הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

זיהוי אמין של חיים דופאמין נוירונים תרבויות המוח התיכון באמצעות רצף RNA ו- TH-מונחה האמרגן ביטוי eGFP

9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54981

⸱

10 בפברואר 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Biology and Biological Engineering, California Institute of Technology (Caltech)

במאמר זה

סיכום

במחלת פרקינסון (PD), חומר שחור (SNC) נוירונים דופאמינרגיים להתנוון, שמובילים מוטורי. כאן אנו מדווחים פרוטוקול נוירונים culturing מוח תיכון גחון של עכבר להביע eGFP מונע על ידי hydroxylase טירוזין (TH) רצף אמרגן, קצירת נוירונים ניאון פרט מן התרבויות, ומדידת transcriptome שלהם באמצעות-seq RNA.

תקציר

במחלת פרקינסון (PD) יש איבוד עצבי נפוץ בכל רחבי המוח עם ניוון בולט של נוירונים דופאמינרגיים ב SNC, שמוביל bradykinesia, קשיחות, ורעד. זיהוי של נוירונים דופאמינרגיים המתגוררים mesencephalic הגחון עיקרי (VM) תרבויות באמצעות סמן פלואורסצנטי מספק דרך חלופית לחקור את הפגיעות סלקטיבי של נוירונים אלה ללא הסתמכות על immunostaining של תאים קבועים. כאן, אנו לבודדים, לנתק, ועכבר תרבות נוירונים VM למשך 3 שבועות. לאחר מכן, אנו לזהות נוירונים דופאמינרגיים בתרבויות באמצעות קרינת eGFP (מונעת על ידי אמרגן טירוזין hydroxylase (TH)). נוירונים בודדים נקצרים לתוך צינורות microcentrifuge באמצעות micropipettes זכוכית. בשלב הבא, אנחנו lyse התאים שנקטפו, ולערוך סינתזה cDNA ו בתיווך transposon "tagmentation" לייצר ספריות RNA-seq תא בודד 1, 2,התחת = "Xref"> 3, 4, 5. אחרי שעברה המחאה בקרת איכות, ספריות תא בודד הם רצף וניתוח שלאחר מכן מתבצעת כדי למדוד ביטוי גנים. אנו מדווחים על תוצאות transcriptome עבור דופאמין הפרט נוירונים GABAergic מבודד מתרבויות המוח התיכון. אנו מדווחים כי 100% של תאי TH-eGFP החיים שנמסקו להפיק ולרצף היו נוירונים דופאמינרגיים. טכניקות אלו יהיו יישומים נפוצים במדעי המוח וביולוגיה מולקולרית.

מבוא

מחלת פרקינסון (PD) היא הפרעת ניווניות חשוכות מרפא, כתוצאה מהזדקנות. סיבת הפרעה שכיחה יחסית זה נשאר הבינה היטב. יש איבוד עצבי נפוצה בכל רחבי המוח, עם ניוון עצבי מובהק של נוירונים דופאמינרגיים ב nigra substantia (SNC), מה שמוביל מאפיינים קליניים אבחון של bradykinesia, קשיחות ורעד.

תרבויות מעורבות ראשיות המכילות נוירונים דופאמינרגיים SNC שרלוונטיות ספציפי לטיפול במחלת הפרקינסון. פינת הגחון tegmental (VTA) נוירונים דופאמינרגיים היו מעורבים גמול והתמכרות. הגחון mesencephalic (VM) עיקרי תרבויות עובריות מעורבות מכילות הוא SNC ו דופאמין VTA (DA) נוירונים נוירונים GABAergic. תרבויות העיקריות VM יכולות להיות שימושיות עבור מבחני neuroprotection וכדי להבהיר את הפגיעות סלקטיבי של נוירונים דופאמינרגיים. אין דרך אמינה לזהות תאים דופאמינרגיים בתרבות המבוסס על מורפולוגיה. הואמחדש אנו מפתחים טכניקות לזהות ולאסוף נוירונים דופאמינרגיים יחידים, ולבנות ספריות רצף RNA חד-תאית, תשואה גבוהה.

אנו מדווחים נתוני transcriptome RNA נציג דופאמין יחיד נוירונים GABAergic מבודדים מתרבויות מוח תיכונות. פרוטוקול זה יכול לשמש neuroprotection, ניוון מוחיה, מבחנים תרופתיים כדי לחקור את ההשפעות של טיפולים שונים על transcriptome DA / GABA. בגלל נוירונים דופאמינרגיים מייצגים מיעוט קטן של נוירונים הביע בתרבויות VM עיקריות, את היכולת לזהות נוירונים באופן מהימן אלה בתרבויות חיים תאפשר מגוון משופר של מחקרי תא בודד. טכניקות רומן אלה תקלנה התקדמות בהבנת המנגנונים המתרחשים ברמת התא ייתכן יישומים במקום אחר בתחומי הנוירולוגיה ביולוגיה מולקולרית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: כל הניסויים נערכו בהתאם להנחיות לטיפול ולשימוש בחיות הניתנים על ידי מכוני הבריאות הלאומיים, ופרוטוקולים אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש בבית המכון הטכנולוגי של קליפורניה.

