הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בידוד והתרבות של תאי גזע בוגרים עצביים מאזור העכבר Subcallosal

15.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54929

⸱

15 בדצמבר 2016

 ,  , 
1Department of Anatomy, Korea University College of Medicine

במאמר זה

סיכום

הקמת מערכות תרבית להרחבת תאי גזע עצביים בוגרים (aNSCs) מאפשרת בדיקה ויישום של תאי גזע עצביים בוגרים לטיפול. האזור התת-קלוסלי (SCZ) הוכר לאחרונה כאזור חדש ליצירת נוירובלסטים בעכברים בוגרים. כאן מתוארות שיטות לבידוד, הרחבה ובידול של SCZ-aNSCs.

תקציר

תאי גזע עצביים בוגרים (aNSCs) יכולים לשמש להתחדשות רקמת מוח פגועה. לתאי גזע עצביים יש פוטנציאל להתמיינות והתפשטות לשלושה סוגי תאים: נוירונים, אסטרוציטים ואוליגודנדרוציטים. זיהוי אזורים שמקורם ב-aNSC ואפיון תכונות ה-aNSC הם קריטיים לשימוש פוטנציאלי ב-aNSCs ולהבהרת תפקידם בהתחדשות עצבית. האזור התת-קלוסלי (SCZ), הממוקם בין החומר הלבן להיפוקמפוס, דווח לאחרונה כמכיל aNSCs ומוליד ללא הרף נוירובלסטים. אחוז נמוך של aNSCs מה-SCZ מובחן לנוירונים; רוב התאים מתמיינים לתאי גליה, כגון אוליגודנדרוציטים ואסטרוציטים. מוצע כי לתאים אלה יש פוטנציאל טיפולי לפגיעה טראומטית בקליפת המוח. פרוטוקול זה מתאר בפירוט את התהליך ליצירת SCZ-aNSCs ממוח של עכבר בוגר. מטריצת מוח עם מרווחים של 1 מ"מ משמשת להשגת פרוסות העטרה המכילות SCZ ולניתוח מדויק של ה-SCZ מכל המוח. קטעי SCZ נתונים בתחילה לתרבית נוירוספרה. מערכת תרבית מפותחת מאפשרת לאמת את המאפיינים שלהם ויכולה להגביר את המחקר על NSCs. מערכת תרבית נוירוספירה מספקת כלי שימושי לקביעת התפשטות ואיסוף תאי גזע עצביים אמיתיים. תרבית חד-שכבתית היא גם מערכת חוץ גופית לבדיקת התפשטות ובידול. באופן משמעותי, מערכת תרבית זו מספקת סביבה הומוגנית יותר ל-NSCs מאשר מערכת התרבות הנוירוספרית. לפיכך, באמצעות אזור מוח נפרד, מערכות תרבית אלה יעזרו להרחיב את הידע שלנו על תאי גזע גזעיים ויישומיהם לשימושים טיפוליים.

מבוא

NSCs יש מאפיינים של חידוש עצמי והתמיינות מרובת שושלות. כדי לאשר תכונות אלה, נעשה שימוש נרחב במערכת תרבית נוירוספרה. מערכת התרבית הנוירוספרית פותחה בתחילת שנות ה-90 ושימשה כמערכת תרבית תאי גזע סטנדרטית1. בהתאם לעוצמת החידוש העצמי, תאי גזע גזעיים מתרבים ללא הרף ומייצרים מסת תאים בתרבית תרחיף. מספר התאים וגודל הנוירוספירה נחשבים קשורים קשר הדוק לתכונות ההתפשטות של תאי גזע עצביים. תרביות חד-שכבתיות נמצאות בשימוש נרחב גם לתחזוקה והתמיינות של תאי גזע עצביים. בהשוואה לתרבית הנוירוספרה, מערכת התרבית החד-שכבתית מספקת תחזוקה והרחבה הומוגנית טובה יותר של תאי גזע גזעיים2. שתי מערכות התרבית המפותחות הללו תרמו לאפיון של aNSCs במבחנה.

