מאמר שיטה

פרוטוקול הניסוי לזיהוי כחוליות בדגימות נוזלים ומוצקים עם צ'יפ Microarray נוגדן

DOI:

10.3791/54994

⸱

7 בפברואר 2017

 ,  , 
1Department of Molecular Evolution, Centro de Astrobiología (CAB, INTA-CSIC)

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נוכחותם של רעלנים ציאנובקטריאליים במאגרי מים מתוקים למאכל אדם היא דאגה גדולה עבור רשויות ניהול המים. כדי להעריך את הסיכון לזיהום מים, מאמר זה מתאר פרוטוקול לגילוי בשטח של זנים ציאנובקטריאליים בדגימות נוזליות ומוצקות באמצעות שבב מיקרו-מערך נוגדנים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התחממות גלובלית eutrophication לעשות קצת אקולוגיות מימיות להתנהג bioreactors נכון כמו המפעילות צמיחה כחוליות מהירות ומסיבית; יש זה בריאות רלוונטית השלכות כלכליות. זנים כחוליות רבים מפיקים רעלן, ורק כמה תאים נחוצים כדי לגרום נזק בלתי הפיך לסביבה. לכן, מי גוף הרשויות ומנהלים דורשים מערכות מהירות ויעילות התרעה מספקות נתונים אמינים כדי לתמוך בהחלטות המניעות או ריפוי שלהם. כתב יד זה מדווח פרוטוקול הניסוי לצורך זיהוי ב-שדה של זנים כחוליות לייצר רעלן באמצעות שבב microarray נוגדן עם 17 נוגדנים (ABS) עם רזולוציה טקסונומיות (CYANOCHIP). הנה, immunoassay microarray כריך זמנית ניאון (FSMI) עבור ניטור סימולטני של 17 זנים כחוליות נמצא לעתים קרובות פורח במערכות אקולוגיות של מים מתוקים, חלקם מפיקים רעלן, מתואר. Microarray עם רבple משכפל זהה (עד 24) של CYANOCHIP שהודפס לשקופית מיקרוסקופ יחידה לבחון מספר דומה זמני של דגימות. דגימות נוזליות יכולות להיבדק על ידי דגירה ישירה עם (ABS) הנוגדנים או לאחר ריכוז תא על ידי סינון דרך פילטר 1 עד 3 מיקרומטר. דגימות מוצקות, כגון משקעים וסלעי קרקע, הם הומוגני ומתפזרים ראשונים על ידי ultrasonicator כף יד מאגר דגירה. הם מסונן מכן (5 - 20 מיקרומטר) כדי להסיר את החומר הגס, ואת התסנין הוא מודגרות עם שרירי בטן. Immunoreactions מתגלה על ידי דגירה סופית עם תערובת של 17 Abs שכותרתו פלואורסצנטי נקרא על ידי גלאי קרינה ניידים. התהליך כולו לוקח בערך 3 שעות, ורובו מתאים לשתי תקופות 1-שעות של דגירה. הפלט הוא דימוי, שבו כתמים בהירים מתאימים זיהוי החיובי של סמנים כחוליות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איתור וניטור של מיקרואורגניזמים קהילות חיידקים טבע מורכבים הם קריטיים בתחומים רבים, כולל ביו-רפואה, אקולוגיה סביבתית, לאסטרוביולוגיה. כחוליות הם מיקרואורגניזמים פרוקריוטים ידועים ביכולתם ליצור פורח (התפשטות מוגזמת) של תאים במים מתוקים. הם נמצאים בכל מקום, ומינים רבים מסוגלים לייצר רעלנים, מובילה לא רק כדי סיכון פוטנציאלי לבריאות האדם, אלא גם השפעה אקולוגית. בהקשר זה, חשוב לפתח שיטות מהירות ורגישות לגילוי המוקדם של כחוליות ו / או רעלנים שלהם באדמה ובמים. לצורך זה, immunoassay microarray הכריך פלורסנט זמנית (FSMI) פותח ככלי מנהלי מים כדי לסייע להם בקבלת החלטות, וכתוצאה מכך, ביישום תוכניות ניהול מים נאותות.

מגוון רחב של שיטות פותח כדי לאתר ולזהות ציאןתאים cyanotoxins obacterial באדמה ובמים, כולל מיקרוסקופיה אופטית, ביולוגיה מולקולרית, וטכניקות אימונולוגית. שיטות אלה יכולים להשתנות במידה רבה את המידע שהם מספקים. טכניקות מיקרוסקופיות מבוססות על מורפולוגיה תאי זיהוי של קרינת in vivo מ פיגמנטים כחוליות, כגון phycocyanin או כלורופיל 1. למרות שהם שיטות מהירות וזולות עבור בזמן אמת ניטור תכוף כי להודיע על הסוג והמספר כחוליות נוכח מדגם, הם לא נותנים מידע על הרעילות האפשרית. בנוסף, הם דורשים רמה מסוימת של מומחיות, בהתחשב בכך הוא לעתים קרובות קשה מאוד להבחין בין מינים קרובים 2. כדי להתגבר על המגבלות האלה, מיקרוסקופ אור חייב להיות מלווה על ידי שני מבחני המיון הביולוגי ביוכימיים ושיטות physicochemical לזיהוי וכימות של cyanotoxins.