1. גזירת תא תרבויות דופאמין הראשי ממוח העכבר העוברי

  1. פתרונות והתרבות בינוני
    1. הכנת חומצה אסקורבית Stock פתרון
      1. תשקול 352 מ"ג של חומצה אסקורבית. הוסף סטרילי H 2 O ל בהיקף כולל סופי של 20 מ"ל. מקום באמבט מים 37 ° C לפזר. סינון דרך קצה המזרק 0.2 מיקרומטר ולאחסן ב 500 aliquots μL ב -20 ° C.
    2. הכנת פתרון במלאי Papain
      1. לדלל פפאין עד 15 יחידות / מ"ל ​​תמיסת מלח 1x Hanks' מאוזן (HBSS). פיפטה למעלה ולמטה 5 פעמים כדי לערבב ביסודיות. כן ביום לנתיחה.
    3. הכנת DNase Stock פתרון
      1. תשקול 20 מ"ג DNase. הוסף סטרילי H 2 O ל בהיקף כולל סופי של 20 מ"ל. סינון סטרילי עם קצה מסנן מזרק 0.2 מיקרומטר. חנות ב -20 מעלות צלזיוס aliquots 1 מ"ל.
    4. הכנת פתרון עצור
      1. לדלל 5 התורם מ"ל סוס סרום לסוס 10% ב 45 מ"ל 1x HBSS. סינון סטרילי עם קצה מסנן מזרק 0.2 מיקרומטר. חנות ב 4 מעלות צלזיוס.
    5. הכנת 4% שור סרום אלבומין (BSA) פתרון המניות
      1. תשקול 2 גרם של BSA ולהוסיף 1x פוספט שנאגר מלוח (PBS) כדי בהיקף כולל סופי של 45 מיליליטר. סנן לעקר עם קצה מסנן מזרק 0.2 מיקרומטר. חנות ב 4 מעלות צלזיוס.
    6. הכנת ציפוי בינוני
      1. לתוך 494 מ"ל בינוני, להוסיף התקשורת והתרבות 1.25 מ"ל המכיל L-alanyl-L- גלוטמין (מקור התייצב של גלוטמין L) ו -5 מ"ל של סרום התורם סוסים. סנן לעקר עם fil מזרק 0.2 מיקרומטרטיפ ter. חנות ב 4 מעלות צלזיוס.
    7. הכנת תרבית תאים בינונית
      1. לתוך 196 מ"ל בינוני ציפוי, להוסיף 4 מ"ל B27 ו -200 חומצה אסקורבית μL. סנן לעקר עם 0.2 מיקרומטר סינון. אחסן את הפתרון על 4 מעלות צלזיוס ולהשתמש תוך שבוע.
    8. הכנת 4% Paraformaldehyde (PFA) פתרון
      זהירות: אמצעי זהירות כלליים לשימוש paraformaldehyde הן כדלקמן: השתמש במנדף, להימנע ממגע עור ועיניים, להימנע משאיפת אדי, להתרחק מהאש או להבות חשופות. ללבוש ביגוד מגן אישי מתאים. PFA יכול לגרום לרגישות דרמטיטיס, ולכן לשטוף ידיים ביסודיות לאחר הטיפול.
      1. הוסף 10 מ"ל של 16% PFA 30 מ"ל של PBS 1x, pH 7.4.
    9. הכנת 0.1% Triton X-100
      1. פיפטה 1 מ"ל טריטון X-100 ל -9 מ"ל 1x PBS לעשות פתרון 10%. פיפטה לאט כדי לאפשר פתרון צמיג למלא קצה פיפטה. חם באמבט מים 37 ° C דיסלִפְתוֹר. לאחסן מלאי 10% ב 4 ° C.
      2. מדולל 10% מניות ל -0.01% (למשל, על ידי ביצוע 2 דילולים 1:10 סדרתי: לדלל 1 מ"ל של 10% פתרון ל -9 מ"ל 1x PBS לעשות 1 פתרון%; 1 מ"ל של תמיסת 1% ל -9 PBS מ"ל 1x לעשות 0.1% פתרון).
    10. חמור בדם הכנת 10% ו -1%
      1. הוסף 1 מ"ל של החמור בסרום עד 9 מ"ל של PBS 1x לפתרון 10%. הוסף 0.5 מ"ל של החמור בסרום 49.5 מ"ל של PBS 1x, pH 7.4 פתרון 1%.
    11. הכנת 1x PBS
      1. לדלל 10x PBS ל X 1 על ידי הוספת 50 מ"ל לתוך 450 מ"ל של H 2 O. התאם את ה- pH של התמיסה עד 7.4 pH באמצעות מד pH.
  2. ציפוי צלחות התרבות
    1. ציפוי פולי-L-ornithine
      1. מעיל רק בתחתית כוס בקוטר 10 מ"מ במרכז כל 35 מנות מ"מ עם 120 μL פולי- L-ornithine באמצעות טכניקה סטרילית. דגירה של 1 ש 'על 37 מעלות צלזיוס. השתמש aspirator ואקום כדי לשאוב את פולי-Lornithine. יש לשטוף את הכלים פעמיים עם סטרילי H 2 O.
    2. Laminin ציפוי (ריכוז המניות של 1 מ"ג / מ"ל)
      1. לדלל laminin 20 μL עם 2 מ"ל של H 2 O סטרילי (מ"ג 0.01 ריכוז סופי / מ"ל).
      2. מעיל רק בתחתית כוס בקוטר 10 מ"מ במרכז כל הכלים עם 120 μL של laminin מדולל ל 0.01 מ"ג / מ"ל ​​באמצעות טכניקה סטרילית, דגירה של 1 ש 'או O / N ב 37 מעלות לפני השימוש.
  3. עכבר Dissection
    הערה: השיטות לנתיחה זה מיועדות חשיפה מינימאלית של תאים, כפי שהם מועברים צקים עובריים אל האינקובטור לתרבות. הכדאיות של התאים נשמר על ידי הסרת רק חלק של המוח לנתיחה של המוח התיכון. בידוד מהתמורה המוח התיכון מהר יותר ללא צורך לנתח את המוח כולו לגשת לאזור. ראה טבלה של חומרים עבור זן העכבר השתמשו במחקר זה.
    1. להרדים עכבר בהריון בעיתוי ביום הריונית 14 באמצעות CO 2.
    2. תרסיס הבטן של העכבר מורדם עם 70% אתנול. אחוז העור של הבטן התחתונה באמצעות מלקחיים עם 2 x 3 שיניים ולפתוח את חלל הבטן באמצעות מספרי כירורגיות להב קהה. בשני חתכים נעים רוחבי proximally בכל צד. מקפלים מעל את דופן הבטן באמצעות מלקחיים כדי לחשוף את חלל הבטן.
