ריצת גלגל וסביבתי מורכב כמו התערבות טיפולית במודל חיה של FASD

סיכום

יש תרגיל לב וכלי דם וחוויות מגרה בסביבה מורכבת יתרונות חיוביים על אמצעים מרובים של פלסטיות עצבית במוח המכרסם. מאמר זה יעסוק ביישום של התערבויות אלה בתור "superintervention" המשלב ריצה גלגל ומורכבות סביבתיות יעסוק המגבלות של התערבויות אלה.

תקציר

התעמלות אירובית (למשל, פועל גלגל (WR) בשימוש נרחב במחקר בבעלי חיים) באופן חיובי משפיע אמצעים רבים של פוטנציאל neuroplastic במוח, כגון שיעורי neurogenesis למבוגרים, אנגיוגנזה, וביטוי של גורמים neurotrophic במכרסמים. התערבות זו גם הוכח כדי להקטין היבטים התנהגותיים neuroanatomical של ההשפעות השליליות של teratogens (כלומר, חשיפה התפתחותי לאלכוהול) ו ניוון מוחיים הקשורים בגיל במכרסמים. מורכבות סביבה (EC) הוכחו לייצר הטבות neuroplastic רבות במבנים הקורטיקלית קורטיקליים וניתנות בשילוב עם ריצה גלגל להגדיל את ההתפשטות והישרדות של תאים חדשים בהיפוקמפוס המבוגר. השילוב של שתי ההתערבויות הללו מספק חזק "superintervention" (WR-EC) כי ניתן ליישם במגוון במודלים של מכרסמים של הפרעות נוירולוגיות. אנו נדון יישום WR / EC ו המהוות אותהterventions לשימוש התערבות טיפולית חזקה יותר בחולדות באמצעות במודל חיה של חשיפה טרום לידתית אלכוהול אצל בני אדם. כמו כן נדונו בו אלמנטים של הנהלים הם הכרחיים עבור ההתערבויות ואלו עשויים להשתנות בהתאם לשאלה או המתקנים של הנסיין.

מבוא

גידול בסביבות שונות כבר זמן רב ידוע כדי לגרום לשינויים במדדים שונים של בריאות נוירולוגיות. מחקרים רבים בודקים את ההשפעות המיטיבות של גידול בסביבה מורכבת (EC) החל מחקר פורץ דרך על ידי דיאמונד רוזנצוויג (למשל, ^{1, 2)} ו Greenough (למשל, ^{3, 4).} EC הוכח יש השפעות חיוביות להכחיש על שינויים סינפטיים וסלולר במוח ^{5, 6, 7.} EC יכול להשפיע על ריבוי אזור המוח כולל ההיפוקמפוס ^{8, 9} ו בקליפת המוח הראייתית ^{10, 11,} הסטריאטום גחון ^{12, 13,} כמו גםכפונקציה neuroimmune המוח-רחב (הנסקרת ב ^14). עניין רב במיוחד פתח ממחקרי על ההיפוקמפוס כשזה הודגם כי EC יכול להגדיל את שיעור ההישרדות של תאי גרגיר נולד-מבוגר של gyrus המשוננת באמצעות פלסטיות דנדריטים ^{9, 13.} הנקודה האחרונה אסף עניין רב בשל הגוף הולך וגדל של ספרות המציין כי פעילות אירובית מקדמת neurogenesis למבוגרים הם במוח הבריא הפגום ^{15, 16, 17, 18.} ריצת עגלה (WR) היא קל ליישם בצורה של פעילות לב וכלי דם מהרצון כי הוכח להועיל במודלים של מכרסמים של הפרעות נוירולוגיות או הזדקנות ^{17, 19, 20.} WR משפיע על הביטוי של גורמי גדילה הן במערכת העצבים המרכזית וההיקפית ^{21, 22, 23.}

שילוב (לימים) WR ו- EC לתוך "superintervention" (WR-EC) (כלומר, 12 ימים של WR ואחריו 30 ימים EC) מספקים עלייה חזקה neurogenesis למבוגרים בהיפוקמפוס הישרדות המוגבר של התאים התרבו לאחרונה ^8, אפקט כי במודל חיה של FASD אינה מושגת על ידי רכיבים בודדים (ראה להלן). מאז הן רכיבים של WR-EC להשפיע על מגוון רחב של מבנים בתוך המוח ¹³ (WR הנסקרת ב ^22, EC הנסקרת ב ^24), יישום התערבות זו ניתן ליישם בקלות במודלים של מכרסמים של שני הדגמים הופעת החיים התפתחותיים מאוחרים יותר של נוירולוגיות ירידת ערך (למשל, חשיפת אלכוהול בילוד, הזדקנות, מתח בתחילת חיים).

