו של המטריצה ​​המתאים בעמודה שכותרתה של דרך-חורים.
6. קליפ את פין אחד מן נגיחה 3 פינים נקבה וקוצצים את הפינים 2 הנותרים עם קוצץ תיל, כך שהוא יכול להתאים לשתי דרך נקבי שכותרתו "R1" ולא לחסום את המיקרו-בקר. הלחמה זה. חבר את שתי סיכות מולחמות על ידי החדרת נגד 1 קילו-אוהם בכותרת הסיכה.
   הערה: כלי culturing יהיה להערם מעל המטריצה ​​LED. אם סרטי החוט לחסום את כלי השיט, לקזז אותם מן מטריקס. לאחר מכן, השתמש חוט גרעין מוצק כדי לגשר על הפער בין פיני מטריקס ואת סיכות סרט חוט, כך את החיבורים החשמליים לא CHange.

4. התקן תוכנה ולהתחבר חומרה

1. סטאק את PCB על מיקרו-בקר.
2. עקוב אחר הקישורים ברשימת החומרים כדי להוריד את סביבת הפיתוח המשולבת (IDE) ואת קוד מותאם אישית עבור המיקרו-בקר.
3. חבר את המיקרו-בקר למחשב מיקרוסקופ באמצעות אפיק טורי אוניברסלי AB (USB) כבל. לקמפל ולהעלות את הקוד המותאם אישית חזרה אל המעבד.
4. הורד מיקרו-מנהל ^{21, 22} ופיג'י ^23. הגדר מיקרו-מנהל בתור תוסף פיג'י ידי כל העתקת קבצים ".dll", בספריית "mmplugins", ואת ספריית "mmautofocus" מספריית שבו מנהל-מיקרו שהורד לתוך ספריית "Fiji.app". כמו כן, העתק את "plugins / מיקרו-מנהל" המדריך לתוך ספריית "Fiji.app/plugins".
5. הורד את int קובץ "BioreactorController.jar"o בספרייה "Fiji.app/mmplugins".
6. מנהל-מיקרו להרחיב מפיג'י> Plugins> מיקרו-מנהל> סטודיו מיקרו-מנהל. השתמש חומרה אשף תצורת כדי להגדיר את התוכנה כדי לשלוט המיקרוסקופ. כלול את המכשיר "FreeSerialPort" באשף עם תווית של היציאה שאליה כבל USB AB מחובר.

5. הפוך ולאפיין את מארז אור הוכחה עבור כלי Culturing

1. סטאק ארובות IC שלוש 8 פינים כאבני בניין על קרש החיתוך בכל פינה של מטריקס LED כך כלי culturing יכול לנוח עליהם מעל מטריקס.
2. הדק חלק מן נייר דיפוזיה מתחת לשכבה העליונה של השקעים, כך האור מכה את כלי culturing ממטריצת LED הוא מפוזר.
3. לגזור שלוש 8 "ב -6" מנות של קצף שחור. לחתוך בה חור כי הוא באותו הגודל כמו קרש החיתוך האלקטרוני (2.3 "x 3.5") מבפנים של TW הראשוןo וחלק כי הוא בגודל של המלבן שנעשה על ידי ארובות IC (0.9 "x 1.8") מבפנים של השלישי. מחסנית שכבות אלה על מטריקס LED כך את השכבה האחרונה המכילה את הצמצם 0.9 "x 1.8" טמונה גם עם החלק העליון של ארובות IC, ומקיף את מטריקס LED.
4. חותכים גיליון נוסף של קצף שחור לשניים כדי לעשות מלבן 6 "ב -24". מרדדים זה לתוך עמוד חלול של קצף שחור כי כלי culturing יכול להשתלב עם מקום צינורות וחוטי חשמל, כך שהוא יהיה תרמית אופטית לבודד את כלי culturing.
5. מרכז את העמודה החלולה של קצף השחור מעל מטריקס LED, ולסמן את הגבול של הטור על שכבת הקצף השחור מתחתיה. גבול זה יציין איפה שהוא צריך להיות מרוכז בעתיד.
6. לגזור חלק 3 "x 3" של קצף שחור. השתמש באפשרות זו מאוחר יותר כמו מכסה שיכול להיות מודבק לחלק העליון של העמודה כדי לחסום את האור החיצוני.
7. חבר את חיישן כוח פוטו-דיודה כדי th דואר culturing כובע של כלי עם קלטת, לצרף את הכובע, והכניסו את כלי culturing במארז.
8. בשנת מיקרו-מנהל, ללכת Plugins> בקר bioreactor. גדר מטריקס להאיר על קבוצת משנה של הטווח של עוצמות אפשריות ב 30 מרווחי ים.
9. רשמו את עוצמות האור כמובא קונסולת מד הכוח מחובר חיישן כוח. מדידות אלו יאפשרו את עוצמת בפועל של האור להיות ידוע מתי מספר נוריות כי דולקים ואת הנוכחי ברוחב-מווסתת דופק (PWM) נוריות אלה מוגדר.