      הערה: הרחם חשוף חברה. חשיפת חלל פלאורלי ויצירת pneumothorax גם מבטיח כי בעל החיים אינו משחזר.
    3. חותכים את שני הקצוות של קרן הרחם להפריד הרחם. מניחים לתוך צלחת פטרי במנדף סטרילית.
    4. בעזרת מלקחיים ישר-קצה בכל יד לפתוח את שק העובר ולהסיר את העובר. במהירות לערוף ידי צובט הראש בצוואר עם מלקחיים. לייצב את הראש עם המלקחיים ממוקמים היטב על החרטום כך את פני השטח הגבה נגיש.
    5. באמצעות המלקחיים שנערכו חה האחריםnd, לצבוט את שכבת העור ואת הגולגולת, ממש לפני הרכס של mesencephalon. לקלף את העור ואת הגולגולת caudally לאורך קו האמצע. מניח מלקחיים סביב הרכס עם קצה אחד בין הקליפה mesencephalon והשנייה על המוח הקטן.
    6. קמצוץ ולהסיר את המוח התיכון כולו, משאיר מאחור את המוח הקדמי בצד המוח הקטן המקוריים בצד הזנב. מניחים בצלחת פטרי עם HBSS קר תחת מיקרוסקופ לנתח.
    7. חזור על התהליך עבור העוברים הנותרים.
    8. תחת המיקרוסקופ לנתח, להתהפך במגזר המוח כך שהצד הגחון נגיש כעת. כיום יש 4 רביעים גלויים. הסר את כל של קרומי המוח ואת כלי הדם על ידי לתפוס את קרומי המוח בעדינות ומושך כלפי מעלה מן המוח.
    9. שימוש במלקחיים כדי לייצב את מגזר המוח תוך הפרדה בין המוח התיכון. מניחים טונג אחד מלקחיים לתוך החדר כ במרכז של המגזר. הפוך את dorsally קמצוץ ראשון הצבעה in כדי בצלחת, ואז מדיאלית בכל צד. קח את הרביעים שני התחתונים על ידי ביצוע חתכים לרוחב משני הצדדים.
      הערה: הרקמה של עניין היא בקטע הגחון הנח, המופיע צפוף. אזור זה מכיל הן את VTA ואת SNC.
    10. חתוך וזורקי הרקמה היא פחות צפופה: זה כולל את colliculi העליון ונחות. הנח את רקמת גזור המכילה הוא את VTA ו SNC ב HBSS הטרי על אזור נפרד של צלחת פטרי.
      הערה: בשלב זה של התפתחות מוח עכבר (E14), האזור של עניין במוח תיכון הגחון מופרד ע"י חדר מן zona incerta וקבוצות תא ההיפותלמוס אחרים. המבנה המוארך יותר של מוח עכבר העוברי בפיתוח מאפשר הבחנה בין האזורים אלה, אשר ממוקמים קרובים יותר יחד במוח העכבר הבוגר.
    11. חזור על הפעולה עבור כל מקטעי המוח הנותרים.
    12. אחרי הכל מגזרי המוח כבר גזורים, השתמש מלקחי אזמל 11 מס לרבעון eaסעיף המוח התיכון ch לחתיכות בגודל שווה בערך.
  4. Dissociating התאים
    1. טיפול תאי אנזימתי
      1. השתמש קצה פיפטה P1000 רחב נשא כך שיתפוס את כל המגזרים המוח התיכון לרבעים ב HBSS ולהכניס אותם לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל. בואו המגזרים ליישב לתחתית של התחתית ולהסיר HBSS כי נלקח למעלה עם חתיכות לרבעים.
      2. הוספת 500 μL של פתרון פפאין אל צינור מקום לתוך אמבט מים 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. תאי Resuspend ידי אצבע מצליפים את הצינורית אחרי 7.5 דקות.
      3. בעזרת קצה P1000 רחב נשא, פיפטה המגזרים המוח התיכון רק לתוך aliquot 1 מ"ל של לי deoxyribonuclease (DNase) פתרון. אפשר המגזרים ליישב לתחתית של התחתית.
      4. בעזרת קצה P1000 רחב נשא, להעביר רק במגזרי המוח התיכונים לצינור 15 מיליליטר המכיל 1 מיליליטר של תמיסה להפסיק קרה לשטוף. בואו המגזרים ליישב לתחתית של התחתית וחזור על השטיפה עלce יותר.
    2. טחינה דקה מכאנית של תרחיף תא
      1. החזר את השטיפה האחרונה עם 1 מ"ל של תמיסת להפסיק טריים פיפטה למעלה ולמטה 7x עם קצה פיפטה P1000 כדי triturate תאים. הימנע טחינה דקה מוגזמת כדי למזער תמוגה תא.
      2. בבסיס ההשעיה על ידי תא pipetting לאט 200 μL של פתרון BSA 4% לתוך החלק התחתון של הצינור. בזהירות למשוך את קצה פיפטה כדי למנוע שיבוש שכבת השעית תא. לאחר צנטריפוגה ב 280 XG במשך 6 דקות, לשאוב supernatant עם P1000 ו resuspend התאים 1 מ"ל של ציפוי בינוני.
  5. ספירת ציפוי התא
    1. בצעו ספירת תאים באמצעות hemocytometer. לדלל את ההשעיה תא 1,000 תאים / μL, עם ציפוי בינוני.
    2. שימוש aspirator ואקום, לשאוב את laminin מן המנות המצופות, בקבוצות של לכל היותר שלוש מנות. פלייט 120 μL (1.2 x 10 5 תאים / תבשיל (78.5 מ"מ 2 )) של השעית התא על המשטח המצופה של המנות מייד לאחר aspirating כל אצווה. הדבר מונע את הכלים מהתייבשות ויוצרים משטח אחיד.
    3. לאחר h 1, בזהירות להוסיף 3 מ"ל של מדיום תרבות שטח unseeded של המנה תרבות כדי למזער הפרעה של תאים.
    4. בצע וחצי עד שינוי בינוני מלא על תרבות מנות תא 3 במרווחי ד למשך 3 שבועות.

