דרך פשוטה למדוד שינויים בהתנהגות שוחרת זכה שימוש תסיסנית

סיכום

אנו מתארים פרוטוקול גרימת מתגמל nonrewarding חוויות בזבובי פירות (תסיסנית) באמצעות צריכת אתנול מרצון כאמצעי לשינויים במדינות גמול.

תקציר

אנו מתארים פרוטוקול למדידת מינהל עצמי אתנול בזבובי פירות (תסיסנית) כמדד לשינויים במדינות גמול. אנו מדגימים דרך פשוטה כדי לנצל את מערכת גמול הזבוב, לשנות חוויות הקשורות גמול טבעי, ולהשתמש צריכת אתנול מרצון כאמצעי לשינויים במדינות גמול. הגישה משמשת ככלי רלוונטי ללמוד הנוירונים והגנים לשחק תפקיד שינויים בתיווך ניסיון של מצב פנימי. הפרוטוקול מורכב משני חלקים נפרדים: חשיפת הזבובים לחוויות מתגמלות nonrewarding, ואת מנסה לאמוד את צריכת אתנול מרצון כמדד את המוטיבציה להשיג גמול תרופה. שני החלקים ניתן להשתמש באופן עצמאי כדי לגרום אפנון ניסיון בתור צעד ראשון עבור מבחנים במורד זרם או כקובץ assay האכלה שני-בחירה עצמאית, בהתאמה. הפרוטוקול אינו מחייב התקנה מסובכת ולכן יכול להיות מיושם בכל laboratory עם כלי תרבות זבוב בסיסיים.

מבוא

שינוי התנהגות בתגובת הניסיון מאפשר חיות כדי להתאים את התנהגותם לשינויים בסביבתם ^1. במהלך תהליך זה, חיות לשלב המצב הפיזיולוגי הפנימי שלהם עם התנאים המשתנים של הסביבה החיצונית ולאחר מכן לבחור פעולה אחת על פני אחר כדי להגדיל את סיכויי הישרדות ורבייה שלהם. מערכות זכו התפתחו להניע התנהגויות נדרשות להישרדותו של יחידים ושל מינים ידי חיזוק התנהגויות משפרי הישרדות מיידית, כגון אכילה או שתייה, או אלה המבטיחים להישרדות ארוך טווח, כגון התנהגות מינית או אכפתיות עבור צאצאים ^2. תרכובות מלאכותיות כגון תרופות של התעללות גם להשפיע על מערכות תגמול על ידי מסלולים עצביים בוחר שיתוף שמתווכים ² תגמולים טבעיים.

במהלך שני העשורים האחרונים, זבוב הפרות תסיסנית כבר נקבע כמודל מבטיח ללימוד Molecתואר בלבד ומנגנונים עצביים שמעצבים את ההשפעות של אתנול על התנהגות ^3,4.

בעבר, זיהינו תת-קבוצה של נוירונים peptidergic בזבובים (קולטן NPF / NPF (R נוירונים)) כי תגמולים טבעים זוג, כגון חוויה מינית, למוטיבציה של קבלת תגמולי תרופה ^5. ביטוי NPF רגיש הוא חוויות מיניות וכדי תגמולי תרופה, כגון הרעלת אתנול. שינויים ברמות ביטוי NPF מומרים שינויי מנהל עצמי אתנול ^5, שם הגבוהה NPF מפחיתה ונמוך NPF מגדיל את ההעדפה לצרוך אתנול. הפעלת נוירונים NPF היא מתגמלת לזבובים, כפי שהם להציג העדפה ברורה ריח לזווג עם ההפעלה, אשר באו לידי ביטוי גם על ידי צריכת אתנול מופחתת. יתרה מכך, הפעלה של נוירונים NPF מפריעה ליכולת של זבובים כדי ליצור קשר חיובי בין שיכרון אתנול רמז לא ריח. הקשר הסיבתי בין NPF / Rמערכת, מזיכרון הגמול, וצריך אתנול עולים כי אחד יכול להשתמש מנהל עצמי אתנול כאמצעי לשינויים במדינות גמול ^5.