6. מכינים את כלי Culturing

איור 6: חיבורי כלי. טבלה זו מראה שהקנקן צינורות של המנגנון צריך להיות מחובר בטרם autoclaved.blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

1. סמן את הגובה המתאים לכל תוספת 2 מ"ל של נוזל בטווח של 10 מ"ל 30 מ"ל ב כלי culturing. הכנס 10 מ"ל מים סטריליים deionized, סמן את מפלס המים, להוסיף 2 מ"ל, סמן את מפלס המים, וחזור עד לרמה 30 מ"ל מסומן. מכסה את הסימונים עם קלטת ברורה, כך שהם אינם מוסרים בקלות, ועושה את הנוזל.
2. מניחים את הקצה הארוך של נמל אלומיניום באמצעות אטם סיליקון, לתוך כלי culturing. בורג על הכובע.
3. מכסים אחד לשקע יציאת אלומיניום קצר עם 1/16 "צינורות סיליקון ID. חבר את הקצה הדיסטלי ידי הוספת מנעול luer נקבה ולאחר מכן חיבור תקע מנעול luer זכר. שקע זה משלים, ולא לשמש (צינור 6 באיור 6 ).
4. חיבור שני קטעים קצרים של 1/16 "צינורות סיליקון מזהה עם מנעולים luer זכר ונקבה. חבר קצה אחד לשקע יציאת אלומיניום קצר וחבר את distaסוף l עם luer זכר תקע מנעול luer הנשי. כלי השייט יהיה מחוסן דרך הצינור הזה (צינור 7 / 7.1 באיור 6).
5. חיבור שני 1/16 "צינורות מזהה את הקצוות של 1/16" צינורות ומחברים peristaltic מזהה. חבר קצה אחד ליציאת אלומיניום קצרה וחבר את (הצינור 4 באיור 6) האחר. מאוחר יותר, זה יחובר אל בקבוק התקשורת.

7. מכינים את Flask מדיה

1. חבר "שפופרת סיליקון בקוטר פנימי (ID) לנמל האלומיניום הארוך. הצינור צריך להיות ארוך מספיק כדי להגיע בקבוק התקשורת. חבר 1/8" 1/16 מנעול luer זכר מזהה קטע קצר של 1/16 " צינורות מזהים, להתחבר זה אל הצינור שקדם ,, ולאחר מכן כנס קטע קצר זה לתוך פקק הגומי על בקבוק התקשורת (שפופרת 3 באיור 6).
2. הצמד את הצינור. חיבור זה מאפשר לאוויר לזרום מבקבוק התקשורת לכלי שיט התרבות. כאשר בקבוק התקשורת נשאב מאוחר בארשת ד הצינור הזה הוא unclamped, התרבות תהיה מעורבת, סודה, והמשיכה בלחץ חיובי על ידי הבועות הנכנסות.
3. הכנס "צינור מזהה מספיק זמן כדי להגיע לתחתית של הבקבוק לתוך הפקק, שדרכו תקשורת תועבר. חבר 1/16 אחר" 1/16 צינור זהות זו אחת, ולאחר מכן צינור 3/16 "זהות כי. חבר זה עם מנעול luer נקבת 3/16 "מזהה ואת תוספת מנעול luer זכר (צינור 1 / 1.1 באיור 6).
4. החור השלישי הפקק צריך להיות מלא עם קטע קצר של 1/16 "צינורות מזהים, מחובר לשני מגזרים אחרים של צינורות בקוטר בינוניים מחובר בקצה הדיסטלי (צינור 2 / 2.1 באיור 6). זה יהיה מחובר משאבת ואקום ובהמשך משאבת האקווריום.
   הערה: אם הצינורות לא יכולים להתאים בקלות דרך חורי פקק הגומי, לחתוך את הקצוות של הצינור בשיפוע. ואז, הסוף המלוכסן אשר נדחף דרך החור ניתן להשתמש כדי למשוך את שאר דרך.