NSCs שוכנים באזורי מוח שונים, כגון האזור התת-חדרי (SVZ) של החדר הצדדי והאזור התת-גרגירי (SGZ) של ההיפוקמפוס3-5. האזור התת-קלוסלי (SCZ) של החומר הלבן התת-קורטיקלי הזנבי מוכר כאזור נוירוגני חדש6-8. לאחרונה דווח כי ל-SCZ-aNSCs יש פוטנציאל טיפולי בפגיעה מוחית טראומטית9. בהשוואה לאזורים נוירוגניים אחרים, ה-SCZ שוכן לאורך החומר הלבן התת-קורטיקלי. במוח האנושי, החומר הלבן התת-קורטיקלי תופס אזור גדול יותר מאשר במוח העכבר10. לכן, הבנה של המאפיינים של SCZ-aNSCs באמצעות מערכת תרבית חוץ גופית חשובה על מנת לקדם את השימוש הפוטנציאלי בתאים אלה להתחדשות עצבית. נדרשת דיסקציה מדויקת של אזור המוח הרצוי כדי לשלול זיהום אפשרי על ידי אזורים לא רצויים המכילים תאי גזע עצביים פעילים או שקטים. לדוגמה, ניתן להפעיל aNSCs באזורים לא נוירוגניים ולייצר תאים עצביים חדשים במוח פגוע או במהלך תרבית חוץ גופית 11. כדי להשיג תאי גזע עצביים מה-SCZ, תאים נאספו מפרוסות מוח שהכילו את ה-SCZ. לאחר מכן, בוצעה מיקרו-דיסקציה זהירה של אזור SCZ באמצעות מחט דקה. כדי ליצור את הנוירוספירה מה-SCZ, גושי רקמת SCZ שנותחו במיקרו פורקו לתאים בודדים ולאחר מכן תרבו כתרחיף בנוכחות גורם גדילה אפידרמיס (EGF) וגורם גדילה פיברובלסטים בסיסי (bFGF). לאחר ש-SCZ-aNSCs יוצרים נוירוספרות, ניתן לשמור עליהם גם כנוירוספרות או חד-שכבות להתרחבות. הליך זה מדגים גם תהליכי צביעה חיסונית עם סמנים שונים לזיהוי NSCs וצאצאיהם לאחר התרחבותם והתמיינותם בתרבית חד-שכבתית. כאן מוצג פרוטוקול חזותי של מערכת התרבית SCZ-aNSC. פרוטוקול זה מכיל הוראות מפורטות למיקרו-דיסקציה של אזור SCZ ולתחזוקה ומעבר של התאים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת חומרים והתרבות בינונית

  1. עבור לנתיחה ו דיסוציאציה של SCz, לעטוף את מטריקס המוח, סכין גילוח פיפיות, מלקחיים עם רדיד אלומיניום, ולאחר מכן לעקר אותם על ידי מעוקר.
  2. כן 50 מיליליטר של חיץ קר PBS לשטוף את מוח העכבר כולו.
  3. הגדרת מיקרוסקופ לנתיחה ולהכין את כלי הניתוח הנדרש דיסקציה של (מספריים autoclaved מלקחיים) המוח ואת הבידוד של (מזרק 1 מ"ל, 30 מחט G, מטריקס המוח, מלקחיים בסדר) SCz.
  4. הכנת N2 בינוני:
    1. הכן F-12 / DMEM (+ L-glutamin, + סודיום ביקרבונט) בינוני עם 2% B27, 1% תוספי N2, ו -1% פניצילין, סטרפטומיצין.
      הערה: מדיום הגידול מורכב גורמים בינוניים וצמיחת N2 (20 ng / mL גורם גדילה באפידרמיס המטוהר (EGF) ו -20 ng / mL גורם גדילה פיברובלסטים בסיסית (bFGF2)).
  5. הכן חיץ העיכול (40 יחידה / מ"ל ​​פפאין, 2.4 יחידת / dispas מ"להדואר השני, ו -2% פניצילין, סטרפטומיצין ב PBS) לעיכול רקמה.
  6. הכנת צלחת ציפוי Coverslip:
    1. הכן-פולי-L ornithine (אש"ף; 0.01%) ו laminin (10 מיקרוגרם / מ"ל מומס O DH 2). כדי 6 צלחות גם מעיל לשמירה על SCz-aNSCs כמו בשכבה או 18 מ"מ coverslips עבור immunostaining, דגירה אותם עם אש"ף לילה ב 4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן לשטוף אותם 3 פעמים עם DH 2 O. אפשר הצלחות ו coverslips להתייבש אחרי הכביסה האחרונה.
    2. לאחר מכן, דגירה צלחות עם laminin לילה בשעה 4 ° C. לאחר מכן, לשטוף אותם 3 פעמים עם DH 2 O.
      זהירות: אל לייבש את laminin, אשר ישפיע מצורף התא.
      הערה: פתרונות הציפוי ניתן לעשות שימוש חוזר 3 פעמים.