2. נוירונים קציר בתרבית-דופאמין עבור רצף RNA

הערה: סקירה של תא-קציר פרוטוקול RNA-רצף תא בודד ניתנת באיור 1.

  1. צעדים לביצוע לפני היום של הניסוי
    1. צינורות בורוסיליקט זכוכית נימים נקיים ידי sonicating באתנול 100% במשך 15 דקות ולאחר מכן שוב ב H המזוקק 2 O במשך 15 דקות. מסנן את הצינורות ואופים במשך הלילה בתנור על 200 מעלות צלזיוס כדי להשבית RNase.
    2. השתמש טרי נפתחRNase ללא טיפים פיפטה כדי להכין פתרון מלאי של חיץ התגובה 10x על ידי ערבוב 19 μL של חיץ תמוגה 10x מתוך הערכה רצף עם 1 μL של פתרון RNase מעכב (הנפח הכולל 20 μL) בצינור microcentrifuge. ספין למטה את התערובת בקצרה באמצעות מיקרו צנטריפוגות ולשמור על הקרח.
    3. הוסף 2 μL של למאגר התגובה 10x לכל אחד הצינורות 0.2 מ"ל PCR בודדים (המשמש לאיסוף הנוירונים שנקטפו). לייבל הצינורות עם התגים מתאימים זיהוי נוירונים להיות שנקטפו ולאחסן קפוא על 4 מעלות צלזיוס.
  2. צעדים לביצוע ביום של הניסוי
    1. המצאה של פיפטות הקציר.
      1. משוך micropipettes בקוטר גדול-קצה (2 - 8 מיקרומטר) מן צינור נימים האפוי באמצעות חולץ microelectrode ואת נימת חימום מצופה זכוכית של microforge. הגדר את החולץ לגבש micropipettes עם להתחדד ארוך. השתמש microforge מצויד graticule העיני מכויל ו ob הספק גבוהjective לשבור את קצה micropipette לגודל קצה הרצוי (10 - 20 מיקרומטר).
      2. הדקו את micropipette לתוך מחזיק פיפטה microforge הר בעל על microforge. תביא את קצה micropipette אל מוקד מעל נימת החימום מצופה זכוכית באמצעות מניפולטור המכאני של microforge ולעבור על הזרם אל הנימה כדי לחמם אותה. גע קצה פיפטה אל הנימה המחוממת. לנתק את הזרם כאשר קצה פיפטה נמס לקוטר המתאים.
        הערה. כיבוי הזרם יגרום נימה לנוע לפתע כלפי מטה ולנתק מן קצה פיפטה, הפקת פיפטה גדולה, פתוחה שקצהו עם בקוטר הרצוי.
      3. אחסן את micropipettes הושלמה בתוך קופסה סגורה עד הצורך.
    2. קציר נוירונים.
      הערה. נוירונים בתרבית נבצרו באי גרסה שונה של פרוטוקול שפורסם בעבר 6.
      1. ביסודיות CLבק כל המשטחים של התא וחדר הקציר אשר באים במגע עם מאכלי תרבויות וצינורות גבייה באמצעות חיטוי מים נוזליים ואחריו לשטוף במים. נגבו את המשטחים לחטא עם 80% אתנול ו אז לנגב RNase-מעכב-רווי.
      2. מלאו שתי מכולות מבודדות עם קרח, אחד עם רגיל (מים) קרח ועוד עם קרח יבש. מניחים את הצינורות אוסף 0.2 מ"ל PCR מילא בעבר עם 2 μL של חיץ התגובה 10x על הקרח הרגיל.
      3. הסר את צלחת תרבות המכיל הנוירונים מן החממה, לנקז את המדיום תרבות מצלחת, לשטוף עם 2 מ"ל של RNase ללא PBS של Dulbecco (DPBS) ולהחליף עם 1 מ"ל של DPBS לקציר.
      4. זהה פלורסנט, נוירונים TH-חיוביים בתרבויות המוח התיכונות הראשוניות באמצעות מיקרוסקופ הפוכה, epifluorescence מצוידת מטרת שלב 40X, מנורה כספית, ומערכת סינון GFP.
      5. מקם את פיפטה מעל סומה התא באמצעות מייל ממונע או הוראותcromanipulator. לשאוב הנוירון לתוך micropipette הזכוכית באמצעות שאיבה עדינה מיושמת על ידי פה דרך צינורות הפלסטיק המחובר ליציאה בצד של בעל micropipette. מיד להסיר את micropipette המכיל את התא מפתרון הרחצה.
      6. הניחו את קצה פיפטה בתוך חיץ התגובה המכיל אוסף צינור 0.2 מ"ל PCR, ולשבור את קצה נגד הצד של הצינור, קרוב לתחתית. לגרש את הנוזל הנותר (0.5 - 1.5 μL) מהקצה השבור של micropipette על ידי הצבת מחט מזרק סטרילי 21 G בחלק האחורי של micropipette והפעלת לחץ כלפי חוץ.
      7. צנטריפוגה צינור איסוף עבור 5 ים באמצעות צנטריפוגות-מיקרו שולחניים להקפיא אותו בקרח יבש. אחסן את צינורות אוסף המכיל תאים בודדים ב -80 מעלות צלזיוס. בדרך כלל, 5 תאים נקצרים לכל צלחת פני תקופת 1 שעות בטמפרטורת הסביבה.