בפרסום זה אנו מדגימים גישה משולבת עבור התחבר למערכת תגמול ושינויי assaying הטבעיים לטוס במדינות גמול. הגישה מורכבת משני חלקים נפרדים, פרוטוקול אימון מניפולצית חוויות תגמול קשור טבעיות, ואחריו assay מזין נימי שתי הברירה (CAFE) להעריך מנהל עצמי אתנול כאומדן לשינויים במדינות גמול. את assay CAFE משול מבחני בחירת שני בקבוקי שימוש במחקרים מכרסמים עבור מנהל עצמי בסמים הוכח משקף מאפיינים מסוימים של התנהגות התמכרות דמוית זבובים ^6.

פרוטוקול

הערה: סקירה כללית של תכנון הניסוי: העיצוב הניסיוני כולל פרוטוקול מותאם דיכוי חיזור ^7-9 שבו זבובי זכרים נחשפים לחוויות מתגמלות nonrewarding ב 3 אימונים רצופים במשך 4 ד. בסוף שלב הניסיון, הזבובים נבדקים ב assay צריכת אתנול מרצון שני-בחירה עבור 3 - 4 ד. פרוטוקול בזאת כוללת מספר שלבי ההכנה, שחלקם ניתן לעשות מראש כדי לשמש יותר מניסוי אחד, בעוד שאחרים צריכים להתקיים במועד לפני תחילת הניסוי (טבלה 1).