בידוד דיסוציאציה 2. למבוגרים SCz

  1. לפני הכנת תרבות, למקם את מטריקס המוח גילוח פיפיות על הקרח.
    הערה: אין להקפיא מטריצת המוח, משום brAin יכול לצרף אליו.
  2. הקורבן עכבר (8 שבועות) בחנק CO 2 או נקע בצוואר הרחם.
    1. חותך את הראש במספריים חדים לאחר ריסוס 70% אתנול. כדי לשתק את הראש, להחזיק בשני צידי הראש בחוזקה. חותכים את העור עם מספריים על קו האמצע לכיוון הזנב-מקורי. זה מקדם את הסרה מלאה של העור מהגולגולת.
    2. הסר את חלק הזנב של גולגולת (אחורי למבדה) ראשונה, ולאחר מכן הכנס את המלקחיים בין הגולגולת והמוח במיקום קו אמצע הגבה. תפוס שמאל (או ימין) עצם הקודקוד ובזהירות לקלף אותו. חזור על הליך זה עבור הסרת עצם הקודקוד האחר.
      הערה: ניתוק של עצב הראייה והסרת קרומי המוח מהמוח להקל לנתק את המוח מהגולגולת.
    3. מעבירים את המוח למאגר קר PBS (25 מ"ל) ולשטוף אותו פעמיים כדי להסיר דם עודף.
  3. מניח את המוח לתוך מטריצת המוח על קרח make חתכי עטרה להשיג 1 מ"מ פרוסות עבות. מעבירים את פרוסות המוח (1 מ"מ) הכוללים את האזורים SCz הממוקמים בחלק האחורי של המוח על PBS קר בצלחת פטרי פלסטיק 35 מ"מ.
    זהירות: כדי להשיג מטוס מקביל סעיפי עטרה, להבטיח כי בקע המוח יוצב קו האמצע של מטריקס המוח; זה קריטי כדי למנוע וריאציות מיותר בסעיפים.
    הערה: קבל פרוסות מוח אחורי 2-3 מ"מ עד גבחת; זה מאפשר הפרדה בין SCz מן SVZ.
  4. תחת המיקרוסקופ לנתח עם בהגדלה נמוכה, מיקרו-לנתח את SCz מאזור בחומר הלבן של קליפת המוח ואת ההיפוקמפוס עם 6,9 מחט 30G מכופף. לאחר מכן, להסיר את האזורים בקליפה מעל SCz. מניח את אזור SCz גזור מן הפרוסות לתוך צלחת פטרי פלסטיק 35 מ"מ על קרח בלי קר PBS.
    הערה: זיהום של אזורים נוספים המכילים נוירונים בוגרים יכול להשפיע על הכדאיות של aNSCs ו- B היווצרות neurosphereecause שהם עוברים מוות של תאים בתנאי תרבות aNSC.
  5. באמצעות מחט כפוף 30 G, מייד לקצוץ הרקמות הגזורות לחתיכות קטנות.
    הערה: אם זמן רב יותר נדרש לנתח את רקמת SCz, לטבול את הרקמות הגזורות בקור PBS לפני החיתוך.
  6. Re- להשעות את רקמת קצוץ עם 1 מ"ל של חיץ העיכול, להעביר את רקמת לצינור 15 מ"ל המכיל 2 מ"ל של חיץ העיכול, דגירה אותו במשך 30 דקות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
    הערה: יש לנער את הצינור כל 10 דקות לערבב היטב.