מבחני immunosorbent enzyme-linked (ELISA), מבחני עיכוב פוספט החלבון (PPIA), ובדיקות ועצביות עכברים הם דוגמאות של מבחני מיון ביוכימיים לצורך זיהוי של cyanotoxins. בעוד שתיים הראשונים הם מתודולוגיות מהירים ורגישים, תוצאות חיוביות שגויות תוארו בעת שימוש בדיקות ELISA ו- PPIA מוגבלות לשלושה סוגי רעלים. מבדק העכבר הוא טכניקה איכותית עם רגישות נמוכה ודיוק, ורישוי מיוחד והכשרה נדרשת. בנוסף, זה לא נותן מידע על סוג של רעלים הנמצאים במדגם. Cyanotoxins ניתן מזוהה לכימות על ידי שיטות אנליטיות אחרות, כגון כרומטוגרפיה נוזלית בעל ביצועים גבוהים (HPLC), ספקטרומטריית מסה-כרומטוגרפיה נוזלית (LC-MS), גז כרומטוגרפיה (GC), ספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסת הגז (GC-MS), או זמן יינון desorption / לייזר בסיוע מטריקס של טיסה (MALDI-TOF). עם זאת, זה אפשרי רק אם סטנדרטי התייחסות, אשר צריךed לקבוע ריכוזי רעלן פרט בדגימות מורכבות, זמין 3, 4. יתר על כן, שיטות אלה הן זמן רב; דורש ציוד, אספקה ​​יקר, הכנת מדגם; וחייבת להתבצע על ידי צוות מנוסה מיוחד.

מולקולריות מבוסס שיטות יושמו במשך עשרות שנים כדי לאתר, לזהות, ולכמת כחוליות ו cyanotoxins המתאים הודות לפרטי הרצף שפורסמו בכתב מסדי הנתונים הגנום (למשל, המרכז הלאומי למידע ביוטכנולוגיה, צמח שדה). בין השיטות הללו הם אלה המבוססים על תגובת שרשרת פולימרז (PCR), המחייב את העיצוב של סטים של פריימרים עבור הגברת DNA ותלוי ידע קודם של רצפי DNA של מינים כחוליות שונים. בעוד זיהוי הגן, כמו אופרון phycocyanin, מוביל זיהוי מדויק ברמת הסוג, כמה מינים או זנים הם מבלי שיבחינו עםהשיטה הזאת. עם זאת, הגנים המקודדים-טוקסין, כגון השייכים אופרון microcystin, להקל על זיהוי של רעלים בדגימות שבו המפיקים הם נדירים 5. עם זאת, זיהוי של סמני רעלן ידי PCR אינו מצביע בהכרח רעיל בסביבה. יתר על כן, הקבוצה של פריימרים פותחו כדי לנתח את המגוון השלם של מינים של מפיקים כחוליות ורעלנים נוכחים מדגם שעדיין לא הושלם, ועל מחקרים נוספים צריכים לעשות כדי לזהות מינים שאינם מוכרים. בטכניקות מולקולריות אחרות שאינן PCR מבוססים, כגון קרינת כלאה באתרו (FISH) ואת מערכי DNA.

בטכנולוגית שני העשורים, microarray האחרונים צברה חשיבות בתחומים רבים של יישום, במיוחד ניטור סביבתי. מערכי DNA לאפשר אפליה בין המינים analytes 4, 6, 7 sup>, 8, 9, 10, אבל הם נחשבים מאוד מייגעים זמן רב משימות שכוללות שלבים מרובים (לדוגמא, ביצועי microarray, מיצוי DNA, הגברת PCR, ו כלאה). מסיבה זו, מבחני זמן רבים פחות מבוססים על נוגדנים, כגון כריך microarrays אימונולוגיים התחרותי, הפכו שיטה חיונית ואמינה תפוקה גבוהה לצורך זיהוי של analytes המרובה הסביבתי 11, 12, 13. היכולת של נוגדנים להכיר תרכובות היעד שלהם במיוחד כדי לזהות כמויות קטנות של analytes וחלבונים, יחד עם האפשרות לייצר נוגדנים נגד כמעט כל חומר, להפוך microarrays נוגדן טכניקה רבת עוצמה למטרות סביבתיות. בנוסף, את היכולת להשיג מספר ניתוחי כמוingle assay, עם מגבלות של גילוי החל ppb כדי PPM, הוא אחד היתרונות העיקריים של שיטה זו 14.

חיישנים ביולוגיים מבוססי נוגדן הוכיחו להיות כלי רגיש מהירה לצורך זיהוי של מגוון רחב של פתוגנים ורעלים ניטור סביבתי 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21. בעוד שיטות DNA כרוכות בכמה שלבים, microarrays מבוסס הנוגדנים דורש רק הכנת מדגם קטנה המבוססת בעיקר על צעד תמוגה קצר חיץ פתרון הולם. Delehanty ו Ligler 15 דיווחו על זיהוי סימולטני של חלבונים analytes חיידקי בתערובות מורכבות המבוססות על immunoassay כריך נוגדן מסוגל לאתר ריכוז חלבון של 4 ppbד 10 4 CFU / מ"ל של תאים. Szkola et al. 21 פתחו microarray זמנית זולה ואמינה עבור זיהוי סימולטני של proteotoxins ורעלים קטנים, תרכובות היכולות לשמש לוחמה ביולוגית. הם זיהו ריכוזים של הרעלן ריצין, עם הגבלה של גילוי של 3 ppb, בתוך פחות מ -20 דקות. לאחרונה, CYANOCHIP, הנוגדן microarray מבוסס biosensor לגילוי באתרו של כחוליות רעילות רעילות, תואר 22. microarray זה מאפשר זיהוי של פרחים כחוליות פוטנציאל, בעיקר בסביבות מימיות, אשר קשה לזהות מיקרוסקופית. המגבלה של זיהוי של microarray היא 10 2 - 10 תאים 3 עבור רוב המינים, מפנים biosensor זו תוכל להפוך לכלי חסכוני לצורך זיהוי הזמני וזיהוי כחוליות, אפילו ברמת המין. כל המאפיינים הללו להפוך את antiboטכניקת microarray dy, ובמיוחד השיטה המוצגת בעבודה זו, שיטה מהירה ופשוטה יותר לעומת הטכניקות הנ"ל.