NT "> שילוב של WR-EC בתקופות המבוגרות מתבגר מוקדם (כלומר, ימים לאחר לידה 30 - 72) יכולים לשפר כמה מן ההשפעות השליליות של מודל עכברוש של פרעות ספקטרום אלכוהול עובריות (FASDs) ⁸ אוסף של מחקרים. מכרסמים הפגינו שחשף לאלכוהול מיום הלידה (PD) 4 עד 9 התצוגה גירעונות משמעותיים צעדים neuroanatomical כגון מורכבות הדנדריטים ^25, פיתוח המוח הקטן ^{26, 27} והיענות neuroimmune ²⁸ כמו גם גילויי למידה לקוי וזיכרון ^{29, 30, 31} . אפילו כמות מופחתת של חשיפת אלכוהול בתוך חלון זמן זה (כלומר, פ"ד 7 עד 9) יכולה להוביל גירעונות למידה וזיכרון בחולדות מתבגרות ומבוגר ³² בעוד כמה מבנים כבר לא רואים sigליקוי neuroanatomical תופעה משמעותי, ^27. רבי גירעונות אלה - בנוסף ליקויי התנהגותי במשימות ההיפוקמפוס תלויה - כבר מתנו בעקבות חשיפה הפרדיגמה WR-EC זה ^{8, 33} או WR לבד ^{25, 31.} למרות WR לבד כבר התערבות בשימוש נרחב, השילוב של WR-EC טרם נוצל בספרות למרות יכולתה לקיים את היתרונות יחסית לטווח קצר של WR ^8. מאמר זה יעסוק ביישום של התערבות WR-EC בגיל ההתבגרות. למרות פרדיגמה זו משמשת בהקשר של חשיפה אלכוהול לאחר הלידה המוקדמת, זה יכול להיות מוצג בפני במודלים של מכרסמים שונים כדי להעריך את הפוטנציאל של המוח עבור פלסטיות עצבית במודלים של הפרעות במוח.

פרוטוקול

משפט ואתיקה: הפרוטוקול הבא אושר על ידי הטיפול בבעלי החיים המוסדיים ועדת השימוש (IACUC) מאונ' דלאוור.

1. חשיפה התפתחותית (או דגם של חשיפת אתנול Binge דמוית)

1. ביום PD3, לקבוע את מינו של כל חיה ו צולב לטפח כל חיות במידת צורך כדי לשמור על גודל המלטה (8 חיות) והפצת מין (4 זכרים: 4 נקבות) עולה בקנה אחד בתוך כל המלטה.
   הערה: חשוב לשמור על גודל המלטה והפצת מין עקבי ככל האפשר, כדי למנוע בלבול הניסיון. למרות בפרוטוקול זה משתמש 8 גורים (4 זכרים ו -4 נקבות) בכל המלטה, בגדלי המלטה אלטרנטיביים או הפצות מין עשויים להיות תפורות לצרכי תכנון הניסוי.
2. תת עורי להזריק כמות קטנה של בדיו שחור לידיו לזהות חיות בתוך כל המלטה.
3. פסיאודו אקראי להקצות המלטות כניסוי (המכיל 50% אלכוהול חשוף (AE) ו -50% שליטה מחובר לצינורות-דמה (SI) הגורים) או לינוק מלא (SC) (בעלי חיים שאינם עוברים כל אינטובציה, גזיר זנב, או פרוטוקולי פרידת PD 4 - 9 למעט במשקל יומי חבטות אוזן).
   1. כדי לשמור על גודל קבוצה עקבי, להקצות כפליים המלטות ניסוי כפי המלטות SC.
4. לשקול כל חיה ואז להחזיר אותו בכלוב בבית שלה. בעלי חיים במשקל אמור להתרחש מדי יום במהלך תקופת אינטובציה (PD 4 - 9).
   1. הסר את האפריון כולו מן הסכר.
   2. מניח גורים על משטח לוהט.
   3. רשום את המשקל של כל גור פרט.
5. ביום PD4, לאחר שקילת כל חיה לחשב את כמות אלכוהול הכרחי עבור סכום כולל של 5.25 גר '/ ק"ג / ליום כל חיה (מבוסס על משקל הגור משלב 1.4) ^8.
   1. נהל אלכוהול 11.9% אתנול-ב-חלב תחליף (כרך / כרך).
6. החל בשעה 9 בבוקר, להסיר גורים של המלטה אחד מהאם בכל פעם.
7. לנהל את אתנול-ב-חלב לכל גור AE 34.
8. Sham-לצנרר כל גור ⁸ SI.
9. חזור על שלבים 1.5. דרך 1.8. עבור כל המלטה ניסיונית.
10. שעות לאחר המנה הראשונה, לחזור על תהליך המינון (שלבי 1.5 דרך 1.8) עבור מנת אלכוהול שנייה.
11. אחת וחצי שעות לאחר מנת האלכוהול השנייה (הנקודה שבה שיא תוכן אלכוהול בדם יומי מושגת), לאסוף ודם צנטריפוגות מן גורי AE ו SI באמצעות זנב גזיר לניתוח תוכן אלכוהול בדם בעתיד ^35.
    1. אסוף 60 μL של דם.
    2. מניחים דם בתוך שפופרת microcentrifuge 1 מ"ל. דם צנטריפוגה ב 1.5 XG במשך 25 דקות.
    3. בזהירות לאסוף את בסרום supernatant מהצינור צנטריפוגות ולשמור לניתוח תוכן אלכוהול בדם בעתיד.
12. חזור על תהליך המינון (שלבי 1.5 דרך 1.8) באמצעות חלב במקום אתנול-ב-חלב כדי למנוע גירעונות תזונתיים מחוסר יכולת סיעוד ב AEגורים.
    1. בצע סך של 2 מנות חלב משלימות 2 שעות זה מזה על PD 4.
13. חזור על שלבים 1.4 דרך 1.12 (למעט צעד 1.11) על PD 5 - 9.
14. בעקבות מינון חלב המשלימה הסופי על PD9, אוזן אגרוף כל הגורים לזיהוי בכלוב EC.
    1. לתאם אגרוף באוזן עם מידה מסוימת של מספר המלטה או מזהה (למשל, המלטות אי-זוגיות בתוך עוקבה תקבלנה האוזן השמאלית שלהם אגרוף בעוד חי המלטות זוגיות תקבלנה אוזני זכותם אגרוף). זה יעשה את זה קל יותר לזהות חיות בכלוב EC צריכים בעלים חיים רבים מן ההמלטות שונות יש אותו דפוס pawmark.