3. תא בודד RNA-seq דור הספרייה

  1. דור של cDNA הגדיל הראשון
    הערה: לקבלת השלבים הבאים משתמשים ריאגנטים מתוך הערכת הרצף המסחרית.
    1. תביאו ריאגנטים להלן על הקרח לקבינט PCR. להכין תערובת אב גדיל הראשונה בתוספת 10% על ידי שילוב של חומרים כימיים הבאים בטמפרטורת החדר בתוך ארון PCR: 2 חיץ גדיל הראשונה 5x μL, 0.25 μL DTT (100 מ"מ), 1 μL תמהיל dNTP (10 מ"מ), 1 oligonucleotide μL ( 12 מיקרומטר), 0.25 μL RNase אינהיביטור, ו 1 μL הפוכה transcriptase (100 יחידות). זהו שילוב הורי transcriptase ההפוך (נפח הכולל 5.5 μL לכל תגובה).
    2. קח את הדגימות מן -80 C על קרח יבש ומביא בקבינט PCR. הוסף את הקוד הבא מדגם התא הבודד: 1 μL 3 'פריימר 1 ו 1 μL לכמת קוצי RNA. להביא דוגמאות על גוש ילר להגדרה קבועה מראש thermocycler חם המכסה על 72 מעלות צלזיוס.
    3. דגירה צינורות ב thermocycler 3 דקות ב 72 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן הניח את דגימות על מדף קריר PCR.להוסיף 5.5 μL של מיקס מאסטר (משלב 3.1.1) כדי צינור כל תגובה ומערבבים ידי pipetting בעדינות. ספין 0.2 צינורות μL עבור 5 ימי דגירה של thermocycler כדלקמן: 42 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות, 70 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. החזק על 4 מעלות צלזיוס.
  2. טיהור Amplified סטרנד ראשון cDNA.
    הערה: cDNA המוגבר PCR מטוהר על ידי קיבוע על חרוזים מגנטיים. השתמש בהתקן הפרדה מגנטי עבור 0.2 צינורות מ"ל.
    1. Aliquot חרוזים מגנטיים לתוך 1.5 צינורות מ"ל. לפני כל שימוש, להביא aliquots חרוז בטמפרטורת החדר למשך לפחות 30 דקות ומערבבים היטב להתפזר. חרוזים מגנטיים וורטקס עד מעורב באופן שווה.
    2. הוסף 25 μL של חרוזים מגנטיים מדגם זה. מערבבים על ידי pipetting את הווליום כולו ומטה לפחות 10x לערבב ביסודיות. לדגור על RT במשך 8 דקות כדי לאפשר לאגד cDNA על חרוזים.
  3. הכנת מיקס מאסטר PCR
    1. מכינים את תערובת מאסטר DS-cDNA הגברה PCR לכל התגובות עם additional 10% על ידי ערבוב 5 חיץ μL 10x PCR, 2 μL תמהיל dNTP (10 מ"מ), 2 פריימר 2 μL PCR (12 מיקרומטר), 2 μL 50x 2 לערבב פולימראז, ו -39 μL ללא מים nuclease (50 μL הנפח הכולל / תְגוּבָה).
  4. הגברה של סטרנד ראשון
    1. מניח את הדגימות וחרוזים מגנטיים על דק מגנטי הפרדת מכשיר ≥5, עד שהנוזלים נראים ברורים ומובנים לחלוטין, ואין חרוזים עזבו ב supernatant.
    2. שמירה על דגימות במכשיר ההפרדה, פיפטה supernatant וזורקים. ספין דגימות במשך 5 s לאסוף את הנוזל מהצד של הצינור. מניחים את דגימות במכשיר הפרדה מגנטי למשך 30 שניות, ולאחר מכן להסיר כל supernatant הנותרים עם pipettor P10.
    3. הוסף 50 μL של מיקס מאסטר PCR לכל DNA שפופרת המכילה כבול החרוזים מהשלב הקודם. מניחים את הצינורית Cycler תרמית שחומם מראש (95 ° C) עם מכסה מחומם. להתחיל את הרכיבה התרמית באמצעות progra הבאמ ': 95 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות, 26 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, 65 ° C למשך 30 שניות, 68 מעלות צלזיוס במשך 6 דקות. אז 72 מעלות צלזיוס 10 דקות. החזק על 4 מעלות צלזיוס.
      הערה: בדוק במדריך למשתמש רצף לפרטים נוספים, וכדי לייעל את הגדרות לדוגמה.
  5. טיהור Amplified פעמים התקועה cDNA
    1. להוסיף 90 μL של חרוזים מדגם זה. מערבבים על ידי pipetting את הווליום כולו ומטה לפחות 10x לערבב ביסודיות. לדגור על RT במשך 8 דקות כדי לאפשר לאגד cDNA על חרוזים. מניח את הדגימות בתוספת חרוזים במכשיר הפרדה המגנטית עבור ≥5 דקות, עד שהנוזלים נראים ברורים ומובנים לחלוטין, ואין חרוזים עזבו ב supernatant.
    2. בעוד הדגימות הן במכשיר הפרדה מגנטי, להסיר את supernatant וזורקים. שמור את הדגימות במכשיר הפרדה המגנטית. להוסיף 140 μL של אתנול טרי 85% מדגם זה מבלי להפריע את החרוזים. חכה 30 שניות. פיפטה את supernatant. cDNA יישאר כבול אל ביהds במהלך תהליך הכביסה.
    3. חזור על לשטוף אתנול פעם נוספת.
    4. בקצרה ספין הדגימות כדי לאסוף את הנוזלים מהצד של הצינור. מניח את הדגימות במכשיר הפרדה המגנטית למשך 30 שניות, ולאחר מכן להסיר כל אתנול הנותרים עם טפטפת. מניח את הדגימות בטמפרטורת חדר למשך 2 - 2.5 דקות עד הגלולה יבשה כבר לא מבריקה (כלומר לפני מתגלה סדק).
      הערה: יבש גלולה רק עד שהוא פשוט יבש. הגלולה תיראה מט ללא ברק. אם הגלולה אינה יבשה, אתנול יישאר הבארות המדגמות, אשר תפחית את שיעור התאוששות cDNA הגברה לבין התשואה. אם הגלולה נגמרה-יבשה, יהיו סדקים הגלולים. זה ייקח זמן רב יותר מאשר 2 דקות הרעננות ועשוי להפחית התאוששות ואת תשואת cDNA הגברה.
    5. לאחר החרוזים יבשים, להוסיף 22.5 μL של חיץ elution לכסות גלול החרוז. הסר את דגימות מהתקן הפרדה מגנטי ומערבבים היטב כדי resuspend את החרוזים. בcubate ב RT במשך 10 דקות כדי רעננותם.
    6. ספין דגימות במשך 5 s לאסוף את הנוזל מהצד של הצינור. מניח את הדגימות חזרה במכשיר הפרדה המגנטי עבור ≥1 דקות, עד הפתרון הוא ברור לחלוטין.
      הערה: אוכלוסייה קטנה של חרוזים לא יכול גלולה נגד מגנט במהלך הדגירה. פיפטה חרוז unpelleted אלה מעלה ומטה כדי resuspend אותם עם supernatant, ולאחר מכן פיפטה אותם לעבר המגנט איפה שאר החרוזים כבר pelleted (מבלי לשבש את הגלולה הקיימת).
