כאן, אנו מציגים פרוטוקול להחדרת בדיקות כימיות באופן ספציפי לתוך מקטע נוגדנים על ידי שילוב גנטי של חומצת אמינו המכילה אזיד, ולאחר מכן צימוד האזיד עם בדיקה כימית על ידי תוספת ציקלו-אזיד-אלקין המקודמת על ידי זן (SPAAC).
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
יעיל אתר ספציפי תיוג נוגדן ידי cycloaddition יזיד-אלקין קדם-Strain
במאמר זה
סיכום
תקציר
כרגע יש הרבה כלים כימיים זמינים להציג בדיקות כימיות לחלבונים ללמוד המבנה והתפקוד שלהם. שיטה יעילה היא הצמידה חלבון על ידי החדרה גנטית חומצת אמינו טבעית המכילה קבוצה פונקציונלית bioorthogonal. דו"ח זה מתאר פרוטוקול מפורט נטיית נוגדן אתר ספציפי. הפרוטוקול כולל פרטים ניסיוניים עבור שילוב הגנטי של חומצה תזיד המכיל אמינו, ותגובת הנטייה ידי cycloaddition אלקין-יזיד קדם-זן (SPAAC). התגובה זן-קידם זה ממשיך ידי ערבוב פשוט של מולקולות מגיבים ב- pH וטמפרטורה פיזיולוגיים, ואינו דורש ריאגנטים נוספים כגון יוני נחושת (אני) ו ligands chelating-נחושת. לכן, שיטה זו תהיה שימושית עבור נטיית חלבון בכלל ופיתוח של conjugates תרופת הנוגדן (ADC).
מבוא
מאז ההתאגדות הגנטית של -methoxyphenylalanine p ב Escherichia coli נמסרה, 1 יותר מ -100 חומצות אמינו לא טבעיות (UAAs) שולבו בהצלחה לחלבונים שונים. 1-3 בין UAAs אלה, חומצות אמינו המכילות קבוצות פונקציונליות bioorthogonal נחקרו רבות ומייצגים את השיעור הגבוה ביותר. הקבוצות הפונקציונליות bioorthogonal המשמשים UAAs כוללים קטון, 4 אזיד, 5 אלקין, 6 cyclooctyne, 7 tetrazine, 8 α, β אמיד-בלתי רוויות, 9 norbonene, 10 transcyclooctene, 11 ו bicyclo [6.1.0] -nonyne. 11 למרות כל קבוצה פונקציונלית יש יתרונ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. בניית פלסמיד
- לבנות פלסמיד ביטוי (pBAD-HerFab-L177TAG) שיבטא את הגן נוגדן היעד (pBAD-HerFab-WT) עם -tag 6 שלו, ולהחליף את קודון עבור לאוצין-177 עם קודון ענבר (TAG) 27, באמצעות טכניקת mutagenesis אתר מכוון קונבנציונלית.
ראה טבלה של חומרים. - לבנות עוד פלסמיד ביטוי (pEVOL-AFRS) המכיל את הגנים עבור Tyr tRNA התפתחו synthetase aminoacyl-tRNA (המפיצים המורשים) זוג. השתמש וקטור הפלסמיד והמעוצב, pEVOL, עבור התאגדות יעילה של UAAs. פרוטו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
במחקר זה, מקטע נוגדן היה האתר ספציפי מצומדות עם fluorophore על ידי שילוב של חומצות אמיניות המכילים תזדנה לתוך שהבר ותגובת שבר נוגדני המוטציה עם cyclooctyne מתוח (איור 1). HerFab נבחרה נוגדן היעד שלתוכו AF התאגד חומצת אמינו תזיד המכיל. כדי לבחור את שאריות HerFab להחלפה עם AF, המבנה הגבישי רנטגן של HerFab נותח. 30 דרישות חשובות עבור השאריות כוללות מספיק מרחק מאתר הנוגדן המחייב כדי למזער את הירידה וזיקתה מחייבת ונגישות ממס .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
השילוב הגנטי של חומצות אמינו לא טבעיות לחלבונים יש מספר יתרונות על פני שיטות אחרות משמשות שינוי חלבון. 1-3 אחד היתרונות החשובים הוא התחולה הכללית שלה לכל סוג של חלבון. באופן עקרוני, אין הגבלה בבחירת חלבון מטרה ואתר היעד של החלבון. עם זאת, החלפת משקע מבני או תפקודי חשובה עם UAA עלולה לגרום לשנות את המבנה והתפקוד של חלבון המטרה. באופן כללי, שאריות חשופות ממס לא אינטראקציה עם שאריות אחרות נבחרות עבור התאגדות של UAAs. לכן, מידע מבני מתוך מבנה הגבישי ברזולוציה גבוהה משמש כדי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <חזק>1. בניית פלסמיד | |||