גמילה 2.

1. ביום PD 23, בבית כל החיות בכלובים של 2 - 3.
   1. ודא שכל החיות שוכנו באותו הכלוב הן מאותו המין.
   2. כלול SC אחד, אחד SI, ובעלי חיים אחד AE לכל כלוב במידת האפשר.
   3. צמצם את מספר כלוב mates הבבית הם מאותו ההמלטה.
   4. ודא שכל החיות שמסוגלות לגשת מזון ומים.

ריצת גלגל 3.

1. ביום PD30, להקצות מחצית כלובים עם חיות כדי WR. בית החיות האלה בכלובים עם גישה חופשית גלגל ריצה נירוסטה המצורפת.
   1. ודא שיש גלגלים מונה להעריך את המספר הכולל של מהפכות.
2. לשקול את כל החיות על PD 30 ו PD 36.
3. בדוק את מספר המהפכות של כל גלגל בשעה 9 בבוקר כל יום.
4. השאר חיות במצב הדיור שלהם במשך 12 ימים.

4. מורכבות הסביבה

1. מכינים את הכלוב EC לפני 9 בבוקר ביום שמתאים PD 42 עבור בחיות מעבדה.
   1. קבל 30 "x 18" x 36 "כלוב פלדה מגולוון.
      הערה: צריך הכלוב מספר רמות, להיות מסוגל לתמוך את המשקל של חולדות מרובות, להתמלא תקןיש מצעים, ומיקומים מרובים לצרף בקבוקי מים ומגשי האוכל.
   2. מניח רומן, אובייקטים צבעוניים בגדלים משתנים וצורות בכלוב.
      1. מניחים 6 צעצועים גדולים בכלוב EC. ודא כי כל צעצוע הוא מספיק גדול בשביל 3 או יותר חולדות כדי אינטראקציה עם בעת ובעונה אחת.
      2. מניח 6 צעצועים בינוניים בכלוב EC. ודא כי כל צעצוע הוא מספיק גדול בשביל 3 - 4 חולדות כדי אינטראקציה עם בעת ובעונה אחת.
      3. מניחים הרבה (לפחות 20) של צעצועים קטנים בכלוב EC.
      4. משתמש באביזרים של צבעים שונים, צורות, גודל, וכו 'החידושים הם קריטיים להתערבות זו (ראה דיון).
   3. מניחים שתי מנות של מזון בקצוות מנוגדים של הכלוב.
   4. מניחים שני בקבוקי מים בקצוות מנוגדים של הכלוב.
2. בשעה 9 בבוקר על PD 42, לשקול את כל החיות להעביר את החיות WR לכלוב EC. כל כלוב EC אמור להכיל 9 - 12 בעלי חיים.
   1. יש לוודא שאין חיות לשניהם באותו pawmark ואוזן-משחק מליםדפוסי ch.
3. בדקו את כל ימי המזון ומים.
4. כל יומיים, להסיר את הצעצועים מהכלוב EC ולהחליף אותם (על פי השלב 4.1.2.).
5. כל שלושה ימים, לנקות את הכלוב EC.
   1. הסר את החיות מן כלוב EC ולשים אותם בכלובים שהייה זמניים של 2 - 3 חיות.
   2. הסר את כל המצעים מן בתחתית הכלוב.
   3. חזור אותם הצעצועים לכלוב אלא עצם היום הזה עולה בקנה אחד עם לוח זמני החלפת צעצוע (לפי צעד 4.4.).
   4. החלף את כל האוכל והמים.
   5. חלף החולדות לתוך כלוב EC.