ss = "jove_title"> 8. הכן את Flask הקולח

1. הכנס מנעול luer זכר לתוך קטע של 1/16 "צינורות סיליקון זהות, ולאחר מכן בתוקף להכניס 0.022" מזהה polytetrafluoroethylene (PTFE) צינורות. בנפרד, לחבר מנעול luer נקבה לצינור 1/16 "מזהה. לאחר מכן, בסוף חוט אחד לאורך צינור PTFE להתחבר המנעולים והשני ליציאת אלומיניום קצר (צינור 5 באיור 6).
2. חבר את "צינור סיליקון ID אל 1/50" 1/50 חשוף צינור ומחברים peristaltic מזהה. כדי זה, להתחבר בשלושת מקטעי 1/50 "צינורות מזהה ושני קטעים של 0.022" צינורות PTFE מזהה, לסירוגין אותם. חבר זה בקבוק השפכים באמצעות 1/16 "צינורות מזהים (צינור 5 באיור 6).
3. חבר קצה אחד של צינור סיליקון 1/16 "זהות הצינור השנייה באורכו של נמל האלומיניום ואת הקצה השני אל בקבוק השפכים. צינור אלומיניום זו מגדיר את נפח התרבות, והתרבות עודפת גולשת לתוך מכל השפכים (צינור 8 ב
4. חיטוי הרכבת culturing ב 121 ° C ו -15 psi (עיקור כללי) למשך 30 דקות.
   הערה: צינורות שדרכם הבקבוק התקשורת מלא, שדרכו את הבקבוק התקשורת הוא שאב, ושדרכה הספינה culturing הוא מחוסן יש ריבוי קטעים של צינורות כך שאם במגזר דיסטלי מזוהם, אותו ניתן להסיר כדי לחשוף סטרילי מִגזָר.

9. מכינים את ערוץ microfluidic

1. מערבבים polydimethylsiloxane (PDMS) וסוכן ריפוי בתוך 9: יחס 1. דגה ויוצקים על התבנית מאסטר סיליקון.
2. לרפא את PDMS עבור 2 שעות על 65 מעלות צלזיוס ולאחר מכן לחתוך אותו מן המסכה עם סכין גילוח. חותכים סביב PDMS עד שהוא משחרר מהתבנית. הימנע לדחוף למטה ולשבור את רקיק שברירי.
3. השתמש מחורר ביופסיה 1.2 מ"מ מזהה לנקב חורים בשני הקצוות של הערוץ.
4. אג"ח פלזמה את PDMS אל הזכוכית המכסה ^24.
5. קלטת הארוכה הקצוות של זכוכית המכסה על מסגרת אלומיניום התומכים כך PDMS הערוץ הוא מרוכז על מסגרת אלומיניום, ולאחר מכן אופים את PDMS שוב עבור 2 שעות על 65 מעלות צלזיוס.

מילוי 10. Flask מדיה

איור 7: הוספת מדיה. טבלה זו מראה כיצד תקשורת צריכה להיות ואקום המסונן לתוך בקבוק התקשורת. זה מבטיח כי התקשורת נשארה סטרילי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

1. פוך המדיה מתאימה. אם מערכת culturing הרציפה תופעלה כמו chemostat, השתמש מדיה בע"מ עבור מזין ספציפי.
   הערה: דוגמאות של רכב מדיה סטנדרטי ללימודים עם ס cerevisiae פורסמו בעבר ^25,= "Xref"> ^{26, 27, 28, 29.}
2. חבר את מסנן אבק כדי בקבוק 100 מ"ל, להסיר את כיסוי הפטמה, ולאחר מכן להסיר את התקע הלבן הפטמה של מסנן אבק עם פינצטה סטרילית.
3. חבור את צינור סיליקון 3/16 "מזהה את הפטמה, הצינור החופשי האחר של מדיה בבקבוק משאבת ואקום (צינורות 1 ו -2 באיור 7, בהתאמה), ולהבטיח כי הצינור המחבר את בקבוק התקשורת לכלי שיט culturing הוא הדק לסגור (שפופרת 3 באיור 7).
4. מלאו את המסנן עם התקשורת, להפעיל את משאבת ואקום, ואז לסנן את שאר כלי התקשורת. הצמד את צינורות סיליקון 1/16 "מזהה מחובר ואקום (צינור 2 באיור 7) ולכבות את משאבת ואקום.
5. הסר את leurs ממגזר הביניים של 1/16 "צינורות מזהים מחובר משאבת הוואקום כך קץ מזוהם של הצינור יהיה נגיש. הכנס הסוף e הכחול של מסנן אוויר מזרק סטרילי לתוך הצינור הזה.
6. הצמד את צינורות סיליקון 3/16 "מזהה (צינור 1 באיור 7) ונתק את luer זכר ממנו. נתק את התקע luer הנשי של צינור היניקה התקשורת של כלי culturing. חבר luers זכר ונקבה אלה כדי לאפשר התקשורת להיות שאוב לתוך כלי culturing.
7. הסר את מסנן האבק מכסה את בקבוק מיליליטר 100 של תקשורת אשר צורפה מסנן האבק.
8. יממה לפני כלי culturing יהיה מחוסן, לחסן מושבה אחת של חיידק optogenetic במבחנה עם 4 מיליליטר של התקשורת שנאספה בשלב הקודם, ולתת לו לגדול בין הלילה ב 30 מעלות צלזיוס או טמפרטורת צמיחת הטמפרטורה האופטימלית של התרבות עם תסיסה.