1. פעולות הכנה

1. הכנת מערכת מזין נימים
   1. מחממי מחט 27 G ולהשתמש בו כדי לנקב חורים קטנים לאורך בקבוקון (איור 1).
   2. חותכים את התקע בקבוקון לשניים (לרוחב) באמצעות סכין גילוח. מארק ארבע נקודות על פני השטח של התקע, יצירת squarצורת דואר למקם את מחזיקי נימים לתוך. השתמש מחט 18 G לעשות 4 חורים דרך תקע (איור 1b).
   3. השתמש סכין גילוח לחתוך micropipets כדי שיוכלו להחזיק בחוזק 5 נימי זכוכית μL, אשר לשמש מתאמים.
   4. הכנס 4 מתאמי נימים לתוך התקעים המוכנים.
   5. סמן את המיקום של 2 ethanol- ושני נימים המכילים nonethanol על הפקק.
      הערה: מומלץ לשמור על העמדות של 2 סוגי נימים עקביות בכל הבקבוקונים. שימו לב לגודל של חורים, כמו חורים גדולים לאפשר בריחה של זבובים מתוך צלוחיות. בנוסף, מומלץ להשתמש צד החלק של התקע (בדרך כלל מול הצד החתוך) כצד יפנה כלפי מטה כאשר מוכנסים לתוך הבקבוקון, כמו חיתוך התקע יוצר כמה סיבים רפויים וקטנים כי הזבובים יכולים להסתבך ב .
   6. להכין מספר רב של בקבוקונים ומתאמים לשמש במערכת מזין נימים (CAFE)הניסויים המתוארים בשלב 2.3.
2. הכנת בקבוקוני מזון זכוכית קטנה
   1. יום לפני איסוף הזבובים (שלב 1.4), לארגן 200 צלוחיות זכוכית על מתלים צינור microcentrifuge. ממיסים לטוס המזון (על פי המתכון מולסה קמח תירס, ראה טבלה של חומרים) באמצעות מיקרוגל. יוצקים 2 מ"ל של אוכל לטוס לתוך צלוחיות זכוכית (נסו לא למרוח את האוכל על קירות בקבוקון). תן להקשיח מזון, ולכסות את הבקבוקונים בניילון נצמד.
      הערה: צלוחיות זכוכית המכיל את האוכל יכול להיות כל הזמן על 4 מעלות צלזיוס במשך כמה שבועות.
   2. ביום אוסף לטוס, לקחת את בקבוקוני מהמקרר ולתת להם להגיע RT לפני השימוש בהם כדי לשכן זבובים.
      הערה: אם בקבוקונים מזון כמה שבועות, לוודא כי המזון הוא עדיין שלם ולא מנותק מבקבוקון, כמו זבובים יכולים להיות לכודים הסדקים בין מזון לבין הזכוכית.
3. פתרון מזון מניית ביצוע עבור assay מזין נימים
   1. מראשלקלף את הפתרון מזון המניה (5% סוכרוז ותמצית שמרים 5%), לפזר 5.88 גרם של תמצית שמרים 5.88 גרם של סוכרוז 100 מ"ל של מים מזוקקים.
      הערה: פתרון המניות הוא נוטה מאוד זיהום. לכן, מומלץ החיטוי זה (121 ° C, 30 דקות, וללא מחזור ייבוש) ו aliquot אותו לתוך 850 μL לעבוד aliquots להישמר על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. ריכוז החומרים פתרון המניות הוא 5.88% ויגיע את הריכוז הסופי של 5% לאחר תוספת של 15% אתנול או מים (150 μL לתוך 850 μL של פתרון מזון התערובת של העוגיות) ממש לפני השימוש בו בשלב 2.3.
4. איסוף זבובים הניסיונות
   1. אסוף 200 זבובים זכר תמים באמצעות כרית ₂ CO.
      הערה: השתמש בכל זן מעבדה רלוונטי לשאלה הניסיונית. 250 זבובים ניתן לאסוף בקלות מחמישה בקבוקי זבובים בשלב איסוף eclosion שלהם. כאשר איסוף הזבובים, מקפיד הקפדה יתרה על colזבובי lect אשר eclosed לאחרונה (זבובים למראה בתולה: זבובים בהירים עם כתם מקוניום על הבטן שלהם). זבובים הניסיונות צריכים להישמר בנפרד צלוחיות זכוכית קטנות המכילות מזון בגילים עד 3 - 4 ד ישן לפני בשימוש בניסוי.
   2. השתמש תקעים רכים לסגור את הצלוחיות.
      ההערה: אותה התקעים הרכים יהיו שימושיים מאוד עבור שלב ההכשרה בעת שימוש שאיפת פה להכניס נקבות לתוך ומחוץ הצלוחיות בשלב הניסיון.
5. איסוף זבובים מאמנים
   הערה: כל הזבובים שנאספו צריכים להישמר בתוך 12 שעות / 12 שעות אור / חממה בחושך ב 25 ° C ו -70% לחות יחסית (RH). 12 שעות / 12 שעות האור / חושך המחזור ניתן לשנות את זמן התחלה נוח.
   1. זבובי מאמן נקבה בתולים
      1. אסוף 500 מאמן נשי בתולת זבובים ממלאי WT או מנית virginator לשימוש כמו נקבות פתוחות בתולה. שמור על הזבובים הנשיים בקבוצות של 25 לכל בקבוקון מזון בגודל רגיל, וכלOW להם גיל 3 - 4 ד הישן לפני השימוש בהם בניסוי.
   2. זבובי מאמן נקבת הזדווגו
      1. אסוף 300 נקבות זבוב בתולה ממלאת WT או מנית virginator לעבור הזדווגות לפני שלב אימונים (שלב 1.6.1).
         הערה: זבובים נקבה נשמרים בקבוצות של 10 נקבות לכל בקבוקון מזון רגיל בגודל בגילים עד 3 - 4 ד הישן לפני בשימוש בניסוי.
   3. זבובי זכר המשמשים לייצור זבובי מאמן נקבת הזדווגו
      1. אסוף 150 זבובים זכרים (לא בהכרח בתולה).
         הערה: זבובים נשמרים בקבוצות של 15 זכרים לכל בקבוקון מזון רגיל בגודל בגילים עד 3 - 4 ד ישן בטרם זיווג עם נקבת בתולת זבובים ליצור נקבות מאמן הזדווגו.
6. יצירת זבובי מאמן נקבת הזדווגו
   1. כדי ליצור נקבה הזדווגו טס לשמש מאמנים, קבוצות זוג 10 נקבה בתולה טס עם 15 גברים זבובים ידי מרפרף בקבוקון המכיל זכר אחד לנקבה-containing 16 בקבוקון - 18 שעות לפני שלב האימונים (שלב 2.1) ^10.
      הערה: זה צריך בדרך כלל מתקיים בערב לפני האימון. 1.5: 1 היחס בין הזכר טס נקבות זבוב מבטיח שכל הנקבות תהיינה הזדווגו.
   2. ביום הניסוי, להפריד את הנקבות הזדווגו מהזכרים ידי aspirating הזכרים מתוך הבקבוקון באמצעות aspirator הפה. בצע את זה כמו שצריך לפני תחילת כל יום אימונים.