3. Subcallosal אזור נגזרות תרבית תאי גזע בוגרים העצביים

  1. לחץ על הצינור במתינות כדי לנתק את הרקמה מתעכלת, ולאחר מכן צנטריפוגות הצינור ב 145 XG במשך 5 דקות. בטל supernatant, מחדש תלויה הרקמה מתעכל עם 1 מ"ל של מדיום מראש חימם N2 לשטוף את החיץ העיכול, בעדינות pipet הפתרון מדגם מקסימום 5 פעמים בעזרת פיפטה P1000.
    הערה: Over-triturating עם צרטיפ pipet יכול להפחית כדאיויות תא הצמיחה הבאה.
  2. צנטריפוגה הצינור ב 145 XG במשך 5 דקות. לאחר השלכת supernatant, מחדש להשעות את התא גלולה ב 1 מ"ל של מדיום N2.
  3. הכן 1 מ"ל של מדיום N2 בצלחת 6-היטב שאינו מצופה ולהוסיף 1 מ"ל של תאים מושעה לעשות נפח סופי של 2 מ"ל.
  4. להוסיף EGF (20 ng / ml) ו bFGF (20 ng / ml) לתוך כל טוב. הנער בעדינות את מנת תרבות 6 היטב ביד לערבב את גורמי הגדילה הוסיפו עם התאים המצופים. שמור את צלחת 6-היטב באינקובטור 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  5. להוסיף EGF (20 ng / ml) ו bFGF (20 ng / ml) זה טוב כל יום במשך 8 ימים. כל יום שלישי, להוסיף 200 μl של התקשורת N2 כדי לשמור על נפח 2 מ"ל המשוער של המדיום.

4. Passaging של NSCs כמו Neurospheres וכדי תרבויות חד שכבתי

  1. אסוף את neurospheres ולהעבירם צינור חרוטי חדש 15 מ"ל.
    הערה: מספר neurospheres (> 50 מיקרומטר קוטר) PEr היטב מן SCz של מוח עכבר אחת היה 64.3 ± 7.31, אשר היה פחות מזה של SVZ (190.5 ± 6.33) 9.
  2. דגירה neurospheres עם 0.5 מ"ל של חיץ ניתוק למשך 5 דקות באמבט מים 37 ° C כדי לנתק את neurospheres לתוך תאים בודדים. ניתן ניתק neurospheres הראשי לתוך תאים בודדים ומתוחזק על קטעים מספר תרבויות neurosphere או בשכבה.
    הערה: הרחבת SCz-aNSCs כמו בשכבה עדיפה על neurospheres כי SCz-aNSCs ניתן passaged> 10 פעמים במתכונת תרבות בשכבה, אבל <5 פעמים במתכונת תרבות neurosphere.
    זהירות: SCz-aNSCs להפגין צבירה חזקה, וקשה לנתק אותם לתוך תאים בודדים. לכן, פורמט תרבות neurosphere אינו מומלץ הרחבת תא שיגרתית.
  3. בעדינות pipet הפתרון המדגם מעלה ומטה עם טפטפת P1000 פחות מ -5 פעמים צנטריפוגות את הצינור ב 145 XG במשך 5 דקות. בטל supernatant מחדש suלבלות את neurospheres עם 1 מ"ל של מדיום N2.
    הערה: מעל triturating עם קצה פיפטה צר יכול להפחית כדאיויות תא הצמיחה הבאה.
  4. כדי לספור את התאים, לעשות 1: תערובת 1 של השעית התא (10 μl) והפתרון הכחול 0.4% trypan, ולאחר מכן לספור את מספר תאי חיים על hematocytometer. לאחר ציפוי צלחת 6-היטב עם אש"ף / laminin, צלחת התאים ב 2.5 x 10 מ"ל 5 תאים / עם 2 מ"ל של מדיום N2 עבור כל טוב.
    הערה: שינויי צפיפות תאים יכולים להשפיע על המצב ופוטנציאל בידול שלהם.
  5. שמירה על SCz-aNSCs עם טיפול יומי של גורמי גדילה (2 מ"ל, 20 ng / ml) במשך 5 ימים, ואת אותם מעבר להם.