| פלסמיד pBAD_HerFab_L177TAG | אופציונלי להכיל את קודון העצירה הענבר (TAG) במיקום הרצוי. Ko, W. et al. תיוג נוגדנים יעיל וספציפי לאתר על ידי תוספת ציקלו-אזיד-אלקין המקודמת על ידי זנים. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015) | ||
| פלסמיד pEvol-AFRS | Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., and Schultz, P. G. מערכת משופרת למוטגנזה לא טבעית של חומצות אמינו ב-E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010) | ||
| DH10B | Invitrogen | C6400-03 | מארח |
| פלסמיד מיני ערכת הכנה | Nucleogen | 5112 | 200/pack |
| Agarose | Intron biotechnology | 32034 | 500 גרם |
| אתידיום ברומיד | אלפא Aesar | L07482 | 1 גרם |
| מרק LB | BD Difco | 244620 | 500 g |
| <חזק>2. הכנת תרבית | |||
| <חזק>2.1 אלקטרופורציה | |||
| מיקרו פולסר | BIO-RAD | 165-2100 | |
| מיקרו פולסר | קובטה BIO-RAD | 165-2089 | 0.1 ס"מ פער אלקטרודות, חבילה של 50 |
| אמפיצילין נתרן | וואקו | 018-10372 | 25 גרם |
| כלורמפניקול | אלפא Aesar | B20841 | 25 גרם |
| אגר | SAMCHUN | 214230 | 500 גרם |
| SOC בינוני | סיגמא | S1797 | 100 מ"ל |
| <חזק>3. ביטוי וטיהור של HerFab-L177AF | |||
| 3.1 ביטוי של Herfab-L177AF | |||
| p-azido-L-phenylalanine (AF) | Bachem | F-3075.0001 | 1 גרם |
| L(+)-Arabinose, 99% | Acros | 104981000 | 100 גרם |
| חומצה הידרוכלורית, 35~37% | SAMCHUN | H0256 | 500 מ"ל |
| <חזק>3.2 ליזיס תאים | |||
| טריס(הידרוקסימתיל)אמינומתאן, 99% | SAMCHUN | T1351 | 500 גרם |
| EDTA דיסודיום מלח דיהידרט, 99.5% | SAMCHUN | E0064 | 1 ק"ג |
| סוכרוז | סיגמא | S9378 | 500 גרם |
| ליזוזים | סיאקו | 126-0671 | 1 גרם |
| <חזק>3.3 Ni-NTA כרומטוגרפיה של זיקה | |||
| שרף Ni-NTA | QIAGEN | 30210 | 25 מ"ל |
| עמוד פוליפרופילן | QIAGEN | 34924 | 50/אריזה, קיבולת 1 מ"ל |
| אימידזול, 99% | SAMCHUN | I0578 | 1 ק"ג |
| נתרן פוספט מונובסיסי, 98% | SAMCHUN | S0919 | 1 ק"ג |
| נתרן כלורי, 99% | SAMCHUN | S2907 | 1 ק"ג |
| <חזק>4. צימוד של HerFab-L177AF מטוהר עם בדיקות אלקין באמצעות Azide-alkyne Cycloaddition (SPAAC) | |||
| Cy5.5-ADIBO | FutureChem | FC-6119 | 1 מ"ג |
| <חזק>5. טיהור מסננים צנטריפוגליים מסומנים HerFab | |||
| Amicon Ultra 0.5 מ"ל | MILLIPORE | UFC500396 | 96/חבילה, 500 ו-#956; קיבולת L |
| <חזק>6. ניתוח SDS-PAGE של HerFab וסריקת ג'ל פלואורסצנטי | |||
| 1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5% | Sigma | 10708984001 | 10 גרם |
| NuPAGE LDS מאגר דגימה, 4x | Thermofisher | NP0007 | 10 מ"ל |
| MES מאגר ריצה | Thermofisher | NP0002 | 500 מ"ל |
| Nupage Novex 4-12% SDS PAGE ג'לים Thermofisher | NO0321 | 12 בארות | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Wako | 031-17922 | 25 גרם |
| טייפון 9210 מצלמת מצב משתנה | Amersham Biosciences |
מקורות
- Wang, L., Schultz, P. G. Expanding the genetic code. Angew. Chem. Int. Ed. 44 (1), 34-66 (2004).
- Wu, X., Schultz, P. G. Synthesis at the interface of chemistry and biology. J. Am. Chem. Soc. 131 (35), 12497-12515 (2009).
- Liu, C. C., Schultz, P. G.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