היצירה מציגה שתי דוגמאות של ניסויים שמשתמשים biosensor microarray מבוסס נוגדנים כדי לזהות את נוכחותו של כחוליות בדגימות קרקע ומים. זוהי שיטה פשוטה ואמינה המבוססת על פורמט immunoassay כריך הדורשת כרכי מדגם קטנים מאוד הכנת מדגם מאוד בסיסית. השיטה מחייבת זמן קצר והוא יכול להתבצע בקלות בתחום.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנה של Immunogens

  1. לגדול כל זן כחוליות במדיום התרבות המקביל בתנאים המתוארים בטבלה 1.
    הערה: התנאים בינוני צמיחה והתרבות עבור כל זן כחוליות מפורטים בטבלה 1. כל הזנים כחוליות, למעט K17, שייכים לקבוצה של אנטוניו Quesada מ אוטונומית אונ' (מדריד, ספרד). הנוגדן נגד rubescens Planktothrix נוצר ממדגם הטבעי של בלום monospecific של cyanobacterium זה מן המאגר Vilasouto (צפון ספרד).
  2. לכמת את מספר התאים באמצעות תא ספירת תאים על ידי מיקרוסקופ אופטי כדי להשיג כ 10 8 תאים / מ"ל מתרבות שלב הצמיחה המעריכית או נייח מאוחר.
  3. קציר תאים מ 5 מ"ל של התרבות על ידי צנטריפוגה XG ב 2000 למשך 5 דקות.
  4. בטל supernatant ו resuspend התאים בתוך גיגית של 10 מ"לדואר עם 5 מ"ל של תמיסת מלח שנאגרו פוספט 1x (1x PBS) כדי להשיג כ -10 8 תאים / מ"ל.
  5. Homogenize ו lyse התאים של ההשעיה על ידי sonication במשך 5 מחזורים, 30 שניות כל אחד, עם הפסקה 30 עד 60-s על קרח, באמצעות מעבד קולים נייד, כף יד או על ידי טבילת הצינור לתוך אמבט המים של משבש תא המשרעת המקסימלית (30 קילוהרץ).
  6. חזור על שלבים 1.3 - 1.5 עבור כל זן של cyanobacterium.
    הערה: Sonication מייצרת הפרעת תא ושחרור תוכן סלולארי. בעוד חלבוני סוכרים הם immunogens טוב, מולקולות ספציפיות, כגון שומנים וחומצות גרעין, לא לגרום לתגובת immunogenic לחות על ידי עצמם. לכן, הם חייבים להיקשר ספקים, כגון סוכרים או חלבונים, כדי להגדיל את המורכבות המולקולרית. בנוסף, sonication משחרר חומר תאי שיכול לעורר ייצור נוגדנים.

הפקת 2. של נוגדני Polyclonal

  1. הכן את IMM הראשוןמנה unogen ידי ערבוב 0.5 מ"ל של lysate התא ultrasonicated שהושגו בשלב 1.5 עם 0.5 מ"ל של אדג'ובנט של שלמה פרוינד. ויעביר אותו מפעיל במתקן לחיות לייצור נוגדן ארנבת polyclonal.
  2. כן שלוש מנות יותר כמו קודם לשימוש נוסף כמו מגביר זיכרון בתהליך ייצור הנוגדנים על ידי ערבוב 0.5 מיליליטר של homogenate / lysate אותו שהושג בשלב 1.5 עם 0.5 מיליליטר של אדג'ובנט של פרוינד השלם. תן להם למתקן החיה למלא את תהליך ייצור נוגדנים.
  3. חזור על שלבי 2.1 ו -2.2 עבור כל תהליך ייצור נוגדנים חדש.
    הערה: בדרך כלל, ייצור נוגדנים מופקד למתקני בעלי חיים מיוחדים או חברות, משום רישוי והכשרה מתאימים נדרשים לעבוד עם בעלי חיים. החברות לספק assay immunosorbent ביחס enzyme-linked (ELISA) מדידת כמות הנוגדנים אנטיגן ספציפי הנוכחי במדגם בסרום.

3. נוגדן תחנותication

  1. לטהר את אימונוגלובולינים G (IgG) החלק מהשני החיסוני ואת הסרום מראש החיסוני שנאסף בשלב 2 על ידי חלבון-A כרומטוגרפיה זיקה. כמה ערכות טיהור מסחריות, מבוסס על מערכות מחסנית, עובדות טוב; פעל בהתאם להוראות ספק.
  2. כאשר ערכת הטיהור אינה מספקת מערכת desalting, לשנות את החיץ לאחר elution של הנוגדנים המטוהרים 0.1X PBS, בין אם על ידי דיאליזה או באמצעות מכשירים מסננים צנטריפוגלי עם 100-kDa (או נמוך) גודל נקבובי הממברנה.
  3. קבע את ריכוז נוגדנים על ידי מדידת הספיגה ב 280 ננומטר או בשיטות colorimetric, כגון ברדפורד 23, לורי 24, או חומצת Bicinchoninic (BCA) 25.
    הערה: חשוב להימנע מלכלול קבוצות אמינות למאגר elution (למשל, טריס המאגרים) מכיוון שהיא מתחרה עם הנוגדן עבור מחייב משטחים מוצקים מופעלים עם קבוצות אפוקסי. לאחר purification, חשוב לבדוק את פעילות הנוגדן עם ELISA.