11. להרכיב את הציוד סביבה מיקרוסקופ

1. הגדר את מכלול culturing הרציף ליד מיקרוסקופ עם תקשורת הבקבוקון גבוהה יותר מאשר כלי culturing ואת effluהבקבוק אף אוזן גרון נמוך כלי culturing, כך הצינור מורכב מקטעים של 0.022 "צינורות PTFE ID (צינור 5 באיור 6) יכול להגיע לשלב מיקרוסקופ. מאובטח קלטת במורד פקקים גומי על הבקבוק התקשורת מיכל השפכים.
2. נתק את הקצוות של "צינורות PTFE המזוהה 1/50" 0.022 שפופרת סיליקון ID חיבורם (צינור 5 באיור 6), וחבר הקצוות הללו לתוך הכניסה והיציאה של המכשיר microfluidic.
3. חבר את הקצה הלבן של מסנן אוויר מזרק משאבת האקווריום. לחץ האוויר ידחוף מדיה לתוך כלי culturing.
4. כאשר התקשורת מגיעה לרמה של יציאת שפכים, לעטוף את 1/16 "צינורות יניקת תקשורת מזהה ומחברים סביב משאבת peristaltic האיטית (צינור 4 באיור 6) ואת 1/50" צינורות מוצא המדגם מזהה ומחברים סביב הצום משאבת peristaltic (צינור 5 באיור 6).
5. לאוורר את התקשורת על ידי שחרור באוויר tuלהיות בין כלי culturing בבקבוק ומדיה.
6. קלט את כרית חימום מדחום לכלי שיט culturing כך שהטמפרטורה שלה ניתן לשלוט. סליל צינורות התקשורת סביב כלי culturing כך בתקשורת ההזנה תהיה באותה הטמפרטורה כמו הכלי.
   הערה: זרם PWM אל כרית החימום מוסדר על ידי מייקרו המשתמש תשומות מן המדחום כדי לשמור על כלי culturing בטמפרטורת setpoint שלה.
7. הכנס את כלי culturing לתוך מתחם הקצף השחור מעל מטריקס LED, ולהבטיח כי הצינורות הם לא סחבו.
8. בשנת מיקרו-מנהל, ללכת Plugins> בקר bioreactor. בחר את "יחס משאבת מדיה על" שדה 0.1 ואת "יחס משאבה לדוגמא על" שדה ל -0 קצב הזרימה יהיה נמוך מאוד, אך בשיעור גבוה יותר מהשיעור של אידוי.
9. קלאמפ צינור האוויר הנכנס בין בקבוק התקשורת וכלי culturing. הסר את התקע מצינור החיסון (שפופרת 7 באיור
10. מכסים את המתחם כך שאף האור נכנס, ולתת התרבות לגדול בין לילה.

12. כיילו את המחירים לשואבים

1. בשנת מיקרו-מנהל, ללכת Plugins> בקר bioreactor. בחר את "יחס משאבת מדיה על" שדה 0.5 ואת "יחס משאבה לדוגמא על" שדה 0.
2. ניתקתי את צינור ההצפה מבקבוק השפכים (צינור 8 באיור 6) ואת צינור הדגימה מבקבוק השפכים (הצינור 8 באיור 6) ולאסוף שפכים בכלים נפרדים. אסוף בשפכים עבור שעה 1, המתחיל לאחר המשאבות כבר על במשך 15 דקות.
3. חשבתי את קצב הזרימה של תקשורת לתוך כלי culturing מהכרך שנאסף הכלי כמו:
   