בידול 5. Subcallosal אזור שמקורם בתאי גזע בוגרים עצביים

  1. ANSCs פלייט על coverslip מ"מ 18 מצופה Laminin אש"ף / עם 1 x 10 מ"ל 5 תאים / מ"ל 1 N2 עם גורמי גדילה (20 ng / ml) עבור בידול של-aNSCs SCz.
  2. היום שאחרי,כשהתאים מחוברים היטב coverslip, להחליף את מדיום הגידול עם N2 להסיר את גורמי הגדילה.
  3. לאחר 6 ימים, לשטוף את התאים הבדיל עם 1 מ"ל של PBS להסיר פסולת התא ולתקן אותם עבור immunostaining.
    הערה: BrdU ניתן לשלב את ה- DNA החדש המסונתז של תאים מתרבים. לכן, אם רוצים, BrdU (10 מיקרוגרם / מ"ל) ניתן להוסיף לחיות התאים לפני קיבוע של תאים.

6. בתאי גזע Immunostaining למבוגרים עצביים בדיל אבות

  1. עבור immunostaining, לשטוף את התאים עם PBS ולתקן אותן עם PFA 4% למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
    זהירות: PFA היא רעילה ביותר; להימנע ממגע עם העור והעיניים.
  2. הסר את 4% PFA, לשטוף את התאים קבוע עם PBS 3 פעמים, ולאחר מכן לאחסן אותם ב 4 ° Cuntil הם נדרשים עבור immunostaining.
  3. דגירה התאים על coverslip עם פתרון חסימה (אלבומין בסרום שור 3% ו -0.1% Triton X-100 ב 1x PBS) למשך 30 דקות לפחות בטמפרטורת החדר.
  4. הכן את הנוגדנים העיקריים בפתרון חסימה טרי דגירת דגימות הלילה ב 4 מעלות צלזיוס.
    1. Immunostaining aNSCs
      1. הכתם aNSCs באמצעות אנטי Nestin ונוגדנים נגד BrdU. לפני קיבעון, להוסיף 20 מיקרוגרם של BrdU אל aNSCs דגירה אותם עבור 2 שעות. בצע את הצעד denaturing באמצעות 2 N HCl למשך 20 דקות ב 37 מעלות Cbefore שתבצע את הפעולה חוסם.
    2. Immunostaining אבות הבדיל:
      1. השתמש אנטי-O4, אנטי bIII טובולין, וחלבון חומצי fibrillary אנטי גליה (GFAP) נוגדנים לתייג את האבות המובחנים.
  5. שטפו את דגימות עם 3 פעמים PBS דגירה אותם עם נוגדנים משני מצומדות כדי צבעי ניאון (1: 500) בחסימת פתרון במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לשטוף את דגימות 3 פעמים עם PBS.
    הערה: נוגדנים משני השתמש התואמים את המארחים של בפריימריזנוגדנים. Hoechest33343 (1: 2,000) משמש מכתים גרעיני.
  6. הוסף פתרון גובר זכוכית שקופית והמשך עם הרכבה. שימו ותמונה המדגם על מיקרוסקופ confocal באורכי גל מרובים: FITC (488 ננומטר), Cy3 (543 ננומטר), Cy5 (647 ננומטר), ו Hoechest33343 (405 ננומטר).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הגדרת מערכת התרבות עבור aNSCs מאזור נוירוגנית ידוע חיונית להבנת התאים הללו לפיתוח פוטנציאל השימוש שלהם במוח תיקון 12. זה ידוע כי NSCs בשלבים התפתחותיים שונים או באזורים שונים מתנהגים בצורה שונה 3,4. לאחרונה, דווח כי נגזרות תאי SCz להפגין פוטנציאלי הפרש לבידול עצבי in vivo ו במבחנה לעומת תאי שמקורם SVZ 7-9. לכן, כדי לבודד כל אזור נוירוגנית בדיוק, פרוסות מוח הכוללות את SCz נותחו באמצעות