4. תיוג נוגדן פלואורסצנטי

  1. לייבל נוגדנים מטוהרים שהושגו בסעיף 3 עם fluorochrome (למשל, צבע פלואורסצנטי מרחיקות אדום) על ידי המסת בקבוקון מסחרי המכיל לצבוע מ"ג תיוג 1 של החלבון לתוך 100 μL של sulfoxide דימתיל (DMSO). הוסף 2 μL של צבע מומס לכל שמכינה את הנוגדנים בריכוז של 2 מ"ג / מ"ל ​​בנפח סופי של 50 μL ב 50 מ"מ פוספט שנאגרו מלוחים (pH 8.5).
  2. לשמור על תגובות תיוג תחת תסיסה מתמשכת עבור 1 שעות בטמפרטורת הסביבה ו -1,200 סל"ד על פלטפורמת רטט.
  3. לטהר את הנוגדנים שכותרתו ידי כרומטוגרפיה הדרת גודל (למשל, באמצעות ג'ל עם מגוון חלוק בין 1.5 ו -30 kDa לכודים בתוך טור), בעקבות המלצות ספק.
  4. מדוד את הספיגה ב 280 ננומטר ב 650 ננומטר eluates ולחשב את Labeיעילות לינג בעקבות המלצות ספק.
    הערה: עד 50 x 50-μL תגובות נוגדן-תיוג ניתן לעשות עם בקבוקון אחד של הצבע פלואורסצנטי עבור מ"ג תיוג 1 של חלבון. מומלץ לכסות את הצינורות עם רדיד אלומיניום או, לחילופין, להשתמש צינורות 0.5 מ"ל אטום כדי למנוע תהליכים מרווה לאחר שלב 4.3. עבור נוגדני IgG, תיוג אופטימלי מושג עם 3-7 mol של הצבע לכל mol של נוגדן.

5. הפקת CYANOCHIP

  1. נוגדנים ובקרי פתרון הדפסה
    1. כן 30 μL של נוגדן זה מטוהר פתרון הדפסה על ידי ערבוב כל נוגדן הוא 1 מ"ג / מיליליטר ב חיץ הדפסת חלבון 1x מסחרי עם 0.01% (v / v) Tween 20 (א ניקוי שאינו יוני), הכל כפי ריכוזי סופי.
      הערה: לחלופין, פתרון נוגדנים עשוי להכיל גליצרול 20%, 1% (w / v) סוכרוז (או trehalose, כחומר משמר), ו 0.01% (v / v) Tween 20 חיץ קרבונט (pH 8.5).
    2. כן 30 μL של פתרון הדפסה כפקדים: (א) חיץ הדפסת 1x חלבון עם 0.01% (v / v) Tween 20, (ב) חלבון-סרום מראש חיסוני מטוהר הוא 1 מ"ג / מיליליטר במאגר הדפסת חלבון 1x עם 0.01% (v / v) Tween 20, ו- (ג) בסרום שור אלבומין (BSA) הוא 1 מ"ג / מ"ל ​​ב 1x חיץ הדפסה חלבון עם 0.01% (v / v) Tween 20.
    3. כן 30 μL של שכותרתו fluorescently, סרום מראש חיסוני מטוהר בריכוזים שונים (למשל, בין 50 מיקרוגרם / מיליליטר ל 1 מיקרוגרם / מיליליטר) במאגר הדפסת חלבון 1x עם Tween 20, כמו בשלב 5.1.1. דגימות אלה ישמשו כסמנים מסגרת ניאון כימות הקרינה היחסית לאחר תצפית.
    4. הוסף 30 μL לכל טוב של פתרונות הדפסה ערוכים צעדים 5.1.1, 5.1.2, 5.1.3 ו לאיכות בגובהו 384 גם microplates לייצור microarray, כגון פוליפרופילן.
      הערה: חיץ הדפסה חלבון מגביר את האיכות והיציבות של נוגדנים, Tween 20 והומוגניזציה נקודה מוrphology ובונה את הצימוד עד חלבון. מומלץ לשמור על microplate 384 גם ב 4 ° C לפני השימוש. ולאחסן אותו ב -20 מעלות צלזיוס במשך פרקי זמן ארוכים. יש פוליפרופילן נמוך DNA, חלבון, תמצית תא, ו-מולקולה קטנה מהותי מחייב.
  2. הדפסת נוגדן לשקופית מיקרוסקופ
    הערה: הדפס את הנוגדנים על גבי שקופיות מיקרוסקופ מופעלות באמצעות פלטפורמות מערך שונות, כמו מגע, מפוצל מחט, או התקנים ללא מגע, כגון מדפסות פיזואלקטריים או "דיו סילון" טכנולוגיות. בעבודה זו, CYANOCHIP הודפס באופן שגרתי על ידי מגע באמצעות מערכת רובוטית (arrayer) מסוגל תצפית כמויות nL של נוגדנים בקנה מידה מיקרומטר.
    1. הגדר את התנאים הסביבתיים של חדר ההדפסה עד 20 מעלות צלזיוס ו 40 - 50% לחות יחסית.
    2. הגדרת מצעים שקופיות (למשל, 75- x 25 מ"מ שקופיות זכוכית מיקרוסקופ אפוקסי המופעל) לבצע מספר ערה נוגדנים זהיםys על כל שקופית.
    3. ספוט כל נוגדן מטוהר, כולל בקרות מערכת הייחוס, בדפוס נקודה בשלושה עותקים; בתנאים אלה, הכתמים 180 - 200 מיקרומטר בקוטר.
    4. לאחר ההדפסה, להשאיר את השקופיות למשך 30 דקות לפחות בטמפרטורת הסביבה לתת להם להתייבש, ולאחר מכן לאחסן אותם ב 4 מעלות צלזיוס; לעבודה בתחום, השקופיות ניתנות מועברות ומאוחסנות בטמפרטורת הסביבה במשך מספר חודשים.
      הערה: CYANOCHIP מודפס בפורמט microarray נקודה בשלושה עותקים עם 3 x 8 microarrays זהה לכל שקופית או 9 מערכים זהים במתכונת microarray 1 x 9. כל גודל מערך אסור להיות גבוה יותר מאשר מאפייני תא תגובה עבור אטם 24 גם (בדרך כלל 7.5 x 6.5 מ"מ בתא הכלאה 3 x 8).
    5. לפני שימוש microarray לנתח דגימות סביבתיות, השתמש FSMI כדי לקבוע את הדילול עובד עבור כל נוגדן בעיקול טיטרציה. עבור כל נוגדן, להשתמש בריכוז התקן של IMM המקבילunogen (10 3 - 10 4 תאים / מ"ל) ו דילולים סדרתי של נוגדן פלואורסצנטי (בין 1: 500 ו -1: 32,000). ריכוז הנוגדן האופטימלי מתאים 50% של עוצמת האות המרבית מתקבלת בעקום טיטרציה. כמו כן, את הרגישות והסגוליות עבור כל נוגדן צריך להיקבע, כמתואר Blanco et al. 22.