2. שלבי ניסיוני

1. הגדרת שלב הניסיון
   1. הפעל את הניסוי הקרוב ככל האפשר לתחילת שלב האור בחממה. מניח את הנקבות המאמנות (הן בתולה הזדווגו) בחדר ההתנהגות.
      הערה: מומלץ לבצע את הניסוי בתא התנהגות, או כל סביבה מבודדת כי הוא שקט מוגדר 25 ° C ו 60 - 65% לחות יחסית. שמירת לחות מעל 50% חשובים מאוד, שכן התנהגות חיזור והזדווגותים תלוי חישת פרומון, אשר ידועה להיות רגיש ללחות.
2. חשיפת זבובים זכרו לחוויות מתגמלות nonrewarding
   1. מסדר את צלוחיות זכוכית המכילות זבובי הזכר היחידים על מתלי microcentrifuge, מיצוב הבקבוקונים בשולי המדף.
      הערה: הסדר זה מאפשר הנסיין להתבונן הזוגות בקלות זבובים העוברים הזדווגות מבלי לקחת את הבקבוקונים מתוך המדף.
   2. כן (כמתואר בשלב 2.2.1) 2 קבוצות של 100 צלוחיות זכוכית המכילות זכר יחיד עף על מתלים נפרדים לגברים שעברו חוויות הזדווגות מתגמלות nonrewarding (דחו כלומר ומזדווגים).
   3. לשאוב נקבות מאמנות ולהוסיף אותם כל בקבוקון המכיל את הזבובים זכר. כיוונתי את הטיימר ל- 1 h. החל בקבוצת דחה, להוסיף נקבה הזדווגו בקבוקון אחד. ואז, על מנת להעביר את הגברים להיות הזדווגו ולהוסיף נקבת בתולת בקבוקון אחד.
   4. צפו מפגשי ההזדווגות מקרובלוודא כי הזכרים אינטראקציה עם נקבות בתולה להזדווג בהצלחה במהלך השעה הראשונה וכי הזכרים אינטראקציה עם הנקבות-הזדווגו בעבר לא מזדווגים. כדי לפקח על העוקבה דחתה במשך 1 שעה, להגדיר טיימר שנייה במשך 15 דקות ולצפות הזכרים כל 15 דק '.
   5. פריקת הזכרים מהמחזור דחה שהצליח להזדווג והזכרים ממחזור הזדווגו שלא הסתיים עד הזדווגות עד סוף האימון הראשון.
   6. סיים את האימון הראשון על ידי aspirating את מאמני נקבה-הזדווגו בעבר לתוך בקבוקון אוכל לטוס קבוע, ולשמור אותם על פגישת המיזוג הבאה. בצע שלב זה על ידי aspirating הנקבות בעדינות מקבוצת זכר הזדווגו.
   7. בואו הזבובים לנוח במשך 1 שעה.
   8. חזור על שלבי 2.2.3 - 2.2.7 פעמים.
   9. חזור על אימון בצעדים 2.2.3 - 2.2.8 בכל יום במשך 3 יותר ד.
3. צריכת הקלטה (CAFE)
   1. בסוף של conditionin האחרוןפגישת g (יום רביעי), לשאוב זכרים הבודדים וקבוצה אותם לתוך צלוחיות מזין נימים. אין להשתמש בתקע רך לכסות את בקבוקון נימי מזין תוך שהוא מחדיר את הזבובים, ולהחליף אותו במהירות עם תקע מזין נימי המוכן לאחר כל הזבובים הוכנסו. קבוצה 6 - 8 זבובים מכל אחת הקבוצות הניסיוניות לתוך בקבוקון, יצירה לא פחות מ -8 צלוחיות לכל מצב.
   2. להרטיב את האטמים ידי ההוספה בעדינות 5 מיליליטר של מים לחלק העליון של התקע. היזהר בעת הוספת מים כדי למנוע שפיכה לתוך צלוחיות. להוסיף כמות שווה של מים כדי בקבוקון אחד.
      הערה: צעד זה נעשה כדי להפחית את האידוי מן הנימים. לכן, זה חוזר על עצמו מדי יום למשך שארית של הניסוי. בהתאם הלחות יחסית, בימים הבאים, ייתכן שיידרשו פחות בתוספת מים את המצתים.
   3. כן שני פתרונות מזון נפרדים על ידי הוספת אתנול או מים אל aliquots מזון המנייה ליצור ריכוז סופי של 15%.