רקמות 5. אסוף

הערה: אוסף רקמות (למשל, זלוף עם paraformaldehyde) ואחסון (למשל, מקפיא, הטבעת פרפין) יכולה להתבצע עם מגוון רחב של שיטות. להלן יסביר את התהליך של זלוף עם paraformaldehyde 4% ב 0.1 M פוספט בופר (4% paraformaldehyde ב PBSפתרון) ^8.

זהירות: Paraformaldehyde הוא מסרטן ועלול גם לגרום לגירוי עור, תגובה אלרגית בעור, או פגיעה בעין. השתמש הגנת עיניים / עור מתאים.

1. לחשוף חולדה אחת בכל פעם כדי isoflurane כדי להרדים את החיה קלה.
2. Intraperitoneally להזריק עכברוש עם 2 מ"ל / ק"ג של תערובת קטמין / xylazine (1.5 מ"ל xylazine מעורבב עם 10 מ"ל של קטמין).
   הערה: קטמין ו xylazine הן בריכוזים מלאי של 100 מ"ג / מ"ל ​​לפני שילוב עבור תערובת ההזרקה.
3. לאחר עכברוש הוא כבר לא מגיבים, perfuse החיה עם 0.1 M פוספט בופר (PBS; pH = 7.2) ואחריו paraformaldehyde 4% ב PBS (pH = 7.2).
4. סר מוח ולאחסן paraformaldehyde 4% PBS ב 4 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.
5. אחרי 2 ימים, העברת הפתרון של סוכרוז 30% נוספים paraformaldehyde 4% PBS ב 4 ° C.

תוצאות

על מנת להעריך את השפעת ההתערבות סופר, אנחנו חייבים להסתכל על ההשפעות של כל אחד מבני היסוד שלה - WR ו- EC - על אמצעים שלנו של עניין. דמויות 1 עד 3 (להלן) הופיעה בפרסום קודם ניצול הפרדיגמה ⁸ זה. איור 4 הופיע עבודת דוקטור ^36. נתונים אלה ממחישים את ההשפעה של WR-EC על neurogenesis למבוגרים בהיפוקמפוס gyrus המשוננת. כל הגרפים להמחיש אמצעי קבוצה, עם ברי שגיא...

דיון

בפרוטוקול לעיל, הראינו התערבות רצויה להציל גירעונות neuroanatomical בעקבות חשיפת אלכוהול בילוד. התערבות זו יכולה לשמש טיפולי במודלים של בעלי חיים אחרים בשל חוסנו של כל אחד ממרכיבי ההתערבות. פעילות לב וכלי דם מרצון בצורה של WR הוכחה להועיל כמה תוצאות התנהגותיות ^{38, 39} ו להשרות שינויי פלסטיק מעשיים באזורים במוח כגון ההיפוקמפוס (הנסקרת ב ^40). מדובר בין השאר בשל הביטוי של גורמי גדילה ומנגנונים נוירו אחר...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
נקבה בהריון ארוך אוונס חולדות	Envigo (לשעבר: Harlan, Inc.)		גודל המלטה הממוצע הוא 8 - 10 גורים
Black India Ink	Higgins (Chartpak, Inc.)	44201
מזרקים ומחטי הזרקה	בקטון, דיקינסון ושות' (BD)	מגוון	להזרקת דיו לסימון כפות, מתן תמיסת חלב-אלכוהול
Ear Punch	Kent Scientific Corporation	INS750076
Running Wheels	Wahmann Labs		Wahmann Running Wheel הופסק. אחד לכל כלוב.
EC כלוב	מרטין בע"מ	R-695
צעצועי EC קטנים	מגוון
צעצועי EC בינוניים	מגוונים		צריכים להיות מסוגלים להתאים 1 - 2 חולדות בתוך / על גבי חפץ
צעצועי EC גדולים	מגוונים		צריך להיות מסוגל להתאים 3 חולדות או יותר בתוך / על גבי החפץ