6. הכנת הסביבה Multianalyte תמציות עבור Immunoassay Microarray סנדוויץ פלורסנט (FSMI)

  1. תמצית Multianalyte ממדגם נוזלי
    1. קח 1 - 100 מ"ל של המדגם נוזל עם מזרק סטרילי (למשל, מים מהחוף של מאגר מים); כמות המדגם היא תלויה במידה רבה על ריכוז הפוטנציאל של המטרות.
    2. לרכז את התאים על ידי העברת דגימת המים באמצעות גודל נקבובי 3-מיקרומטר, מסנן פוליקרבונט 47 מ"מ הקוטר; ריכוז הסלולרבין 10 3 - 10 8 תאים / מ"ל רצוי לגילוי חיובית, אך ריכוז בפועל אינו ידוע.
    3. לשחזר את ביומסה שנאספו במסנן עם 1 מ"ל של תמיסת מלח שונה טריס שנאגרו, Tween חיץ 20 מחוזק (TBSTRR; 0.4 M Tris-HCl (pH 8), 0.3 M NaCl, ו -0.1% Tween 20) על ידי גירוד זה עם מרית לתוך צינור של 15 מ"ל.
    4. Homogenize ו disaggregate באמצעות מעבד קולי כף יד, כמתואר בשלב 1.5, או פשוט על ידי pipetting מעלה מספר פעמים למטה; זה מכין את המדגם עבור ניתוח על ידי microarray.
  2. תמצית Multianalyte ממדגם מוצק
    1. לשקול עד 0.5 גרם של המדגם מוצק (למשל, סלע, אדמה, או משקעים) לתוך צינור 10 מ"ל ולהוסיף לה עד 2 מ"ל של TBSTRR.
    2. Sonicate ידי טבילה החללית sonicator בצינור, על ידי טבילת הצינור לתוך אמבט המים של צופר sonicator עצמה, או באמצעות sonicator כף יד. בצע לפחות 5 x 30-sמחזורים ב 30 קילוהרץ, לעצור למשך 30 שניות בעוד על הקרח.
    3. סנן כדי להסיר חול, חימר, חומר גס אחר עם מזרק 10 מ"ל מצמיד את בקוטר 10 עד 12 מ"מ, 5 עד 20 מיקרומטר בעל מסנן ניילון גודל נקבובי. דחוף את המדגם דרך המסנן לתוך צינור 1.5 מ"ל. אם המרווה המסנן, להתסיס את ההשעיה בתוך המזרק ולקחת אותו אל הדף חדש; זה מכין את חומר תסנין עבור immunoassay (שלב 7).
      הערה: קיבולת החציצה של TBSTRR תלוי בסוג של מדגם. חשוב לבצע את immunoassay מיד לאחר הכנת תמצית הסביבה כדי למנוע את ההשפעה של השפלה אנזימטית על analytes. לחלופין, להוסיף מעכבי פרוטאז לתוך התמצית ולהקפיא הסביבה ב -80 ° C עד לשלב הבא.

7. סנדוויץ פלורסנט Microarray Immunoassay (FSMI)