    7. המשך הדגירה עד אין חרוזים להישאר supernatant. העברת supernatant ברור המכיל cDNA מטוהר מצינור כל לצינור nuclease חינם, נמוכה הידבקות. לייבל כל צינור עם מידע ולאחסן מדגם ב -20 ° C. הדגימות ניתן לאחסן ב -20 ° C ללא הגבלת זמן.
  6. למדידת ריכוז דנ"א גודל שבר
    1. נדרשת בדיקת בקרת איכות על ידי לכימות 1 μL אלiquot של cDNA על fluorometer. להעריך 1 μL (3 ng) של ds-cDNA באמצעות מערכת אלקטרופורזה (כמתואר 1).
  7. פיצול של DNA
    הערה: השתמש בערכה להכנת דגימות DNA.
    1. הוסף 20 μL של cDNA (35 סך ng) לצינור. הוסף 25 μL של Tagment DNA (TD) חיץ אל הצינור המכיל את cDNA.
    2. הוסף 5 μL של TDE1 (Tagment DNA אנזימים) אל הצינור. פיפטה למעלה ולמטה 10x לערבב. השתמש טיפ טרי עבור כל דגימה. צנטריפוגה ב 280 XG ב 20 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות.
    3. מניחים את דגימות thermocycler עם מכסה מחומם ולהפעיל אותו ב: 55 ° C, 5.5 דקות. להוסיף במהירות 50 פתרון μL QG (ערכת חילוץ ג'ל). פיפטה למעלה ולמטה 10x לערבב. המשך ישירות לשלב הבא.
  8. טיהור של ה- DNA קטוע
    1. להוסיף 170 μL של חרוזים, עד פיפטה ולמטה 10x לערבב. אפשר לו לשבת במשך 10 דקות. שים צינורות על המגנט. תנו צינורות לשבת על המגנט במשך 10 דקות.בעוד הדגימות הן במכשיר הפרדה מגנטי, פיפטה supernatant וזורקים.
    2. השאירו את הצינור על המגנט ולהוסיף 200 μL של אתנול 85%. בואו לשבת במשך 30 שניות, ולאחר מכן להסיר אתנול. חזור על לשטוף אתנול. ספין XG צינור 1,000 ב RT.
    3. שים את הצינור בחזרה על המגנט. פיפטה את כל אתנול שיורית. תנו דוגמאות לייבש ב RT במשך 15 דקות.
    4. להוסיף 21 μL של חיץ elution מתוך הערכת ג'ל החילוץ. בואו הצינור לשבת מחוץ למעלה מגנט, פיפטה ולמטה 10x לערבב. בואו הצינור לשבת ב RT במשך 15 דקות.
    5. החזר את הצינור כדי המגנט במשך 5 דקות. פיפטה 20 μL של פתרון (DNA מטוהרים) לתוך צינור חדש.
  9. הגברת תיוג ו PCR של DNA קטועה
    הערה: בשלב זה ה- DNA המטוהר מוגבר באמצעות תכנית ה- PCR מוגבל מחזור. צעד PCR גם מוסיף מדד 1 (i7) והאינדקס 2 (i5) וכן מתאמי משותף (P5 ו P7) (חובה עבור דור אשכול וסדר). עיין DNA שלמדריך להכנה בשפע לפרטים נוספים.
    1. בתוך צינור חדש להוסיף 5 μL של פריימרים 2 מדד (כובע לבן). בעזרת קצה פיפטה חדש להוסיף 5 μL של פריימר מדד 1 (מכסה כתום). הוסף 15 μL של תמהיל מאסטר PCR על צינור אחד.
    2. הוסף 5 μl של קוקטייל PCR פריימר על צינור אחד. הוסף 20 μL של ה- DNA מטוהרים אל הצינור. פיפטה בעדינות מעלה ומטה 3 - 5 פעמים.
    3. בצע PCR באמצעות התוכנית הבאה על thermocycler: 72 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות, 98 ° C למשך 30 שניות, 5 מחזורים של 98 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות, 63 ° C למשך 30 שניות, 72 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות. חזק ב 10 ° C. פנה מיד לנקות PCR או לאחסן מדגם ב 4 ° C עד 2 ד.
  10. טיהור Amplified DNA שברי
    1. תביא את חרוזי RT. כן אתנול 85% טריים. קח דגימות מתוך המכונה PCR ומסובב בקצרה.
    2. הוסף 30 μL של חרוזים אל הצינור. בעדינות פיפטה לערבב למעלה ולמטה 10x. בואו הצינור לשבת בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. BAC מקוםk על המגנט במשך 5 דקות. עם הצינור על המגנט להשתמש פיפטה וזורקים supernatant.
    3. הוספת 200 μL של אתנול 85% על צינור אחד. פיפטה אתנול לכבות לאחר 30 שניות. חזור על לשטוף אתנול 85%. פיפטה אתנול לכבות לאחר 30 שניות.
    4. עם הצינורות עדיין על המגנט ואת המכסים פתוחים, לאפשר חרוזים לייבוש באוויר במשך 15 דקות. הסר את הצינורות מן המגנט.
    5. להוסיף 32.5 μL של חיץ elution. פיפטה בעדינות מעלה ומטה 10x. דגירה את שואבת 10 - 15 דקות.
    6. החזר את הצינורות כדי המגנט במשך 2 דקות, או עד ביטל את supernatant. בזהירות להעביר 30 μL של supernatant לצינור חדש.
  11. למדידת ריכוז דנ"א גודל שבר
    1. נדרשת בדיקה בקרת איכות על ידי כימות ריכוז ה- DNA של 1 μL של cDNA על fluorometer. לקבוע את גודל שבר של ה- DNA על ידי אלקטרופורזה. להעריך 1 μL (3 ng) של ds-cDNA.
  12. רצף
    1. תביאו את ספריות תא בודד-Seq RNA למתקן רצף. צור 100 רצף נ"ב קורא על ברצף הבא פרוטוקול שפורסם בעבר 4.
      הערה: כל ספריית רצף מייצרת> 20 מיליון ייחודי מיפוי קורא.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כאן אנו מדווחים פרוטוקול נוירונים culturing מוח תיכון גחון של עכבר להביע eGFP מונע על ידי רצף אמרגן hydroxylase טירוזין, קצירת נוירונים ניאון פרט מן התרבויות, ומדידת transcriptome RNA שלהם באמצעות RNA-seq (איור 1). מהנתונים עולה כי 100% של תאי TH-eGFP חיובי שנמסקו להפיק ולרצף היו נוירונים דופאמינרגיים, מבוסס על נוכחות של שלושה תמלילי הגן DA הבאים הקשורים, TH, decarboxylase dopa (DDC), ואת נשא דופמין DAT (slc6a3). כל התא החיובי TH-e...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כאן אנו לבודד תאים בודדים מתוך אוכלוסייה הטרוגנית באמצעות תג פלורסנט, אז ללמוד כל תא עם-seq רנ"א חד-תאי. אנו מדווחים כי 100% של תאי TH-eGFP החיים מסקנו להפיק ולרצף היו אכן נוירונים דופאמינרגיים, מבוססים על הנוכחות של תמלילי גן DA הבאים קשור שלוש, TH, DDC ו slc6a3. כל התא החיובי TH-eGFP הביע שלושה גנים לפי הערכת RNA-seq. זה היה שתואם מחקרי אלקטרו שהראו כי כל תא TH-eGFP אף הציג רפרטואר של תעלות יונים הקשורים נוירונים דופאמינרגיים 8,