4. התאם את הערך של "יחס משאבת מדיה על" שדה ידי אומדן ליניארי זה:
   
   איפה
   
5. איטרציות הליך הכיול הזה עד להפרש שבין שיעור הזרימה הרצויה ואת קצב הזרימה הנמדד הוא <0.2 מ"ל / שעה, שם את קצב הזרימה הוא בממוצע על פני תקופה h 1.
6. הגדל את הערך של "יחס המדגם על" שדה ולכייל אותו באופן דומה עד בערך 4/5 ^ה מנפח לעזוב את ספינת culturing נשאב החוצה על ידי משאבת הדגימה בערך 1/5 ^ה מהכרך לצאת דרך היציאה בגלישה.
7. תן צפיפות התרבות במנגנון culturing הרציף לאזן בתנאים אלה לילה.
   הערה: אם ספיקות היעד לא ניתן להגיע, שינויצינורות משאבת peristaltic. נוזלים נשאבים בשיעור גבוה כאשר צינורות בקוטר גדולים יותר משמשים. בצע צעד 14 ולאחר מכן חזור לשלב 8.4.

13. תמונות מיקרוסקופ אסופות של חיידקים בתרבית

1. מלא את רשימת עמדת הסטייג 'מייקרו-מנהל עם מערך העמדות שאינן חופפות שבו תמונות של תאים נשאבים לתוך ערוץ microfluidic תהיינה במישור המוקד.
2. פתח את התוסף "בקר Bioreactor". בחר את מהלך זמן מטריקס LED הרצוי, ערוצי הדמיה, והגדרות ניסיוניות אחרות לפי ההנחיות. לאסוף ולנתח תמונות.
3. אמנם הניסוי פועל, להבטיח שהתקשורת בבקבוק תקשורת שרידים ברורה. אם זה מעונן, אז זה כבר מזוהם.

14. שאחרי הניסוי

1. השלך תקשורת, תרבית תאי עודף שפכים.
2. למלא את הבקבוק התקשורת עם 200 מ"ל של 20% EtOH מעורבב עם מים ללא יונים. הפעל את chemostat כפי שהיה בעברהופעל במהלך הניסוי כדי לשטוף את לכלוך תקשורת תא.
3. כאשר פתרון האלכוהול נקז מבקבוק מדיה, לפרק את chemostat מלא.
4. לשטוף זכוכית וצינורות עם מים חמים וחומר ניקוי עדין, ולשטוף היטב במים deionized. ולהשאיר לייבוש.
5. פתח את הקובץ "microcontrollerRecords.csv" לבחון מחדש את הטמפרטורה ומצב מטריקס LED במהלך הניסוי, את הקובץ "Summary.csv" לסקור את נתוני סיכום מכל סט של תמונות ואת "תוצאות .csv" קבצים לסקור נתונים המסכמים כל ROI של כל פרק זמן, כאשר n הוא n ^th סט נתונים.

Results

מנגנון זה שימש כדי לעורר תרבות של ס cerevisiae לבטא חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) בתגובה-אור כחול באמצעות מערכת שעתוק optogenetic מושרה מבוסס על זוג חלבון CRY2 / CIB1 ^30. תאים גדלו chemostatically במדיה פוספט-מוגבל עם שיעור דילול ממוצע של 0.2 ± 0.008. הגבלת הפוספט משמשת מקובלות הרבה יותר בניסויי chemostat cerevisiae ס לשלוט בקצב צמיחה ואת ההשפעות של הגבלת פוספט מאופיינות היטב. ^31,