  1. חסימת CYANOCHIP
    הערה: מיד לפני השימוש, לטפל printed מחליק לחסום את כל הקבוצות אפוקסי חינם בשקופית וכדי להסיר את עודפי נוגדנים מאוגדים הלא קוולנטית.
    1. לטבול את microarray לתוך 0.5 M Tris-HCl (pH 9) עם 5% (w / v) פתרון BSA על משטח נקי (למשל, צלחת פטרי או שפופרת 50 מ"ל) עם תסיסה קלה מפלטפורמה נדנדה במשך 5 דקות. לחלופין, להניח את להחליק מטה על ירידה 100 עד 200 μL של הפתרון הנ"ל עם כתמי microarray שעומדים בפניה. השאר למשך 3 - 5 דקות ולאחר מכן להמשיך.
    2. בזהירות להרים את השקופית באמצעות מלקחיים שקצהו פלסטיק; מנסה להימנע אזורי microarray נגיעה. לחסל את עודף הנוזלים ידי דפיקות שקופית ברכות על מגבת נייר. לטבול אותו 0.5 M Tris-HCl (pH 8) עם 2% (w / v) פתרון BSA במשך 30 דקות עם תסיסה קלה מפלטפורמת נדנדה.
    3. ייבש את השקופית על ידי ביצוע צנטריפוגה קצר (200 - 300 XG דקות 1) באמצעות microcentrifuge מסחרי המותאמים שקופיות מיקרוסקופ. לחלופין, לייבש את השקופיות על ידי דפיקות ברכות ontמגבת נייר OA.
  2. דגירה של תמצית מדגם multianalyte עם microarray
    1. הגדר את שקופית קלטת כלת microarray מסחרית עם 24 בארות עבור microarrays המרובה; פעל בהתאם להוראות ספק.
    2. לאחר הרכבת שקופיות קלטת, פיפטה עד 50 μL של תמצית המדגם או דילול של אותו TBSTRR לבאר כל הקלטת.
    3. חזור על שלב 7.2.2 עבור כל דגימה להיות מנותח.
    4. כביקורת ריקה, פיפטה 50 μL של TBSTRR חיץ לתוך לפחות שתי בארות נפרדות של הקלטת.
    5. דגירה בטמפרטורת הסביבה עבור H 1 עם ערבוב ידי pipetting כל 15 דקות או על ידי השארת אותו תחת רעד עדין. לחלופין, דגירה במשך 12 שעות ב 4 ° C.
      הערה: השתמש אטמי דגירה אחרים כפונקציה של דפוס microarray. השעה והטמפרטורה של הדגירה בשלב 7.2.5 הן פרמטרים אמפיריים תלוי בדרך כלל על הזיקה קי מחייבnetics של כל זיווג-נוגדן אנטיגן.
  3. כְּבָסִים
    1. הסר את דגימות על ידי הצבת את הקלטת למטה ובזהירות לדפוק אותו על נייר נקי, סופג.
    2. לשטוף את הבארות על ידי הוספת 150 μL של TBSTRR לכל אחד, ולחסל את החיץ, כנ"ל.
    3. חזור על שלב 7.3.2 שלוש פעמים נוספות.
  4. דגירה עם נוגדני גלאי פלורסנט
    1. הוסף 50 μL של תערובת נוגדנים המכיל את 17 נוגדנים נגד כחוליות-זן, כל אחד מסומן fluorochrome ב TBSTRR עם 1% (w / v) BSA. קבע את הריכוז של כל נוגדן פלורסנט בתערובת (מ 0.7 כדי 2 מיקרוגרם / מ"ל) על ידי ביצוע ניסויים טיטרציה של כל זוג אנטיגן / נוגדן 22.
    2. דגירה עבור h 1 בטמפרטורת הסביבה, כמתואר בשלב 7.2.5, או במשך 12 שעות ב 4 ° C..
  5. ושטף את נוגדני הניאון </ Strong>
    1. הסר את הנוגדנים מאוגדים הניאון, כמו בשלב 7.3.
    2. לפרק את קלטת לטבול את השקופית לתוך 0.1x PBS (למשל, בתוך שפופרת 50 מ"ל) עבור שטיפה מהירה.
    3. יבש את השקופית כמו בשלב 7.1.3.

סריקת 8. עבור קרינה

  1. סרוק את השקופיות עבור קרינה בשיא קרינת פליטה המרבית עבור צבע פלואורסצנטי מרחיק אדום בתוך סורק פלואורסצנטי. קח כמה תמונות של microarrays ב פרמטרי סריקה שונים, בדרך כלל על ידי הפחתת ערך רווח ליזר.
    הערה: הימנע כתמים רוויים (> 65,000 ספירת קרינה) -הם הם מתוך סולם ועלול להכניס שגיאות כימות.