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכונים הלאומיים לבריאות של ארה"ב (DA017279, AG033954, DA037743), קרן מייקל ג'יי פוקס ויוזמת החדשנות של Caltech המממנת את המעבדה לגנטיקה וגנומיקה ע"ש מילארד ומיוריאל ג'ייקובס במכון הטכנולוגי של קליפורניה. אנו מודים לבריאן וויליאמס על אופטימיזציה של פרוטוקול ספריית RNA-Seq ועל מתן סיוע. אנו מודים להנרי אמריין על ההכשרה החישובית. אנו מודים לברברה ג'יי וולד על השימוש בציוד ובשטח המעבדה שלה. אנו מודים לאיגור אנטושצ'קין על רצף הספרייה ועל ניהול המתקנים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
פפאיןוורת'ינגטון 
תמיסת מלח מאוזנת של הנקס (HBSS), 1xGibco 14175-095
תורם סרוםסוסים תרמו מדעי SH30074.03
אלבומין סרום בקר (BSA)סיגמא A7030-50G
בינוני: בינוני נוירובזאליGibco 21103-049
מצע תרבית המכיל צורה מיוצבת של L-גלוטמין, L-alanyl-L-גלוטמין: GlutaMAXGibco 35050-0610.5 מ"מ ריכוז סופי.
חומצה L-אסקורביתסיגמא A7506
B27גיבקו 17504-044פתרון מלאי פי 50, ריכוז סופי פי 1.
תחתית זכוכית 35 מ"מMatTek   P35GC-1.5-10-C
פולי-L-אורניתיןסיגמא P4957
למיניןסיגמא L2020מאוחסן ב-20 מעלות; C ב-20 ומיקרו; L aliquots
Deoxyribonuclease I (DNase)Sigma DN25
קצות פיפטה כחולה P1000Sorenson Bioscience Inc. 10130
צלחת פטרי רדודה 10 מ"מVWR 25384-324
37 ° C אמבט
37 מעלות; C, 5% אינקובטור
16% פרפורמלדהיד (PFA)מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית 15710
טריטון X-100סיגמא  X100-500 מ"ל
סרום חמורEquitech SD-0100HI100% תמיסת מלאי, 1% ריכוז סופי.
מספריים כירורגיים דפוס סטנדרטיכלי מדע עדינים14000-14
מלקחיים - 2x3 שינייםכלי מדע עדינים11022-14
מלקחיים - Dumont #55כלי מדע עדינים11295-51
מלקחיים - Dumont #5כלי מדע עדינים11252-23
10x PBS, pH 7.4Gibco 70011-044
תמיסה חוצצת פוספט של Dulbecco (DPBS) 1xGibco14190-144500 מ"ל
21 גרם מחטBD PrecisionGlide מחט305167100 מחטים
חולץ מיקרופיפטהסאטרמכשיר דגם P-87
מיקרומניפולטור סאטר אינסטרומנט  ערכת ריצוף MP-285
: ערכת RNA נמוכה במיוחד של SMARTer לריצוף IlluminaClontech634936100 rnxs, כולל ערכת Advantage2PCR
אוליגונוקלאוטיד (12 ומיקרו; M): SMARTer IIA oligonucleotide (12 ומיקרו; M)מתוך ערכת SMARTer 
טרנסקריפטאז הפוך (100 יחידות)SMARTcribe reverse transcriptaseמתוך ערכת SMARTer 
פריימר 13' פריימר CDSIIa מתוך ערכת SMARTer
פריימר 2IS PCR פריימרמתוך ערכת SMARTer
50x 2 תערובת פולימראז50x Advantage 2 תערובתמתוך ערכת SMARTer
מאגר PCR 10x מאגר PCR10x Advantage 2 מאגרמערכת SMARTer
דוקרני RNA ThermoFisher4456740
PCR מתלה קירורIsoFreeze PCR
ערכת הכנת דגימת DNA (Illumina/Nextera) NexterFC-121-103024 דוגמאות
מיקס מאסטר PCRNextera PCR מאסטר מיקס (NPM)מתוך ערכת Nextera 
קוקטייל פריימר PCR (PPC) קוקטייל פריימר Nextera PCR (PPC) מתוך ערכת Nextera
פלואורומטרערכת Qubit ThermoFisherQ33216
HS DNA BioAnalyzer ערכתAgilent5067-4626110 rxns
מערכת אלקטרופורזה אג'ילנט 2100 ביואנלייזר.G2938C
חרוזים מגנטיים: Agencourt AMPure בקמן קולטרA638805 מ"ל
RNAse מגבונים: מגבוני RNAse ZapאמביוןAM9786גודל 100 גיליונות
קיוביט ds HS ערכת בדיקהבדיקות מולקולריות Q32854500 בדיקות
ערכת מיצוי ג'ל: ערכת מיצוי ג'ל QiaquickQiagen 28704
צינורות נימי זכוכית(Kimax-51, 1.5 - 1.8 מ"מ OD)
MicroforgeNarishige (או שווה ערך) 
סיקוונסרIllumina HiSeq מכשיר
GENSAT טירוזין הידרוקסילאז-eGFP זן עכבר מספר מלאי MMRRC: 000292-UNCמלאי Tg(Th-EGFP) DJ76Gsat/מרכז המחקר האזורי של עכבר מוטנט
תאגיד הביוכימיה LS003126מיםלחות פולימראז PCR