   4. כדי למלא את capillטלה עם שני פתרונות המזון, ליצור 5 μL מזון נוזל טיפות על רצועת סרט מעבדה ולאפשר הפתרון למלא את הנימים עד שהוא מגיע סימן 5 μL. הקפד להשתמש הסוף הברור של הנימים, שהוא קרוב לקו הסימן שחור 5 μL.
      הערה: כדי למלא כמה נימים בו-זמנית, אפשר להתחבר 6 - 8 מתאמי נימי יחד ולהשתמש בהם כתוספת לקיים הנימים.
   5. קש על הנימים בעדינות על רצועת פרפין כדי למקם את פתרון מזון בדיוק על הסימן השחור. חותם את הנימים ידי טבילה בסוף כל נימים לתוך טיפות קטנות של שמן מינרלים. צעד זה ממזער אידוי פוטנציאל של פתרון המזון.
   6. הכנס שתי נימים המכילים אתנול ושני נימים המכיל nonethanol דרך 4 מתאמים / המחזיקים בתקע עד הצדדים החשופים של הנימים בקושי להציץ מן הפנים של (מ"מ 1 או פחות ממשטח התקע) בקבוקון.
      הערה:שמירה על פתיחת הנימים הקרובות התקע הרטוב מפחית התאדות ומאפשרת גישה נוחה המזון, כמו זבובים בדרך כלל יושבים על התקעים לרדת על הנימים חשופות להאכיל.
   7. בנוסף בקבוקונים המכילים זבובים ניסיוניים, להכין בקבוקון מדומה ללא זבובים. שליטה זו משמשת להעריך אידוי טבעי.
      הערה: נסה לשמור מיצוב שווה יחסי של פתיחת הנימים לעומת מצת, כמו הבדלים יכולים להוביל אידוי משתנה נתוני צריכה מטעה. לשמור על לחות נאותה במהלך הניסוי ומקם את הפתחים נימי ככל האפשר אל התקע הרטוב, כמו לחות נמוכה ומרחק גדול המשקע הרטוב עלולים הן תוצאת אידוי לא מבוקר.
   8. רשום את המיקום היחסי של הנוזל בכל הנימים עם ביחס לקו הסימן השחור במ"מ באמצעות סרגל, ולכתוב ערכים אלה למטה.
      הערה: אם הפתרון ממוקם בדיוק על l השחורine, הערך צריך להיות שווה אפס, ואם הוא מעל או מתחת, זה צריך להיות בערכים חיוביים או שליליים, בהתאמה. הרמות הראשוניות של הנוזל להגדיר את נקודות ההתייחסות לערכי הצריכה הסופית O / N.
   9. הגדר את הצלוחיות בחזרה בחממה במשך 24 שעות. חלף הנימים בכל פעם קבועה לאורך כל הניסוי כולו.
   10. הסר את הנימים בעדינות מן הצלוחיות למדוד את הרמות של נוזל עם ביחס לקו סימון השחור.
   11. בזהירות לבדוק את רמת הנוזל בבקבוקון המדומה.
       הערה: אם רמות ירד יותר מ 2 מ"מ, הוא מציין כי האידוי גבוה ואת רמות הצריכה אינן אמינות.
   12. לחלח את המצתים בעדינות עם 2 מ"ל מים ולהכניס סט חדש של נימים, כמצוין צעדים 2.3.3 - 2.3.10. הגדר את הצלוחיות בחזרה בחממה במשך 24 שעות.
4. העדפת קביעה
   1. חשב את סך הצריכה של כל נימים על ידי הפחתת הרמה הסופית של iרמת nitial בנקודת ההתחלה.
   2. מערבבים את הערכים של שני נימים עם אותו מזון (כלומר nonethanol נימים בנפרד נימים המכיל אתנול).
   3. חישוב העדפת אתנול על ידי הפחתת הכמות הנצרכת מן הנימים הלא אתנול מן הכמות הנצרכת מן הנימים המכילים אתנול ולחלק את הערך על ידי ערכי צריכה הכוללים מכל בנימים אותו הבקבוקון.
   4. ממוצע מדדי ההעדפה של כל הבקבוקונים של אותה קבוצת הניסוי.
      