9. עיבוד תמונה וניתוח נתונים

  1. השתמש בתוכנות מסחריות לניתוח תמונה וכימות; התוכנה מספקת מדידות של עוצמת הקרינה (FI; חציון או ממוצע של כל הפיקסלים מנקודה אחת) עבור דוארנקודת אח של microarray כולו. הפחת את הרקע המקומי סביב הכתמים: FI = נקודת FI - רקע מקומי FI.
  2. שמור את הנתונים FI ולפתוח אותם באמצעות תוכנת גיליונות אלקטרוניים.
  3. השתמש הערכים שהתקבלו עבור מערכים ריקים כמו שליטה שלילית לזהות ולסלק את תוצאות חיוביות שגויות. החל את המשוואה הבאה כדי לחשב את FI עבור כל נקודת נוגדן: FI = (מדגם FI - FI ריק), שבו מדגם FI = נקודת FI - FI רקע מקומי microarrays לרוץ עם תמציות מדגם FI ריק = נקודת FI - רקע FI המקומי ב microarrays ריק.
  4. החלת סף חתוך נוסף של 2 עד פי 3 מהממוצע של FI של microarray כולו כדי למזער את ההסתברות של תוצאות חיוביות שגוי; זה רלוונטי במיוחד כאשר מדובר בתמונות microarray באיכות ירודה יחסי אות לרעש נמוכים.
  5. צור מגרשים ו / או לבצע ניתוח נוסף לפי הצורך.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו מתארת מבחן immunoassay זמנית לצורך זיהוי סימולטני של מינים כחוליות מים מתוקים הרלוונטי ביותר (טבלה 1) באמצעות microarray נוגדן CYANOCHIP. על microarray יכול להיות בפורמט microarray 3 x 8 מודפס על גבי שקופיות מיקרוסקופ. microarray כל מורכב סט של 17 נוגדנים מודפסים בדפוס נקודה בשלושה עותקים, הנוגדנים מראש החיסוניים המקבילים שלהם BSA שולט שלילי. Microarrays כולל גם מסגרת ניאון, באמצעות נוגדן מראש חיסוני שכותרתו fluorescently ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הנה, immunoassay כריך זמנית פלורסנט באמצעות CYANOCHIP, microarray 17-נוגדן לאיתור וזיהוי של מגוון רחב של סוגים כחוליות, מתואר 22. כחוליות אלה מייצגים את סוגי benthic ו planktonic השכיחים ביותר בבתי גידול של מים מתוקים, חלקם מפיקים רעלן להיות. לאחרונה, בפורמט immunoassay כריך ניאון נעשה שימוש כדי לזהות מיקרואורגניזמים ו / או bioanalytes ביישומים הסביבה 26, 27, 28...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לד"ר אנטוניו Quesada מן מדריד Universidad de האוטונומית למתן זנים כחוליות. עבודה זו מומנה על ידי Investigación Subdirección הגנרל דה Proyectos דה של הספרדים Ministerio דה Economía y Competitividad (MINECO), אינה מעניקה. AYA2011-24803 ו ESP2014-58494-R.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מסננים בקוטר נקבוביות 0.22 מ"מMilliporeGSWP04700להכנת אימונוגנים
Eppendorf  5424R מיקרוצנטריפוגהפישר סיינטיפיקלהכנת אימונוגנים
מאגר פוספט מלח (PBS) pH 7.4 (10x)Thermo Fisher Scientific7001103650 מ"מ אשלגן פוספט, 150 מ"מ NaCl, pH 7.4
מעבד אולטרסאונד UP50HHielscherלהכנת אימונוגנים
השלם את האדג'ובנט של פרוינד סיגמא-אולדריץ'F5881אימונופוטנציאטור
לא שלם האדג'ובנט של פרוידסיגמא-אולדריץ' F5506לזריקות בוסט
ערכת טיהור נוגדנים חלבון A   סיגמא-אולדריץ'PURE1A לבידוד IgG
התקני סינון צנטריפוגליים MWCO< 100 kDaMilliporeUFC510096-96Kלבידוד צינורות
דיאליזה IgG, benzoylatedSigma-AldrichD7884-10FTלבידוד עמודות IgG
Illustra Microspin G-50 GE-HealthCareGE27-5330-02לבידוד של
מגיב IgG ברדפורדSigma-AldrichB6916-500 מ"ללכימות ריכוז הנוגדנים
ערכת בדיקת חלבון MicroBCA Thermo Scientific23235כדי לכמת את ריכוז הנוגדנים
מאגר מערך חלבונים 2xWhatman (Sigma Aldrich) S00537מאגר הדפסה; 30 - 40% גליצרול ב-1x PBS עם 0.01% Tween
20 20 סיגמא-אולדריץ' P9416חומר ניקוי לא יוני
אלבומין סרום בקר (BSA)Sigma-Aldrich A9418בקרה  להדפסה; מגיב חוסם
384-wells microplateGenetixX6004להדפסת נוגדנים
מערך רובוט לשקופיותמרובות MicroGrid II TAS מערך מבית Digilabלהדפסת נוגדנים
שקופיות זכוכית מצע אפוקסיArrayit corporationVEPO25Cתמיכה מוצקה להדפסת נוגדנים
Alexa Fluor-647 סוקסינימידיל-אסטר בדיקות מולקולריותA20006פלואורוכרום
DMSO סיגמא-אולדריץ' D8418פלואורוכרום ממיס
היידולף טיטרמקס שייקר פלטפורמת רטטפישר סיינטיפיקלתיוג נוגדנים 
עמודות Illustra Microspin G-50 בריאות27-5330-01לטיהור נוגדנים מסומנים
חותם בטוח חום 0.5 מ"ל צינורותSarstedt72,704,001לאחסון נוגדנים מסומנים 
ספקטרופוטומטר Nanodrop 1000Thermo Scientificלכימות ריכוז הנוגדנים ויעילות התיוג
3 ומיקרו; m גודל נקבוביות פוליקרבונט 47 מ"מ מסנןMilliporeTMTP04700לריכוז תאים
1 M תמיסת טריזמה הידרוכלוריד pH 8סיגמא-אולדריץ' T3038להכנת TBSTRR; לחסימת שקופיות
נתרן כלוריסיגמא-אולדריץ' S7653להכנת TBSTRR
20 ומיקרו; מסנני ניילון M MilliporeNY2004700להכנת תמצית סביבתית
10 - 12 מ"מ מחזיקי מסנניםMilliporeSX0001300להכנת תמצית סביבתית
קוקטייל מעכב פרוטאזSigma-Aldrich P8340לאחסון תמציות סביבתיות
1 M תמיסת טריזמה הידרוכלוריד pH 9סיגמא-אולדריץ' T2819לחסימת שקופיות
Heidolph Duomax 1030 שייקר פלטפורמת נדנדהVWRלחסימת שקופיות; לתהליכי דגירה 
VWR גלקסי מיני-מערך מיקרוצנטריפוגהVWRC1403-VWRלייבוש שקופיות
קלטת היברידיזציה מיקרו-מערך Multi-Wellתאגיד ArrayitAHC1X24קלטת ל-24 בדיקות לכל שקופית
GenePix 4100A סורק מיקרו-מערך מולקולרייםלפלואורסצנטיות
GenePix Pro Softwareתוכנה למכשיריםלניתוח וכימות תמונה
סורק מכשירים מולקולריים