מקורות

  1. Henley, B. M., et al. Transcriptional regulation by nicotine in dopaminergic neurons. Biochem Pharmacol. 86 (8), 1074-1083 (2013).
  2. Marinov, G. K., et al. From single-cell to cell-pool transcriptomes: stochasticity in gene expression and RNA splicing. Genome Res. 24 (3), 496-510 (2014).
  3. Kim, D. H., et al. Single-cell transcriptome analysis reveals dynamic changes in lncRNA expression during reprogramming. Cell Stem Cell. 16 (1), 88-101 (2015).
  4. Ramskold, D., et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nat Biotechnol. 30 (8), 777-782 (2012).
  5. Gertz, J., et al. Transposase mediated construction of RNA-seq libraries. Genome Res. 22 (1), 134-141 (2012).
  6. Morris, J., Singh, J. M., Eberwine, J. H. Transcriptome analysis of single cells. J Vis Exp. (50), (2011).
  7. Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat Protoc. , 562-578 (2012).
  8. Srinivasan, R., et al. Smoking-Relevant Nicotine Concentration Attenuates the Unfolded Protein Response in Dopaminergic Neurons. The Journal of Neuroscience. 36 (1), 65-79 (2016).
  9. Henderson, B. J., et al. Menthol Alone Upregulates Midbrain nAChRs, Alters nAChR Subtype Stoichiometry, Alters Dopamine Neuron Firing Frequency, and Prevents Nicotine Reward. J Neurosci. 36 (10), 2957-2974 (2016).
  10. Gong, S., et al. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425 (6961), 917-925 (2003).
  11. Kim, J., Henley, B. M., Kim, C. H., Lester, H. A., Yang, C. Incubator embedded cell culture imaging system (EmSight) based on Fourier ptychographic microscopy. Biomed Opt Express. (8), 3097-3110 (2016).
  12. Lammel, S., et al. Diversity of transgenic mouse models for selective targeting of midbrain dopamine neurons. Neuron. 85 (2), 429-438 (2015).
  13. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
  14. Dryanovski, D. I., et al. Calcium entry and alpha-synuclein inclusions elevate dendritic mitochondrial oxidant stress in dopaminergic neurons. J Neurosci. 33 (24), 10154-10164 (2013).
  15. Kimm, T., Khaliq, Z. M., Bean, B. P. Differential Regulation of Action Potential Shape and Burst-Frequency Firing by BK and Kv2 Channels in Substantia Nigra Dopaminergic Neurons. J Neurosci. 35 (50), 16404-16417 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

קצירת תאים בודדיםתרביות של חלק הבטני של האמצעי (Ventral Mesencephalic Cultures)בידוד תאיםמיקרוסקופיה פלואורסצנטיתסינתזת cDNAניתוח ביטוי גנים
זיהוי אמין של חיים דופאמין נוירונים תרבויות המוח התיכון באמצעות רצף RNA ו- TH-מונחה האמרגן ביטוי eGFP
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.