      הערה: Nonethanol 1 (NE1), Nonethanol 2 (NE2), אתנול 1 (E1), אתנול 2 (E2), nonethanol סה"כ (NE סה"כ) = NE1 + NE2, אתנול סה"כ (ה 'סכום) = E1 + E2, סך יתרת הצריכה (סה"כ סכום) = + NE סך הכל E, ואתנול העדפה אינדקס (PI)

תוצאות

FPreviously, Devineni et al. הראה שכאשר זבובי פירות ניתנים הבחירה לצרוך מזון המכיל אתנול, הם מציגים העדפה חזקה למזון המכיל אתנול מעל nonethanol המכיל מזון ^6. המוצגים כאן הן כמה תוצאות נציגים השגנו כאשר מנסים לאמוד העדפת אתנול המולד של זבובי זכרים תמימים שלא עברה פרוטוקול האימון.

זבובי זכר S הנאיבי קנטון נאספו על eclosion, בגילים...

דיון

כאן, אנו מדגימים את הפרטים של גישה משולבת למדידת שינויים בהתנהגות חיפוש תגמול, בהתבסס על עבודות קודמות שתוארו על ידי Devineni et al.⁶ ושוחט-אופיר ואח'⁵. החלק הראשון של הפרוטוקול משתמש בסוגים שונים של אינטראקציות מיניות כקלט החוויה, והחלק השני משתמש במבחן הזנה דו-ברירה כדי להעריך את השפעת החוויה על ההעדפה לצרוך אתנול.

כפי שמוצג על ידי Devineni et al.⁶, ניהול עצמי של אתנול בזבובים הוא התנהגות חזקה, המאופיינת בהתחלה בהעדפה נמוכה ומשתנה ש...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
בקבוקוני פוליסטירן 25 x 95 מ"מ	FlyStuff	32-109
בקבוקוני פלסטיק צרים FlyStuff		42-102
מחט סטרילית חד פעמית 18 גרם ו-27 גרם	ניתן לרכוש על ידי כל חברה		1.20 X 38 מ"מ (18 G x 1 1/2 אינץ'), 0.40 X 13 מ"מ (27 G x 1/2 אינץ')
10 x 75 מ"מ צינורות תרבות חד פעמיים מזכוכית בורוסיליקט	kimble chase	73500-1075
פיפטות מכוילות 5 & #956; L	VWR	53432-706	מקודד בצבע לבן להכיל 5 μ L
שמן מינרלי	סיגמא-אולדריץ'	M5904
סוכרוז, ביולוגיה מולקולרית כיתה	CALBIOCHEM	573113
אבקת תמצית שמרים למיקרוביולוגיה	ניתן לרכוש על ידי כל חברה
אתנול	סיגמא-אולדריץ'	32221
קצות פיפטה סטנדרטיות (מיקרו-פיפטים)	ThermScientific	T114R-Q	נפח: 0.1 - 20 & #956; L (אולטרה-מיקרו)
IDENTI-PLUGS (תקעי צינור קצף)	Jaece	L800-A	מתאים לפתח 6 - 13 מ"מ
IDENTI-PLUGS (תקעי צינור קצף)	Jaece	L800-D	מתאים לפתח 35 - 45 מ"מ
Virginator Fly Stock	מרכז מניות בלומינגטון דרוזופילה	#24638
בקבוקונים צרים, חבילת מגשים (PS)	Genesee Scientific Corporation	# 32-109BR
Drosophila Media מתכונים ושיטות	מרכז המניות בלומינגטון דרוזופילה	http://flystocks.bio.indiana.edu/Fly_Work/media-recipes/molassesfood.htm
חומצה פרופיונית	סיגמא-אולדריץ'	P5561
חומצה זרחתית	סיגמא-אולדריץ'
מת'ל 4-הידרוקסיבנזואט	סיגמא-אולדריץ'	H3647
אגר	ניתן לרכישה על ידי כל חברה
קמח תירס	ניתן לרכוש על ידי כל חברה
מולסה של סבתא	B& G Foods, Inc	לא צוין
שמרים יבשים מיידיים	ניתנים לרכישה על ידי כל חברה