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Simis, S. G. H., Peters, S. W. M., Gons, H. J. Remote sensing of the cyanobacterial pigment phycocianin in turbid inland water. Limnol. Oceanogr. 50 (1), 237-245 (2005).
  2. Zamyadi, A., McQuaid, N., Prevost, M., Dorner, S. Monitoring of potentially toxic cyanobacteria using an online multi-probe in drinking water sources. J. Environ. Monit. 14, 579-588 (2012).
  3. Msagati, T. A. M., Siame, B. A., Shushu, D. D. Evaluation of methods for the isolation, detection and quantification of cyanobacterial hepatotoxins. Aquat. Toxicol. 78 (4), 382-397 (2006).
  4. Weller, M. G. Immunoassays and biosensors for the detection of cyanobacterial toxins in water. Sensors. 13 (11), 15085-15112 (2013).
  5. Baker, J. A., Neilan, B. A., Entsch, B., McKay, D. B. Identification of cyanobacteria and their toxigenicity in environmental samples by rapid molecular analysis. Environ. Toxicol. 16 (6), 472-482 (2001).
  6. Li, H., Singh, A. K., McIntyre, L. M., Sherman, L. A. Differential gene expression in response to hydrogen peroxide and the putative PerR regulon of Synechocystis sp. Strain PCC 6803. J. Bacteriol. 186 (11), 3331-3345 (2004).
  7. Anderson, D. M., Cembella, A. D., Hallegraeff, G. M. Progress in understanding harmful algal blooms: paradigm shifts and new technologies for research, monitoring, and management. Ann. Rev. Mar. Sci. 4, 143-176 (2012).
  8. Dittami, S. M., Pazos, Y., Laspra, M., Medlin, L. K. Microarray testing for the presence of toxic algae monitoring programme in Galicia (NW Spain). Environ. Sci. Pollut. Res. Int. 20, 6778-6793 (2013).
  9. Kegel, J. U., Del Amo,, Medlin, Y., K, L. Introduction to Project MIDTAL: its methods and samples from Arcachon Bay, France. Environ. Sci. Pollut. Res. Int. 20 (10), 6690-6704 (2013).
  10. Marcheggiani, S., et al. Detection of emerging and re-emerging pathogens in surface waters close to an urban area. Int. J. Environ. Res. Public Health. 12 (5), 5505-5527 (2015).
  11. Fernández-Calvo, P., Näke, C., Rivas, L. A., García-Villadangos, M., Gómez-Elvira, J., Parro, V. A multi-array competitive immunoassay for the detection of broad-range molecular size organic compounds relevant for astrobiology. Planet. Space Sci. 54 (815), 1612-1621 (2006).
  12. Parro, V. Antibody microarrays for environmental monitoring. Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg, Germany. 2699-2710 (2010).
  13. Fan, Z., Keum, Y. S., Li, Q. X., Shelver, W. L., Guo, L. H. Sensitive immunoassay detection of multiple environmental chemicals on protein microarrays using DNA/dye conjugate as a fluorescent label. J. Environ. Monit. 14 (5), 1345-1352 (2012).
  14. Rivas, L. A., García-Villadangos, M., Moreno-Paz, M., Patricia Cruz-Gil, P., Gómez-Elvira, J., Parro, V. A 200-Antibody microarray biochip for environmental monitoring: Searching for universal microbial biomarkers through immunoprofiling. Anal. Chem. 80 (21), 7970-7979 (2008).
  15. Delehanty, J. B., Ligler, F. S. A microarray immunoassay for simultaneous detection of proteins and bacteria. Anal. Chem. 74 (21), 5681-5687 (2002).
  16. Ligler, F. S., Taitt, C. R., Shriver-Lake, L. C., Sapsford, K. E., Shubin, Y., Golden, J. P. Array biosensor for detection of toxins. Anal. Bioanal. Chem. 377 (3), 469-477 (2003).
  17. Rucker, V. C., Havenstrite, K. L., Herr, A. E. Antibody microarrays for native toxin detection. Anal. Biochem. 339 (2), 262-270 (2005).
  18. Kang, J., Kim, S., Kwon, Y. Antibody-based biosensors for environmental monitoring. Toxicol. Environ. Health. Sci. 1 (3), 145-150 (2009).
  19. Herranz, S., Marazuela, M. D., Moreno-Bondi, M. C. Automated portable array biosensor for multisample microcystin analysis in freshwater samples. Biosens. Bioelectron. 33 (1), 50-55 (2012).
  20. Shlyapnikov, Y., et al. Rapid simultaneous ultrasensitive immunodetection of five bacterial toxins. Anal. Chem. 84 (13), 5596-5603 (2012).
  21. Szkola, A., et al. Rapid and simultaneous detection of ricin, staphylococcal enterotoxin B and saxitoxin by chemiluminescence-based microarray immunoassay. Analyst. 139, 5885-5892 (2014).
  22. Blanco, Y., Quesada, A., Gallardo-Carreño, I., Jacobo Aguirre,, Parro, J., V, CYANOCHIP: An antibody microarray for high-taxonomical-resolution cyanobacterial monitoring. Environ. Sci. Technol. 49 (3), 1611-1620 (2015).
  23. Bradford, M. M. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Anal. Chem. 72, 248-254 (1976).
  24. Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193 (1), 265-275 (1951).
  25. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using Bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
  26. Rivas, L. A., Aguirre, J., Blanco, Y., González-Toril, E., Parro, V. Graph-based deconvolution analysis of multiplex sandwich microarray immunoassays: applications for environmental monitoring. Environ. Microbiol. 13 (6), 1421-1432 (2011).
  27. Blanco, Y., et al. Deciphering the prokaryotic community and metabolisms in south african deep-mine biofilms through antibody microarrays and graph theory. PloS One. 9 (2), e114180(2014).
  28. Gas, F., Baus, B., Queré, J., Chapelle, A., Dreanno, C. Rapid detection and quantification of the marine toxic algae, Alexandrium minutum, using a super-paramagnetic immunochromatographic strip test. Talanta. 147, 581-589 (2016).
  29. Parro, V., et al. SOLID3: a multiplex antibody microarray-based optical sensor instrument for in situ life detection in planetary exploration. Astrobiology. 11, 15-28 (2011).
  30. McKay, C. P., et al. The Icebreaker Life Mission to Mars: a search for biomolecular evidence for life. Astrobiology. 13, 334-353 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Cyanobacteria DetectionAntibody Microarray ChipFluorescent Sandwich ImmunoassayCyanobacterial Strain IdentificationLiquid Sample FiltrationSolid Sample HomogenizationHandheld UltrasonicatorPortable Fluorescence DetectorMultiplex Immunoassay ProtocolEnvironmental Monitoring

מאמרים קשורים