Discussion

עיצבנו את המכשיר תוך מחשבה על גמישות. כל הקוד בשימוש הוא בחינם, קוד פתוח. תהליך ניתוח תמונת ברירת מחדל לתאי קטע הוא פשוט רץ במהירות. ניתוח מותאם אישית יכול להיות מיושם על ידי הקלטה קלט משתמש תוך ניתוח תמונה מייצגת עם ממשק משתמש גרפי פיג'י, המרת קלט תסריט beanshell, ולאחר מכן להגדיר את התוסף כדי לקרוא את התסריט. כאשר הוא נקרא, התסריט הזה יישלח מערך מחרוזת בשם "תמונות" המכילות את נתיבי קובץ לאתר הצילומים האחרונים של תמונות מופחתות ברקע. תמונות ונתונים נשמרים כפי שהם נא...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
מדריך מעבדה מקיף	GitHub	NA	מדריך מעבדה נרחב המתעדכן באופן קבוע זמין ב " תיקי כימוסטט אופטוגנטיים" מאגר GitHub (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files). זה כולל גם תיאור של התבנית המיקרופלואידית המשמשת ליצירת התוצאות המייצגות.
Fritzing Design Viewer	Fritzing	NA	התוכנה החינמית בקוד פתוח להצגה ועריכה של עיצובי מעגלים מסוג .fzz זמינה ב-"http://fritzing.org/download/"
Arduino Uno R3 (Atmega328 - מורכב)	Adafruit	50	מיקרו-בקר. 1 נדרש.
ערכת כותרות ניתנות לגיבוב Arduino	SparkFun Electronics	10007	כותרות פינים נקבה לחיבור PCB למיקרו-בקר. 1 נדרש.
מלחם מתכוונן 30W 110V - XY-258 110V	Adafruit	180	לחיבור חשמלי למעגל המודפס. 1 נדרש.
מעמד ברזל הלחמה	Adafruit	150	לביצוע חיבורים חשמליים ל-PCB. 1 נדרש.
סליל מיני הלחמה - הלחמת ליבת רוזין עופרת 60/40 בקוטר "0.031 - 100 גרם	Adafruit	145	ליצירת חיבורים חשמליים ל-PCB. נדרש 1.
0.1 μ קבל F	SparkFun Electronics	COM-08375	מייצב מתח ב-PCB. 1 נדרש.
10 μ קבל F	SparkFun Electronics	COM-00523	מייצב מתח ב-PCB. 1 נדרש.
MAX7219CNG דרייבר LED Matrix/Digit Display -	Maxim	MAX7219CNG	. 1 נדרש.
8 פינים IC שקע	עכבר אלקטרוניקה	575-144308	16 נדרש. אלה ייערמו זה על גבי זה כדי לתמוך בכלי התרבות מעל מטריצת ה-LED.
שקע IC 24 פינים	Mouser Electronics	535-24-3518-10	אופציונלי. השתמש בזה כדי לחבר באופן הפיך את מנהל ההתקן MAXIM 7219CNG ל-PCB.
מולטימטר דיגיטלי	Adafruit	2034	לפתרון בעיות אלקטרוניקה. 1 נדרש.
כותרות Break Away - 40 פינים זכר (ממורכז ארוך, PTH, "0.1)	SparkFun Electronics	PRT-12693	פסי-פינים זכריים עבור מטריצת LED מחוברת ללוח מעגלים מודפסים. ניתן לקצץ קצוות בעזרת חותכי תיל. נדרשת ערכה אחת.
חותכי תיל אלכסוניים שטוחים	Adafruit	152	לחיתוך ראשי פינים ארוכים וחיתוך כבלי חשמל. 1 נדרש.
חוטי מגשר פרימיום לנקבה/נקבה - 40 x 12 אינץ' (300 מ"מ)סרט	Adafruit	793	לחיבור לוח לחם למטריצת LED. ניתן לחבר מקצה לקצה עם ראשי פינים זכריים כדי להיות ארוכים יותר. 1 נדרש.
לוח לחם בגודל חצי גודל	Adafruit	64	מטריצת ה-LED תתחבר אליו וכלי הטיפוח ינוח מעליו.
מיניאטורי 8x8 כחול LED מטריקס	Adafruit	956	. אורך הגל הדומיננטי הוא 470 ננומטר (כחול). 1 נדרש. מטריצות LED זעירות חלופיות מאותו ספק זמינות עם אורכי גל דומיננטיים: 624 ננומטר (אדום), 588 ננומטר (צהוב), 525 ננומטר (ירוק), 572 ננומטר (צהוב-ירוק) ולבן.
נדרש ראש ניתן לערום-3 פינים	SparkFun Electronics	13875	8.