מטריצת מוח 1 ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מאמר זה מתאר פרוטוקול מפורט ליצור NSCs מן SCz עכבר בוגר ולשמור אותם ליישומים שונים. ישנם שלושה שלבים קריטיים להקמת מערכת התרבות חוץ גופית צורך לטהר ולהרחיב SCz-NSCs. ראשית, חשוב להבטיח שאזור SCz הוא גזור החוצה בדיוק מאזורים נוירוגנית פוטנציאליים אחרים (איור 1 ב). חלקים עבים ומדויקים המכילים את אזורי SCz התקבלו עם מטריקס מוח 1 מ"מ מרווח, ולאחר מכן מחט דקה שמשה את דיסקציה מייקרו של SCz מאזורים קליפת מוח אחרים (איור 1 א). כאשר הלא-NSCs ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי התוכנית לחקר המוח באמצעות הקרן הלאומית למחקר (NRF), במימון משרד המדע, התקשוב והתכנון העתידי של קוריאה (מענקים NRF-2015M3C7A1028790); ועל ידי מענק מפרויקט המו"פ של טכנולוגיית הבריאות של קוריאה באמצעות המכון לפיתוח תעשיית הבריאות של קוריאה (KHIDI), במימון משרד הבריאות והרווחה. הרפובליקה של קוריאה (HI14C3347).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>רכיבים בינוניים
DMEM/F12 Gibco11320-033+L-glutamin, +נתרן ביקרבונט
עט/סטרפטוקוקוסInvitrogen15140-122
תוסף N2Gibco17502-048
תוסף B27Gibco17504-044
<חזק>גורם גדילה
bFGFR& D233-FB
EGFGibcoPHG0313
<חזק>חוצץ
PBS (10x)BIOSOLUTIONBP007a1x דילול
HBSSGibco14175-095
<מאגר דיסוציאציה חזק>
Dispase IIRoche04-942-078-001
PapainWorthington3126
AccutaseICTAT-104
<חזק>כלי
מלקחיים עדיניםWPI555229F
מספרייםStorzE3321-C
מטריצת מוח (1 מ"מ)RWD68707
סכין גילוח פיפיותDORCOST-300
30 גרם מחטSUNGSHIMN1300
<חזק>חומרים
15 מ"לSPL50015
צינורות 50 מ"לSPL50050
35 מ"מ צלחתSPL10035צלחת פטרי
100 מ"מ צלחתSPL10090צלחת פטרי
החלקת כיסוי (18 מ"מ)Deckglaser111580
צלחת 12 בארSPL32012ללא ציפוי
6 בארות צלחתSPL32006ללא ציפוי
<חומרי ציפוי חזקים>
PLOSigmaP49570.01%
למיניןג'יבקו23017-01510 מ"ג/מ"ל
<נוגדנים חזקים>נוגדנים ראשוניים 
עכבר נסטיןמיליפורMAB353(1:1,000)
ארנב EGFRAbcamab2430(1:1,000)
עז DCXסנטה קרוזSC8066(1:500)
ארנב Tuj1SigmaT2200(1:2,000)
חולדה GFAPInvitrogen13-0300(1:1,000)
O4עכבר MilliporeMAB345(1:500)
BrdUAbcamab6326עכברוש (1:500)
<נוגדנים משניים>חזקים
נגד עכבר 488InvitrogenA212021:500
נגד עכבר cy3ג'קסון715-165-151
נגד עכבר 647ג'קסון715-606-150
נגד ארנב 488AlexaA21206
נגד ארנב cy3ג'קסון711-165-152
נגד ארנב 647ג'קסון711-605-152
נגד עז 488AlexaA11055
נגד עז cy3ג'קסון705-165-147
נגד עז 647InvitrogenA21447
נגד חולדות 488InvitrogenA21208
נגד חולדות CY3ג'קסון712-166-150
נגד חולדות 647ג'קסון712-605-153
<חזק>חומרים צביעה חיסונית
BSAMillipore82-100-63% BSA עם 0.1% טריטון X-100 ב-PBS
Triton X-100USB22686
4% PFABiosesangP2031
Hoechest33342Life TechnologyH3570צבע לצביעה של גרעינים