ערכת נגדים - 1/4W (סה"כ 500)	SparkFun Electronics	10969	לאלקטרוניקה. 1 נדרש.
IRL520N MOSFET	מיישר בינלאומי	IRL520N	מתג ויסות מתח לבקרת זרם DC. 4 נדרש.
חוט חיבור - מבחר (ליבה מוצקה, 22 AWG)	חוט SparkFun Electronics	PRT 11367	לאלקטרוניקה. 1 נדרש.
ספק כוח מיתוג 5V 2A (2000mA) -	Adafruit	276	ב-UL עבור כרית החימום ו-Arduino. 2 נדרש.
מתאם מתח מיתוג מווסת 12 VDC 1000mA - רשום ב-UL	Adafruit	798	למשאבות פריסטלטיות. 2 נדרשים.
כרית חימום חשמלית - 10 ס"מ על 5 ס"מ	Adafruit	1481	לחימום הביוריאקטור. 1 נדרש.
משאבה פריסטלטית בזרימה משתנה בזרימה נמוכה	פישר סיינטיפיק	13-876-1	לאמצעי שאיבה. 1 נדרש
משאבה פריסטלטית בזרימה משתנה בזרימה בינונית	פישר סיינטיפיק	13-876-2	לתרבית שאיבה. 1 נדרש.
מתאם מתח מיתוג מווסת 9 VDC 1000mA - רשום ב-UL	Adafruit	63	לאספקת חשמל למיקרו-בקר. צו 1.
DS18B20 עמיד למים בטמפרטורה גבוהה חיישן טמפרטורה דיגיטלי + תוספות	Adafruit	642	לביו-ריאקטור. 1 נדרש.
Micromanager	Micromanager	NA	תוכנת בקרת המיקרוסקופ החינמית בקוד פתוח זמינה בכתובת "https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release"
FIJI	ImageJ	NA	תוכנת ניתוח התמונות החינמית בקוד פתוח זמינה בכתובת "http://fiji.sc/"
Arduino Integrated Development Environment	Arduino	NA	ה-IDE החינמי בקוד פתוח זמין ב-"https://www.arduino.cc/en/Main/Software"
קוד מותאם אישית	GitHub	NA	קוד המיקרו-בקר המותאם אישית והתוסף "Bioreactor Controller" זמינים ב " תיקי כימוסטט אופטוגנטיים" מאגר GitHub (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files).
כבל USB A ל-B - 6 רגל	SparkFun Electronics	CAB-00512	משמש להורדת נתונים למיקרו-בקר. 1 נדרש.
bioreactorTimecourse_example.csv	GitHub	NA	היתרון בטעינת ערכי מטריצת LED מקובץ CSV הוא שהתוסף יכול לקרוא לתוכנית לעדכן את הערכים הללו על סמך תוצאות ניתוח תמונה, וניתן לטעון מחדש את הערכים הללו למיקרו-בקר, מה שמאפשר בקרת הזנה חוזרת. זה זמין מ " תיקי כימוסטט אופטוגנטיים" מאגר GitHub (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files).
ג'ל טוטה-פרוסט (נייר דיפוזיה)	B& H	B& H # LOFSFTL MFR # T1-72	למטריצת LED. 1 נדרש.
גיליון קיט Crosslink 1/4x12x24in	Grainger, inc	20JL37	קצף שחור לטיפוח מארז כלי שיט. 4 נדרש.
חיישן הספק פוטו-דיודה סטנדרטי, Si, 200 - 1100 ננומטר, 50 mW	Thorlabs	S120VC	למדידת עוצמת האור. 1 נדרש.
סרט תיוג	פישר סיינטיפיק	159015N	לתיוג ואבטחת רכיבים רופפים. 1 נדרש.
קונסולת מד כוח ואנרגיה קומפקטית, LCD דיגיטלי בגודל 4 אינץ'	Thorlabs	PM100D	למדידת עוצמת האור. 1 נדרש.
בקבוק זכוכית היברידי GL45 100 מ"ל	Bellco Glass, Inc.	(7910-40150)	כלי ביו-ריאקטור. 1 נדרש.
מכלול שש יציאות	Bellco Glass, Inc.	מותאם אישית	לכלי הביוריאקטור. מפרט צינורות: .125 אינץ' OD x .055 אינץ' ID. יציאה A: 1.0 אינץ' ארוך מעל שבלול המכסה ולתחתית הצינור. יציאות B,C,E,F: באורך 1.0 אינץ' מעל שבלול הכובע, באורך 33 מ"מ מתחת. יציאה D: אורך 1.0 אינץ' מעל שבלול המכסה, 65 מ"מ  הרבה מתחת. 1 נדרש. כולל מכסה בורג עליון פתוח מפוליפרופילן בקוטר 45 מ"מ ואטם סיליקון לבן כדי להבטיח אטימה הדוקה בין המכסה לכלי.
סקוטש מג'יק טייפ 3105, 3/4 x 300 אינץ', חבילה של 3	אמזון	B0009F3P3U	סקוטש שקוף. זה זמין אצל ספקים רבים אחרים. הוא משמש לכיסוי סימונים על כלי התרבות ולאבטחת זכוכית הכיסוי עם תעלת ה-PDMS למסגרת התמיכה מאלומיניום.
1/16 אינץ' מזהה x 3/16 אינץ' OD x 1/16 אינץ' צינורות סיליקון סניטריים קיר טיגון	ארצות הברית פלסטיק קורפ.	57288	צינורות. ~25' נדרש.
פקק גומי לבן Cole-Parmer Twistit, גודל 10	Cole-Parmer	EW-62992-32	פקק בקבוק מדיה ופקק בקבוק קולחין. 2 נדרש.
בקבוק מעבדה 2L	Pyrex	4980	בקבוק מדיה ובקבוק קולחין. 2 נדרש.
יום פינצ'קוק	פישר סיינטיפיק	5867	לצינורות צביטה סגורים. 3 נדרשים.
מכלול צינורות חלופי 1/16 אינץ' ID	מוצרים הניתנים למעקב	3372	המשאבות הפריסטלטיות מגיעות עם סט צינורות, אך הן נשחקות לאחר שבועות של שימוש.
מכלול צינורות חלופי 1/50 אינץ' ID	מוצרים הניתנים למעקב	3371	המשאבות הפריסטלטיות מגיעות עם סט צינורות, אך הן נשחקות לאחר שבועות של שימוש.
לואר זכר עם טבעת נעילה x דוקרני צינור 1/16 אינץ', ניילון, מחברי 25/pk	Cole-Parmer	EW-45505-00	. נדרשים ~10 פתיונות.
לואר זכר עם טבעת נעילה x 1/8 אינץ' דוקרני צינור, ניילון, 25/pk	Cole-Parmer	EW-45505-04	מחברים. 5 נדרשים, אחד לכל חור פקק גומי למילוי בצינורות.
מתאם דוקרני צינור נקבה x 1/16 אינץ', ניילון, מחברי 25/pk	Cole-Parmer	EW-45502-00	. נדרשים ~10 לואורים.
מתאם דוקרני צינור נקבה x 3/16 אינץ'	מחברי Cole-Parmer	EW-45502-08	. נדרשים ~10 פתיונות.
אביזר Cole-Parmer Luer, כובע לואר נקבה, ניילון, 25/Pk	Cole-Parmer	SC-45502-28
אביזר Cole-Parmer Luer, תקע נעילת Luer זכר, ניילון, 25/Pk	Cole-Parmer	EW-45505-56
צינורות PTFE Microbore, 0.022 אינץ' ID x 0.042 אינץ' OD, 100 רגל / גליל	צינורות Cole-Parmer	EW-06417-21	. נדרש גליל אחד.
צינורות סיליקון מאסטרפלקס פלטינה, L/S 13,	Cole-Parmer	EW-96410-13	. ~ 25 אינץ' נדרש.
3/16 אינץ' מזהה x 1/4 אינץ' OD x 1/32 אינץ' צינורות סיליקון סניטריים קיר טיגון	ארצות הברית פלסטיק קורפ	57293	צינורות. ~1' נדרש.
מסנן ואקום	Fisher Scientific	974107	מסנן ואקום Nalgene לאמצעי סינון סטריליים.
Aquel Oxy-Boost 200	Rena Aquatic Supply	AP200	משאבת אוויר זרימה מתכווננת עם דיאפרם כפול לאוורור וערבוב מדיות. 1 נדרש.
0.2 μ מסנן מזרק נקבוביות m	קורנינג אינטרנשיונל	431229	זה מבטיח שאוויר ממשאבת האקווריום לא יזהם את המכשיר. 1 נדרש.
Slygard 184 ערכת אלסטומר סיליקון	Dow Corning	Slygard 184	למכשיר מיקרופלואידי. 1 נדרש.
סכין גילוח בטיחות אמריקאי GEM Scientific סכיני גילוח חד-קצה	Fisher Scientific	17989000	לחיתוך צינורות ו-PDMS. נדרש להב אחד.
מנקב חורים Harris Uni-Core 1.2 מ"מ ID	Sigma-Aldrich	WHAWB100028 ALDRICH	לניקוב כניסה/יציאה במכשיר מיקרופלואידי. 1 נדרש.
זכוכית כיסוי מיקרוסקופ 22x60-1.5	פישר סיינטיפיק	12-544-G	למכשיר מיקרופלואידי. 1 נדרש.
מסגרת אלומיניום מלבנית עם חלון מרובע	מותאם	אישית	לתמיכה בערוץ המיקרופלואידי. מידות חיצוניות: 3 אינץ' x 1.25 אינץ'. דיממנטים פנימיים (חלק חתוך): 7/8 אינץ' x 7/8 אינץ' עובי: ~1/32 אינץ'