מקורות

  1. Reynolds, B. A., Weiss, S. Clonal and population analyses demonstrate that an EGF-responsive mammalian embryonic CNS precursor is a stem cell. Developmental biology. 175, 1-3 (1996).
  2. Babu, H., Cheung, G., Kettenmann, H., Palmer, T. D., Kempermann, G. Enriched monolayer precursor cell cultures from micro-dissected adult mouse dentate gyrus yield functional granule cell-like neurons. PloS one. 2, e388(2007).
  3. Alvarez-Buylla, A., Garcia-Verdugo, J. M. Neurogenesis in adult subventricular zone. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 629-634 (2002).
  4. Kempermann, G., Song, H., Gage, F. H. Neurogenesis in the Adult Hippocampus. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 7, a018812(2015).
  5. Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287, 1433-1438 (2000).
  6. Seri, B., et al. Composition and organization of the SCZ: a large germinal layer containing neural stem cells in the adult mammalian brain. Cereb Cortex. 16 Suppl 1, i103-i111 (2006).
  7. Kim, W. R., et al. Evidence for the spontaneous production but massive programmed cell death of new neurons in the subcallosal zone of the postnatal mouse brain. The European journal of neuroscience. 33, 599-611 (2011).
  8. Kim, H. J., Kim, J. Y., Sun, W. Age-dependent changes in the subcallosal zone neurogenesis of mice. Neurochemistry international. 61, 879-884 (2012).
  9. Kim, J. Y., et al. Promotion of Cortical Neurogenesis from the Neural Stem Cells in the Adult Mouse Subcallosal Zone. Stem Cells. , (2015).
  10. Nunes, M. C., et al. Identification and isolation of multipotential neural progenitor cells from the subcortical white matter of the adult human brain. Nature medicine. 9, 439-447 (2003).
  11. Gould, E. How widespread is adult neurogenesis in mammals? Nature reviews. Neuroscience. 8, 481-488 (2007).
  12. Gage, F. H., Temple, S. Neural stem cells: generating and regenerating the brain. Neuron. 80, 588-601 (2013).
  13. Shaker, M. R., Kim, J. Y., Kim, H., Sun, W. Identification and characterization of secondary neural tube-derived embryonic neural stem cells in vitro. Stem cells and development. 24, 1171-1181 (2015).
  14. Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Molecular neurobiology. 34, 153-161 (2006).
  15. Suslov, O. N., Kukekov, V. G., Ignatova, T. N., Steindler, D. A. Neural stem cell heterogeneity demonstrated by molecular phenotyping of clonal neurospheres. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 14506-14511 (2002).
  16. Richards, L. J., Kilpatrick, T. J., Bartlett, P. F. De novo generation of neuronal cells from the adult mouse brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 8591-8595 (1992).
  17. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
  18. Gritti, A., et al. Epidermal and fibroblast growth factors behave as mitogenic regulators for a single multipotent stem cell-like population from the subventricular region of the adult mouse forebrain. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 19, 3287-3297 (1999).
  19. Wachs, F. P., et al. High efficacy of clonal growth and expansion of adult neural stem cells. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 83, 949-962 (2003).
  20. Xiong, F., et al. Optimal time for passaging neurospheres based on primary neural stem cell cultures. Cytotechnology. 63, 621-631 (2011).
  21. Lee, S. W., et al. Optimization of Matrigel-based culture for expansion of neural stem cells. Animal Cells and Systems. 19, 175-180 (2015).
  22. Guo, W., Patzlaff, N. E., Jobe, E. M., Zhao, X. Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse. Nature protocols. 7, 2005-2012 (2012).
  23. Walker, T. L., Kempermann, G. One mouse, two cultures: isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice. JoVE (Journal of Visualized Experiments). , e51225(2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

בידוד אזור תת-הקליבונאליתרבית נוירוספירותתרבית בשכבה אחתעיכול רקמהפרוליפרציה של תאיםבדיקת דיפרנציאציהטיפול בגורמי גדילהפרוצדורת צביעה אימונוהיסטוכימיתדיסקציה של המטריקס המוחי
בידוד והתרבות של תאי גזע בוגרים עצביים מאזור העכבר Subcallosal
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.